موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدة • 2:38 دقيقة • November 28th, 2025
ابدأ بوضع كوفيت في مطياف فلورية مزود بحامل كوفيت ومحرك للتحكم في الحرارة.
أضف المخزن المسخن مسبقا عند درجة حموضة معتدلة وضبط درجة حرارة الحامل لمحاكاة ظروف الإجهاد.
في عينة الاختبار، أضف شابرون واقي للحمض مشتق من الإشريكية القولونية.
في عينة التحكم، أضف حجم متساو من المخزن المؤقت.
بعد ذلك، أدخل بروتين ركيزة حساس للحرارة والحمض في كلا العينتين.
ابدأ بمراقبة تشتت الضوء.
حضن العينات تحت ظروف الإجهاد لتحفيز انكسار الركيزة.
عند درجة حموضة معتدلة، يصبح الشبيرون نشطا ويثبت البروتين غير المطوي.
أضف محلول ملح معادل الرقم الهيدروجيني واستمر في تسجيل تشتت الضوء.
في عينة التحكم، يؤدي عودته إلى الرقم الهيدروجيني المحايد إلى تجمع البروتين غير المطوي، مما يزيد من تشتت الضوء.
في عينة الاختبار، يعزز المرافق إعادة طي الركيزة، مما يقلل من تشتت الضوء مقارنة بالضابطة.
قارن إشارات تشتت الضوء لتقييم نشاط المرافقة.
ضع كوفيت كوارتز بسعة ملليلتر واحد في مطياف فوتومتر فلوري مزود بحوامل عينات ومحركات تحكم في درجة الحرارة.
اضبط طول موجة الإثارة والانبعاث إلى 350 نانومتر. أضف الحجم المناسب من المخزن D المسخن مسبقا عند قيم pH المطلوبة إلى الكوفيت. الحجم الكلي هو 1000 ميكرولتر.
اضبط درجة الحرارة في حامل الكوفيت إلى 43 درجة مئوية. أضف 12.5 ميكرومولار HdeB إلى المخزن المؤقت، يليه إضافة 0.5 ميكرومولار MDH. ابدأ بمراقبة تشتت الضوء.
احتضن التفاعل لمدة 360 ثانية للسماح بفتح كمية كافية من MDH. ارفع الرقم الهيدروجيني إلى سبعة بإضافة حجم 0.16 إلى 0.34 من فوسفات ثنائي البوتاسيوم غير مخزن بمقدار ضربين واستمر في تسجيل تشتت الضوء لمدة 440 ثانية أخرى. حلل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص.