الكشف عن تعبير الإنزيم المستهدف في الخلايا البكتيرية المعدلة وراثيا
موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدة • 3:01 دقيقة • November 28th, 2025
ابدأ بأنابيب تحتوي على خلايا بكتيرية معدلة وراثيا. كل بكتيريا تحمل فوسميدات عالية النسخ، ترمز إنزيمات مختلفة.
حضن الأنابيب مع الاهتزاز لتسهيل التعبير عن إنزيمات داخل الخلية المختلفة.
أضف ركيزة خاصة بالإنزيم المستهدف إلى أنبوب الاختبار وأضف كمية متساوية من المخزن إلى أنبوب التحكم.
حضن مع الرج. تدخل الركيزة إلى الخلايا، حيث تشقها الإنزيمات المستهدفة، مولدة منتجا فلوريا.
قم بتحميل أنبوب التحكم في مقياس تدفق معاير مسبقا.
عندما تمر كل خلية عبر شعاع ليزر، فتشتت الضوء. أنشئ مخطط تشتت لتحديد الخلايا المفردة التي تشتت ضوءا أقل من الكتل.
استبعد تجمعات الخلايا، ورسم إشارة التألق للخلايا المفردة لتحديد التألق الأساسي.
ضع الأنبوب المعالج بالركيزة في مقياس تدفق الخلايا لقياس إشارة الفلورة.
تؤكد زيادة إشارة التألق في الخلايا المعالجة بالركيزة مقارنة بالخلايا الضابطة تعبير الإنزيم المستهدف.
لفحص الإنزيمات الميتاجينومية المعنية، حضن الخلايا المفترزة عند 37 درجة مئوية و200 دورة في الدقيقة حتى يصل OD600 إلى 0.5. ثم أضف 1 ميكرولتر من محلول تحفيز النسخ لتضخيم عدد النسخ الحثيري داخل الخلية.
بعد ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية و250 دورة في الدقيقة، يتم دمج 0.5 ملليلتر من الخلايا مع الركيزة المناسبة في أنبوب دائري قاع بسعة 14 مليليتر إلى تركيز نهائي 100 ميكرومولر. ثم حضن عينات التحكم والتجارب عند 37 درجة مئوية و200 دو
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية