بروتوكول لقاحات مرض السارس المؤتلف RBD المستندة : إعداد البروتين ، والكشف عن تطعيم الحيوانات تحييد

في هذا الإجراء، يتم تحضير لقاح مؤتلف يعبر عن بروتين RBD الخاص بفيروس SARS COV، ثم يتم تقييم قدرته على تحفيز نشاط تحييدي ضد فيروس SARS زائف. أولاً، يتم التعبير عن بروتين RBD وتنقيته من السائل الطافي لمستنبت خلايا 2 9 3 T المنقولة. ثم يُستخدم البروتين المنقى لإجراء التحصين.

يتم جمع الفئران والأمصال من الفئران الملقحة في نقاط زمنية مختلفة بعد التحصين لقياس قدرة التحييد في الأمصال المناعية. يُجرى اختبار تحييد الفيروس الكاذب، حيث يتم إنتاج فيروس sars كاذب مأشوب يعبر عن اللوسيفيريز ويتم تحضينه مع مصل الفئران المخفف. بعد ذلك، يتم تقييم قدرة هذه الفيروسات المحيدة على إصابة الخلايا التي تعبر عن مستقبل ACE المساعد لـ SARS عن طريق قياس نشاط اللوسيفيريز النسبي في الخلايا المصابة.

يمكن بعد ذلك حساب عيار الأجسام المضادة المُحيدة بنسبة 50%. اسمي tu، وأعمل حالياً في المختبر.

تتمثل الميزة الرئيسية لمقايسة تحييد الفيروسات الكاذبة مقارنةً بالتقنيات الحالية، مثل مقايسات التحييد القائمة على الفيروسات الحية، في أن هذه التقنية آمنة نسبيًا، حيث لا تتطلب فيروس SARS مُعديًا ويمكن إجراؤها في مختبر لا يصنف ضمن المستوى الثالث من السلامة البيولوجية. ستقوم بتقديم هذا الإجراء "لينغ ديو"، وهي زميلة أبحاث في مختبري تركز على تطوير لقاحات ضد الأمراض المعدية الناشئة مثل SARS والإنفلونزا. قم بإذابة حصص من محلول HBS المنظم المعقم بتركيز 2X وpH 7، وكلوريد الكالسيوم بتركيز 2.5 molar، وبلازميد RBD في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد إذابة المحاليل، انقل 2 mL من محلول 2 XHBS إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL، وفي أنبوب سعة 15 mL امزج 200 µL من كلوريد الكالسيوم مع 40 µg من بلازميد RBD. اضبط الحجم ليصل إلى 2 mL باستخدام ماء مقطر معقم بدرجة حرارة الغرفة بواسطة ماصة معقمة سعة 5 mL. أضف محلول البلازميد إلى محلول 2 XHBS على شكل قطرات مع الاستمرار في مزج الخليط باستخدام جهاز رج (vortex) بسرعة ثابتة ومنخفضة.

من الضروري الحفاظ على هذا الدوران بشكل بطيء ومستمر للحصول على راسب بقوام مناسب لضمان كفاءة ترانسفكشن عالية. يُحفظ المزيج لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد هذه الحضنة، يُضاف المزيج قطرة تلو الأخرى إلى دورق يحتوي على خلايا 2 9 3 T بنسبة تلاقي تتراوح بين 50 إلى 70%.

في حجم قدره 40 milliliters من وسط استزراع الخلايا، من المهم توزيع محلول عفن الخلايا (transfection solution) بشكل متساوٍ. اخلط الوسط فور إضافة مزيج عفن الخلايا. ضع الخلايا عند درجة حرارة 37 °C في حاضنة تحتوي على 5% carbon dioxide.

بعد تحضين الخلايا لمدة تتراوح من 8 إلى 10 ساعات، قم بإزالة وسط الخلايا الكامل واستبدله بـ 50 milliliters من وسط optimum الجديد الخالي من المصل، وذلك لتجنب أي تداخل للمصل في عملية تنقية البروتين اللاحقة، ثم أعد الخلايا إلى المحضن عند درجة حرارة 37 degree Celsius. وبعد مرور يومين، اجمع الراشح الذي سيحتوي على بروتين RBD المُعَبَّر عنه، ثم قم بإجراء عملية الطرد المركزي لمدة 15 minutes بسرعة 6,000 RPM لإزالة بقايا الخلايا. وبمجرد تجميع الخلايا في كريّة، انقل الراشح إلى أنبوب جديد وأضف مزيج مثبطات البروتياز.

لمنع تحلل البروتين، استخدم أعمدة nickel NTA super flow وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لتنقية بروتين RBD المؤتلف من الطافي الذي تم جمعه. قم باستخلاص بروتين RBD باستخدام محلول منظم يحتوي على 250 millimolar ole. بعد ذلك، وباستخدام أنابيب Emon Ultra 15، قم بتركيز البروتين المُنقى المحتوي على OLE عن طريق الطرد المركزي بسرعة 3000 RPM عند درجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة 15 دقيقة تقريباً. ثم تخلص من السائل المار.

أضف PBS إلى أنابيب تركيز RBD وقم بالطرد المركزي مرة أخرى بسرعة 3000 RPM عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. كرر عملية الغسل مرتين. لضمان الإزالة الكاملة للشوائب، سيتم الآن إذابة البروتين المنقى في PBS؛ انقل البروتين باستخدام الماصة إلى أنبوب EPR نظيف سعة 1.5 Milliliter.

أخيراً، احسب تركيز البروتين المنقى باستخدام جهاز NanoDrop مع استخدام PBS كمحلول تصفير (blank)، ثم خزن العينة عند درجة حرارة -80 °C. أولاً، أضف 1 mL من PBS المعقم إلى قارورة واحدة من نظام Sigma adjuvant. قم بتدفئة القارورة مسبقاً في حمام مائي عند درجة حرارة 40 إلى 45 °C، ثم قم برج القارورة جيداً باستخدام جهاز vortex لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

بعد ذلك، قم بتحضير مستحلب البروتين المساعد في أنبوب إينور سعة 1.5 ملليلتر. اخلط الكمية المطلوبة من البروتين المُنقّى المذاب والمخفف في PBS مع حجم مساوٍ من النظام المساعد، ثم قم برج الخليط باستخدام جهاز الفورتيكس بقوة لمدة تتراوح بين دقيقتين إلى ثلاث دقائق. كما يتم تحضير مستحلبات ضابطة عن طريق خلط المادة المساعدة مع PBS وحده. يتم الحقن تحت الجلد.

يتم حقن خمسة من فئران BC على الأقل، تتراوح أعمارها بين أربعة إلى ستة أسابيع، بـ 200 microliters من خليط التحصين الأولي الذي يحتوي على 20 micrograms من البروتين لكل جرعة، أو بمستحلب تحكم، وذلك تحت الجلد بعد 21 يوماً من التلقيح الأولي. ثم تُحقن جرعات معززة تحتوي على 10 micrograms من البروتين في حجم نهائي قدره 200 microliters لكل منها. وتُجمع عينات الدم من كل فأر قبل التحصين الأولي وبعد 10 أيام من كل تطعيم، ويُخزن المصل المعزول عند minus 20 degrees Celsius بعد التسخين.

تعطيل المتممة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل 16 ساعة من عملية transfection. يتم زرع خلايا 293T في أطباق زراعة أنسجة قطرها 100 مليمتر بكثافة 2 مليون خلية لكل طبق. يتم تحضير كاشف transfection كما هو موضح سابقاً، وإجراء transfection مشترك للخلايا باستخدام بلازميد يشفر بروتين S الخاص بـ SARS-CoV وبلازميد آخر يشفر جينوم HIV-1 الذي يعبر عن لوسيفيراز معطل لبروتين ENV. بعد مرور 8 إلى 10 ساعات من عملية transfection.

استبدل الوسط بـ 10 milliliters من وسط DMEM الطازج الذي يحتوي على 10% مصل، ثم أعد الخلايا إلى الحاضنة. بعد يومين، اجمع السائل الطافي الذي يحتوي على الفيروس الكاذب لـ SARS. قم بتمرير السائل الطافي عبر مرشح حقنة بمسامية 0.45 micron لإزالة حطام الخلايا وتجزئة الفيروس.

استخدم المحلول فوراً أو قم بتجميده عند درجة حرارة -80 °C لاستخدامه مستقبلاً باستخدام صفيحة ماصة متعددة القنوات. ضع خلايا 2 9 3 T التي تعبر عن مستقبل SARS COV المعروف بـ ACE two في صفيحة زراعة أنسجة ذات 96 بئراً بتركيز 10,000 خلية لكل 100 µL في البئر الواحد، ثم حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 °C لمدة 16 ساعة. استخدم صفيحة منفصلة ذات 96 بئراً لمعايرة الفيروس الكاذب لـ SARS المعبر عن لوسيفيراز مأشوب، ولتحديد تركيز الفيروس المناسب لاختبار التحييد في الصفين A و B من الصفيحة الأولى.

150 µL لكل بئر من 10% F-B-S-D-M-E-M. بعد ذلك، أضف 150 µL من الفيروس غير المخفف إلى الصفين A1 وB1، ثم قم بإجراء تخفيف تسلسلي مضاعف مكرر عن طريق نقل 150 µL من آبار الصف الأول إلى آبار الصف التالي، وهكذا حتى الصف 11. تخلص من الـ 150 µL الأخيرة ولا تضف الفيروس إلى الصف 12.

بمجرد الانتهاء من عملية التخفيف المتسلسل وتحضين خلايا ACE 2 93 T لمدة 16 ساعة، قم بإصابة الخلايا عن طريق نقل 100 µL من كل بئر في طبق الفيروس إلى البئر المقابل في الطبق الذي يحتوي على الخلايا. حضن الخلايا لمدة يومين عند 37 °C للسماح للفيروسات بإصابة الخلايا. حدد مستوى الإصابة في كل بئر عن طريق قراءة الطبق في جهاز قياس اللمعان ultra 3 84 luminometer.

تتناسب كمية العدوى طردياً مع شدة نشاط لوسيفيراز. سيتم استخدام تركيز الفيروس الذي تكون عنده وحدة لوسيفيراز النسبية أكبر بنحو ألف مرة من وحدة RLU الخلفية للخلايا وحدها في العمود 12 في مقايسة التعادل. قم بإعداد التعادل في طبق منفصل مكون من 96 بئراً أولاً باستخدام ماصة متعددة القنوات، بوضع 150 µL من 10%F-B-S-D-M-E-M في آبار العمود الأول و120 µL في آبار الأعمدة الأخرى.

بعد ذلك، أضف 3 µL من كل مصل فأر مراد اختباره إلى آبار مكررة في العمود الأول. في هذا المثال، تحتوي أول بئرين على مصل مخفف بمقدار 50 ضعفاً من فأر محصن بـ RBD. وتحتوي البئران التاليتان على مصل من فأر ثانٍ محصن بـ RBD، بينما تحتوي الآبار الأربعة الأخيرة على مصل من حيوانين ضابطين محصنين بـ PBS. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإجراء تخفيف تسلسلي للمصل بمقدار خمسة أضعاف عن طريق نقل 30 µL من جميع الآبار في العمود الأول إلى آبار العمود الثاني، وتكرار هذه العملية حتى العمود 11.

تخلص من الـ 30 µL المتبقية واترك الآبار في العمود 12 بدون مصل. بعد ذلك، أضف 120 µL من فيروس SARS الزائف المخفف إلى كل بئر. حضن اللوحة عند 37 °C لمدة ساعة واحدة للسماح لأي أجسام مضادة لـ RBD في مصل الفأر بالارتباط بفيروس SARS الزائف وتحييده.

بعد هذه الحضانة، انقل 100 µL من الفيروس المُعادل من كل بئر إلى الآبار المقابلة في طبق ذو 96 بئراً يحتوي على خلايا 2 9 3 T التي تعبر عن ACE2. حضن الخلايا عند 37 °C لمدة 24 ساعة للسماح بالعدوى، وبمجرد إصابة الخلايا بالعدوى، قم بإزالة السائل باستخدام ماصة متعددة القنوات واستبدله بـ 100 µL من الوسط الغذائي الطازج لكل بئر.

أعد الطبق إلى الحاضنة لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية. ومرة أخرى، قم بإزالة السائل الطافي. في هذه المرحلة، يجب أن تكون أي فيروسات كاذبة لم يتم تحييدها بواسطة مصل الفأر قادرة على إصابة الخلايا. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 60 µL لكل بئر من كاشف تحلل الخلايا الخاص باللوسيفيريز.

ضع الطبق على هزاز في درجة حرارة الغرفة واترك الخلايا تتحلل لمدة تتراوح بين ساعة وساعتين. بمجرد تحلل الخلايا، انقل 50 µL من نواتج تحلل الخلايا إلى طبق مقياس لومينومتر يحتوي على 96 بئراً، وأضف 50 µL من ركيزة لوسيفيراز لكل بئر. استخدم جهاز لومينومتر ultra 3 84 مضبوطاً على وضع قياس التألق الحيوي (luminescence) في أطباق 96 بئراً لقراءة الطبق وتقدير نشاط لوسيفيراز النسبي في الآبار المختلفة، والتي يمكن من خلالها اشتقاق النسبة المئوية للفيروس المُحيّد.

تظهر هذه البيانات أن نسبة تحييد الفيروس التي تم تحقيقها تتناسب طردياً مع تركيز المصل المأخوذ من الفئران المحصنة بـ RBD. وفي المقابل، فشل المصل المأخوذ من الحيوانات التي حُقنت بـ PBS في تحييد الفيروس عند أي تركيز وفقاً لهذه البيانات. ويمكن اشتقاق NT 50 أو عيار المصل الذي يتم عنده تحييد 50% من الفيروس بسهولة.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الثقة والصبر أمران أساسيان لنجاح التجارب. بعد مشاهدة هذه الفيديوهات، يجب أن يكون لديك فهم أفضل لكيفية التعبير عن لقاح SARS المؤتلف في مزارع الخلايا الثديية، وتحديد القدرة على تحفيز استجابة الأجسام المضادة المُحيّدة في نماذج الفئران.