بروتوكول لقاحات مرض السارس المؤتلف RBD المستندة : إعداد البروتين ، والكشف عن تطعيم الحيوانات تحييد

في هذا الإجراء، يتم تحضير لقاح مأشوب يعبر عن بروتين RBD لفيروس SARS COV، ثم يتم تقييم قدرته على تحفيز نشاط معادِل ضد فيروس SARS زائف. أولاً، يتم التعبير عن بروتين RBD وتنقيته من السائل الطافي لمزارع خلايا 2 9 3 T المنقولة. بعد ذلك، يُستخدم البروتين المنقى في عملية التحصين.

يتم جمع الفئران والأمصال من الفئران الملقحة في نقاط زمنية مختلفة بعد التحصين لتقدير قدرة الأمصال المناعية على التحييد. يُجرى اختبار تحييد الفيروسات الكاذبة، حيث يتم إنتاج فيروس sars كاذب مؤتلف يعبر عن لوسيفيراز ويُحضن مع أمصال فئران معيرة. بعد ذلك، يتم تقييم قدرة هذه الفيروسات المُحيّدة على إصابة الخلايا التي تعبر عن ACE، وهو المستقبل المشترك لـ SARS، وذلك عن طريق قياس نشاط اللوسيفيراز النسبي في الخلايا المصابة.

يمكن بعد ذلك حساب عيار الأجسام المضادة المعادلة بنسبة 50%. اسمي تو. وأنا حالياً باحث ما بعد الدكتوراه في المختبر.

تتمثل الميزة الرئيسية لمقايسة تحييد الفيروسات الكاذبة مقارنة بالتقنيات الحالية، مثل مقايسات التحييد القائمة على الفيروسات الحية، في أن هذه التقنية آمنة نسبيًا؛ حيث إنها لا تتطلب فيروس SARS معديًا ويمكن إجراؤها في مختبر لا يتبع مستوى السلامة الثالث (BSL-3). اسمي هو [اسم المذيع]، وسيقوم بتوضيح الإجراء "لايينغ دو"، وهو زميل بحث ما بعد الدكتوراه في مختبري، يركز على تطوير لقاحات ضد الأمراض المعدية الناشئة مثل SARS والإنفلونزا. قم بإذابة الأجزاء الموزعة من محلول HBS العازل المعقم بتركيز 2X وpH 7، وكلوريد الكالسيوم بتركيز 2.5 molar، وبلازميد RBD في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد إذابة المحاليل، انقل 2 mL من محلول 2X HBS إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL، وفي أنبوب سعة 15 mL، اخلط 200 µL من كلوريد الكالسيوم مع 40 µg من بلازميد RBD. اضبط الحجم ليصل إلى 2 mL باستخدام ماء مقطر معقم بدرجة حرارة الغرفة وباستخدام ماصة معقمة سعة 5 mL. أضف محلول البلازميد إلى محلول 2X HBS بشكل تدريجي (قطرة بقطرة) مع الحفاظ على المزيج تحت عملية رج دوامي (vortex) مستمرة ولكن لطيفة.

يعد الحفاظ على هذا الدوران ببطء واستمرارية أمراً بالغ الأهمية للحصول على راسب ذي قوام مناسب لضمان كفاءة عفن عالية. يُحفظ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد هذه الحضانة، يُضاف المزيج قطرة تلو الأخرى إلى دورق يحتوي على خلايا 2 9 3 T بنسبة تلاقي تتراوح من 50 إلى 70%.

في حجم قدره 40 milliliters من وسط زراعة الخلايا، من المهم توزيع محلول عفن الخلايا (transfection solution) بشكل متساوٍ. اخلط الوسط مباشرة بعد إضافة مزيج عفن الخلايا. ضع الخلايا عند درجة حرارة 37 °C في حاضنة تحتوي على 5% carbon dioxide.

بعد فترة حضانة تتراوح بين 8 إلى 10 ساعات، يتم سحب الوسط الخلوي الكامل واستبداله بـ 50 milliliters من وسط optimum، one خالي من المصل وطازج، وذلك لتجنب أي تداخل للمصل في عملية تنقية البروتين اللاحقة، ثم تُعاد الخلايا إلى الحاضنة عند درجة حرارة 37 degree Celsius. وبعد مرور يومين، يتم جمع الرائق الذي سيحتوي على بروتين RBD المُعبّر عنه، ثم يُجرى الطرد المركزي لمدة 15 minutes بسرعة 6,000 RPM لإزالة الحطام الخلوي. وبمجرد تجميع الخلايا في كتلة راسبة، يُنقل الرائق إلى أنبوب جديد ويُضاف إليه مزيج مثبط البروتياز.

لمنع تحلل البروتين، استخدم عمود nickel NTA super flow وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة لتنقية البروتين المؤتلف RBD من السائل الطافي الذي تم جمعه. يتم استخلاص بروتين RBD باستخدام محلول منظم يحتوي على 250 millimolar ole. بعد ذلك، وباستخدام أنابيب Emon Ultra 15، قم بتركيز البروتين المُنقى الذي يحتوي على OLE عن طريق الطرد المركزي بسرعة 3000 RPM عند درجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة 15 دقيقة تقريباً. تخلص من السائل المتدفق.

أضف PBS إلى أنابيب تركيز RBD ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى بسرعة 3000 RPM عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. كرر عملية الغسل مرتين. ولضمان الإزالة الكاملة لـ ole، يتم الآن إذابة البروتين المنقى في PBS، ثم اسحب البروتين باستخدام الماصة إلى أنبوب EOR نظيف سعة 1.5 ملي لتر.

وأخيراً، قم بحساب تركيز البروتين المنقى باستخدام جهاز NanoDrop مع استخدام PBS كعينة فارغة (blank)، ثم خزن العينة عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. أولاً، أضف 1 mL من PBS المعقم إلى قارورة واحدة من نظام Sigma adjuvant. قم بتدفئة القارورة مسبقاً في حمام مائي عند درجة حرارة 40 إلى 45 درجة مئوية، ثم قم برج القارورة جيداً باستخدام جهاز vortex لمدة تتراوح بين دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

بعد ذلك، قم بتحضير مستحلب البروتين المساعد في أنبوبة einor سعة 1.5 مليلتر. امزج الكمية المطلوبة من البروتين المُنقى المذاب والمخفف في PBS مع حجم مساوٍ من النظام المساعد، ثم استخدم جهاز vortex بقوة لمدة تتراوح من دقيقتين إلى ثلاث دقائق. كما يتم تحضير مستحلبات ضابطة عن طريق خلط المساعد مع PBS وحده. بالحقن تحت الجلد.

قم بحقن خمسة على الأقل من فئران BC التي تتراوح أعمارها بين أربعة إلى ستة أسابيع بـ 200 µL من خليط التحصين الأولي الذي يحتوي على 20 µg من البروتين لكل جرعة، أو بمستحلب التحكم، وذلك تحت الجلد بعد 21 يوماً من التلقيح الأولي. احقن جرعات معززة تحتوي على 10 µg من البروتين في حجم نهائي قدره 200 µL لكل منها. اجمع عينات الدم من كل فأر قبل التحصين الأولي وبعد 10 أيام من كل عملية تطعيم، ثم قم بتخزين المصل المعزول عند درجة حرارة -20 °C بعد التسخين.

تعطيل المتمم عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل 16 ساعة من عملية عفن الخلايا؛ يتم استزراع خلايا 2 9 3 T في أطباق زراعة أنسجة قطرها 100 مليمتر بكثافة 2 مليون خلية لكل طبق. قم بتحضير كاشف عفن الخلايا كما تم وصفه سابقاً، وأجرِ عفناً مشتركاً للخلايا باستخدام بلازميد يشفر بروتين S لفيروس SARS cove وآخَر يشفر جينوم HIV one الذي يعبر عن لوسيفيريز معطل الـ ENV. ثماني إلى عشر ساعات بعد عملية عفن الخلايا.

استبدل الوسط بـ 10 milliliters من وسط DMEM الطازج الذي يحتوي على 10% serum ثم أعد الخلايا إلى الحاضنة. بعد يومين، احصد السائل الطافي الذي يحتوي على فيروس SARS pseudo. قم بتمرير السائل الطافي عبر مرشح حقنة بسعة 0.45 micron لإزالة بقايا الخلايا وتجزئة الفيروس.

استخدم المحلول فوراً أو جمدّه عند درجة حرارة -80 °C للاستخدام المستقبلي باستخدام صفيحة ماصة متعددة القنوات. ازرع خلايا 293T التي تعبر عن مستقبل SARS COV ACE2 في صفيحة زراعة أنسجة ذات 96 بئراً بتركيز 10,000 خلية لكل 100 µL لكل بئر، ثم قم بحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 °C لمدة 16 ساعة. استخدم صفيحة منفصلة ذات 96 بئراً لمعايرة الفيروس الكاذب لـ SARS الذي يعبر عن لوسيفيريز معاد التركيب، وتحديد تركيز الفيروس المناسب لمقايسة التعادل في الصفين A و B من الصفيحة الأولى.

أضف 150 µL لكل بئر من وسط 10%F-B-S-D-M-E-M. بعد ذلك، أضف 150 µL من الفيروس غير المخفف إلى الصفين A1 و B1، وقم بإجراء تخفيف تسلسلي مضاعف مكرر عن طريق نقل 150 µL من آبار الصف الأول إلى آبار الصف التالي، وهكذا دواليك وصولاً إلى الصف 11. تخلص من الـ 150 µL الأخيرة، ولا تضف أي فيروس إلى الصف 12.

بمجرد الانتهاء من إجراء التخفيف التسلسلي وتحضين خلايا ACE 2 93 T لمدة 16 ساعة، قم بإصابة الخلايا عن طريق نقل 100 µL من كل بئر في طبق الفيروس إلى البئر المقابل في الطبق الذي يحتوي على الخلايا. يتم تحضين الخلايا لمدة يومين عند 37 °C للسماح للفيروسات بإصابة الخلايا. حدد مستوى الإصابة في كل بئر من خلال قراءة الطبق باستخدام مقياس لومينومتر ultra 3 84.

تتناسب كمية العدوى طردياً مع شدة نشاط لوسيفيريز. سيتم استخدام تركيز الفيروس الذي تكون عنده وحدة لوسيفيريز النسبية أكبر بنحو ألف مرة من قيمة RLU الخلفية للخلايا وحدها في العمود 12 في مقايسة التحييد. ابدأ بإعداد التحييد في طبق منفصل مكون من 96 بئراً باستخدام ماصة متعددة القنوات، وذلك بإضافة 150 microliters من 10%F-B-S-D-M-E-M إلى آبار العمود الأول و120 microliters إلى الآبار في الأعمدة الأخرى.

بعد ذلك، أضف 3 µL من كل مصل فأر سيتم اختباره إلى آبار مكررة في العمود الأول. في هذا المثال، تحتوي البئران الأوليان على مصل مخفف بمقدار 50 ضعفاً من فأر محصن بـ RBD. وتحتوي البئران التاليتان على مصل من فأر ثانٍ محصن بـ RBD، بينما تحتوي الآبار الأربعة الأخيرة على مصل من حيوانين ضابطين محصنين بـ PBS. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإجراء تخفيف تسلسلي خماسي للمصل عن طريق نقل 30 µL من جميع آبار العمود الأول إلى آبار العمود الثاني، وتكرار هذه العملية حتى العمود 11.

تخلص من الـ 30 µL المتبقية واترك آبار العمود 12 بدون مصل. بعد ذلك، أضف 120 µL من فيروس SARS الزائف المخفف إلى كل بئر. قم بحضن اللوحة عند 37 °C لمدة ساعة واحدة للسماح لأي أجسام مضادة لـ RBD في مصل الفأر بالارتباط بفيروس SARS الزائف وتحييده.

بعد هذه الحضانة، انقل 100 µL من الفيروس المُعادل من كل بئر إلى الآبار المقابلة في طبق الـ 96 بئر الذي يحتوي على خلايا 2 9 3 T المعبرة عن ACE two. تُحضن الخلايا عند 37 °C لمدة 24 ساعة للسماح بالعدوى، وبمجرد إصابة الخلايا، قم بإزالة السائل باستخدام ماصة متعددة القنوات واستبدله بـ 100 µL من الوسط الغذائي الطازج لكل بئر.

أعد الطبق إلى الحاضنة بعد 72 ساعة عند 37 درجة مئوية. مرة أخرى، قم بإزالة السائل الطافي. في هذه المرحلة، يجب أن يكون أي فيروس كاذب لم يتم تحييده بواسطة مصل الفأر قادرًا على إصابة الخلايا باستخدام ماصة متعددة القنوات. أضف 60 µL لكل بئر من كاشف تحلل الخلايا لإنزيم اللوسيفيراز.

ضع الطبق على هزاز في درجة حرارة الغرفة واترك الخلايا لتتحلل لمدة ساعة إلى ساعتين. وبمجرد تحلل الخلايا، انقل 50 µL من نواتج تحلل الخلايا إلى طبق لومينوميتر مكون من 96 بئراً، وأضف 50 µL من ركيزة اللوسيفيراز لكل بئر. استخدم جهاز لومينوميتر ultra 3 84 مضبوطاً على وضع قياس التألق الحيوي في أطباق ذات 96 بئراً لقراءة الطبق وتقييم نشاط اللوسيفيراز النسبي في الآبار المختلفة، والتي يمكن من خلالها اشتقاق النسبة المئوية للفيروس الذي تم تحييده.

تظهر هذه البيانات أن نسبة تحييد الفيروس التي تم تحقيقها تتناسب طردياً مع تركيز المصل المأخوذ من الفئران التي تم تحصينها بـ RBD. وفي المقابل، فشل المصل المأخوذ من الحيوانات التي حُقنت بـ PBS في تحييد الفيروس عند أي تركيز بناءً على هذه البيانات. ويمكن استخلاص قيمة NT 50 أو عيار المصل الذي يتم عنده تحييد 50% من الفيروس بسهولة.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الثقة والصبر ضروريان لنجاح التجارب. بعد مشاهدة هذه الفيديوهات، يجب أن يتكون لديك فهم أفضل لكيفية التعبير عن لقاح SARS المؤتلف في مزارع الخلايا الثدية، ولتحديد القدرة على تحفيز استجابة الأجسام المضادة المُحيّدة في نماذج الفئران.