Name: الجمع بين صبغ محبة للدهون ، في الموقع التهجين ، المناعية ، والأنسجة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: تعلم دمج صبغة الدهون والتهجين الموضعي والمناعة والأنسجة لتحليل أنسجة الفئران. تتيح هذه الطريقة ربط الطفرات الوراثية بالتشوهات المورفولوجية ونمط التعبير الجيني والبروتيني.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم الحصول على الصور مبائر في جامعة ولاية ايوا كارفر مركز التصوير. وقدمت وقدمت التمويل عن طريق منح SBIR (MH079805) لدعم BF إضافية لتربية الفئران لهذا المشروع من قبل NIDCD (5R01DC00559007) لBF

<ol><li>Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+three-color+neuronal+tracing+in+fixed+tissue+using+NeuroVue+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes.</a> Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).</li>
<li>Tonniges, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-+and+bio-physical+characterization+of+novel+violet+and+near-infrared+lipophilic+fluorophores+for+neuronal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing.</a> Journal of Microscopy. , (2010).</li>
<li>Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+tracing+with+DiI%3A+decalcification%2C+cryosectioning%2C+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li>
<li>Gurung, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+embryonic+midbrain+thalamic+and+thalamic+auditory+connection+development+in+mice+as+revealed+by+carbocyannine+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection.</a> J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).</li>
<li>Fritzsch, B., Nichols, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+reveals+a+prenatal+arrival+of+efferents+at+the+differentiating+otocyst+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice.</a> Hear Res. 65, 51-60 (1993).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+suppresses+hair+cell+differentiation+in+ear+ganglia+and+regulates+hair+cell+subtype+development+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea.</a> PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).</li>
</ol>

وقد تم جمع الأنسجة الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها جامعة أيوا رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (ACURF 0804066).

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لدمج أربع تقنيات من أجل تحقيق أقصى قدر من التماسك وجمع البيانات عن طريق الربط بين البيانات داخل حيوان معين (الشكل 3). هذا النهج سوف تقلل من كمية تربية ، وبالتالي الوقت اللازم للحصول على بيانات للنشر وتحسين المعلومات حول توطين المشترك والآثار المترابطة من المسوخ. وعلى الرغم من واستخدمت الفئران الجنينية في هذه الفأرة والفيديو الكبار وكذلك الحيوانات الأخرى مثل الدجاج ، والضفدع ، والزرد يتم تحليلها باستخدام هذه التقنيات كذلك. عند استخدام أنواع أخرى قد بروتيناز ك الهضم تحتاج إلى تغييرها. هنا نستخدم الأصباغ المختلفة NeuroVue الاستشعاع لتسمية تحديدا ما يصل إلى ثلاثة من السكان العصبية الفائدة. الاستفادة من هذه الأصباغ هي التي يمكن استخدامها في فئرانا معدلة وراثيا ، والتي قد تكون مشكلة عند الاعتماد فقط على المناعية التي قد تكون أو لا تكون المتضررة من الطفرات التي سيتم تحليلها ، وأنها تسمية الخلايا العصبية وretrogradely anterogradely 5. وزاد أيضا دراسة حديثة أن عدد السكان الخلايا العصبية التي يمكن أن توصف في وقت واحد الى ستة 2. بعد ذلك ، ثم صباغة النسيج محبة للدهون تتبع نفس الفائدة يتم تحليلها باستخدام التهجين في الموقع ، لتحليل الجينات والاستنساخ ويمكن تحليلها في وقت لاحق باستخدام المناعية للتوزيع البروتين. ويمكن استكمال التحليل الأخير الأنسجة التفصيلية التي يمكن أن تضاف إلى توصيف النمط الظاهري 6. هذا التحليل متعدد العوامل لديه القدرة على اكتساب رؤى جديدة من خلال تحليل المتلازم ضمن نفس الحيوان التي يمكن أن يكون الأمر خلاف ذلك واردا ، أو على الأقل في حاجة إلى مزيد من البروتوكولات واسعة وخصبة الماوس.

<table><tbody><tr><td>&lt;مجهر إلكتروني&gt;في الموقع&lt;/em&gt; التهجين:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>طقم محاليل الغسل والحجب PC DIG</td><td>مجموعة روش</td><td>1585762</td><td></td></tr><tr><td>محلول SSC المنظم بتركيز 20x مُعد مسبقاً</td><td>مجموعة روش</td><td>1666681</td><td></td></tr><tr><td>بروتيناز ك 20 مجم/مل</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) </td><td>Research Products International Corp.</td><td>D43060</td><td></td></tr><tr><td>فورماميد</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات الديكستران</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D20020</td><td></td></tr><tr><td>بي إم بيربل (BM Purple) </td><td>مجموعة روش (Roche Group)</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>شظايا Fab المضادة لـ Dig-AP</td><td>مجموعة روش (Roche Group)</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>إنزيم RNase A بتركيز 10 ملجم/ملل</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Research Products International Corp.</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) من نطف السلمون بتركيز 10 مجم/مل</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>وحدة ترشيح Stericup 0.22&amp;mu;م؛ ٥٠٠ مل</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>أقراص ترشيح 0.2&amp;mu;م؛ 25 ملم</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>عبوات محلول ملحي منظم بالفوسفات بدرجة حموضة 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;مجهر إلكتروني (EM)&gt;الكيمياء النسيجية المناعية:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>مصل الماعز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>هـ&amp;#8211;صبغة chst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>9460</td><td></td></tr><tr><td>&lt;مجهر إلكتروني نافذ&gt;علم الأنسجة:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>طقم Poly/Bed 812 لوسائط التضمين/DMP-30 </td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>أكسيد البروبيلين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205</td><td></td></tr><tr><td>محلول جلوتارالدهيد 50%</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151</td><td></td></tr><tr><td>وسيط تثبيت DPX</td><td>Fluka</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>هزاز ميكانيكي</td><td>ميدساي (MidSci)</td><td>55D1114</td><td></td></tr><tr><td>كتلة التسخين</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-715-125D</td><td></td></tr><tr><td>دوار</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>ضبط الحاضنة على 60&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;مجهر إلكتروني&gt;تتبع الصبغة:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>مقصات مجهرية</td><td>جودر</td><td>G-19775</td><td></td></tr><tr><td>ملقط دقيق</td><td>إي. إم. إس (E.M.S)</td><td>72680-F</td><td></td></tr><tr><td>صبغة NeuroVue: مارون، حمراء، جاد</td><td>مقال MTT</td><td>FS-100(1,2,6)</td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) بتركيز 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>مجهر التشريح</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>حضّانة مضبوطة على 36 درجة مئوية&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-506DQ</td><td></td></tr><tr><td>المجهر البؤري</td><td>Leica Microsystems</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>شرائح</td><td>سيرجيباث (Surgipath)</td><td>00240</td><td></td></tr><tr><td>شرائح التغطية</td><td>Surgipath</td><td>00106</td><td></td></tr><tr><td>معهد رينسيلر للعلوم والتكنولوجيا (RPI)</td><td>جليسرول</td><td>G22025-0.5</td><td></td></tr><tr><td>بارافورمالدهيد (4% و 0.4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr></tbody></table>

الجمع بين صبغ محبة للدهون ، في الموقع التهجين ، المناعية ، والأنسجة

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

تجاوز وظيفة جينة واحدة لقطع أعمق في شبكات الجينات التنظيمية يتطلب تحولات متعددة مجتمعة في حيوان واحد. مثل هذا التحليل من اثنين أو أكثر من الجينات تحتاج إلى أن تستكمل مع التهجين في الموضع الطبيعي للجينات أخرى ، أو من البروتينات المناعية الخاصة بهم ، سواء في أجهزة محمولة كلها النامية أو أقسام لتحليل مفصل للتعديلات التعبير الخلوية والأنسجة. الجمع بين عدة جينات التعديلات يتطلب استخدام لجنة المساواة العرقية أو لحذف flipase مشروط الجينات وتجنب الفتك الجنينية. المخططات المطلوبة تربية تعزز على نحو مثير الجهد والتكاليف بما يتناسب مع عدد من الجينات المتحولة ، مع نتائج قليلة جدا من الحيوانات مع ذخيرة كاملة من التعديلات الوراثية المطلوبة. إطفاء الكم الهائل من الجهد والوقت للحصول على هذه العينات القليلة الثمينة التي تحمل طفرات متعددة يتطلب التحسين الأنسجة. وعلاوة على ذلك ، والتحقيق في حيوان واحد مع تقنيات متعددة يجعل من السهل ربط عيوب الجينات الحذف مع التشكيلات التعبير. قمنا بتطوير تقنية للحصول على مزيد من التحليل الدقيق لحيوان معين ، مع القدرة على تحليل العديد من مختلف هياكل معترف بها تشريحيا وكذلك الجينات والبروتينات التعبير عن نفسه من العينة في كل من الأجهزة كلها صحيحة والمقاطع. على الرغم من أن الفئران قد استخدمت للتدليل على فعالية هذه التقنية يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من الحيوانات. للقيام بذلك جمعنا محبة للدهون صبغ تتبع جبل بأكمله في الموقع التهجين ، المناعية ، والأنسجة لاستخراج أقصى كمية ممكنة من البيانات.

وتقدم مجموعة من التقنيات المختلفة لتعظيم جمع البيانات من الأنسجة الماوس.

يتطلب تجاوز دراسة وظيفة الجين المنفرد للتعمق أكثر في الشبكات التنظيمية للجينات دمج طفرات متعددة في حيوان واحد. إن مثل هذا التحليل لـ...

يتطلب تجاوز دراسة وظيفة الجين الواحد وتحليل شبكات تنظيم الجينات إحداث طفرات متعددة في حيوان واحد. وفي هذا النظام، نعمل على تحسين كمية البيانات المستخرجة من نسيج واحد لربط الطفرات الجينية بالملفات المورفولوجية وملفات التعبير. ويتحقق ذلك من خلال حقن صبغة محبة للدهون أولاً لتصوير عدة مجموعات عصبية منفصلة.يتم إجراء التهجين الموضعي (In situ hybridization) لتصوير النمط المكاني والزماني لنواتج نسخ الجينات. وبينما تعكس الكيمياء النسيجية المناعية أنماطاً محددة من التعبير البروتيني، فإن البعد الإضافي المتمثل في التقطيع النسيجي يساهم في توصيف النمط الظاهري. يوفر هذا النظام التجريبي القدرة على تحليل العديد من البنى المختلفة التي يمكن تمييزها نسيجياً، بالإضافة إلى التعبير الجيني والبروتيني، وكل ذلك من العينة نفسها سواء في التحضيرات الكاملة المثبتة أو المقاطع النسيجية، وهو نظام يجمع بين تتبع الأصباغ المحبة للدهون والتهجين الموضعي والكيمياء النسيجية المناعية وعلم الأنسجة.تعمل هذه التقنية على زيادة المعلومات المكتسبة من عينة واحدة إلى أقصى حد مع ربط المورفولوجيا بالتعبير الجيني والبروتيني. وبالنسبة لجميع عمليات تشريح الأنسجة ومعالجتها، يتم تثبيت الحيوانات في 4%paraldehyde في محلول منظم من الفوسفات بتركيز 0.1 molar عن طريق التروية القلبية باستخدام مضخات 연동ية مع إبر ذات أحجام مناسبة. ونظراً لأن الـ DY حساسة للضوء، تُحفظ في مقصورة مغلقة ومظلمة، ولتجنب التلوث الخلطي، يتم تخصيص مجموعة منفصلة من الأدوات للتعامل مع كل صبغة تحت مجهر تشريحي.حدد موقع تطبيق الصبغة لوسم الجمهرة العصبية المستهدفة بشكل انتقائي دون الهياكل الخارجية الأخرى. استأصل الأنسجة الزائدة للتأكيد بصرياً على الموقع المختار وتيسير الوصول لوضع الصبغة. الآن، قم بقص شرائط مرشح صبغة neuro view المحملة مسبقاً إلى قطع مثلثية ذات أحجام مناسبة باستخدام مقصات دقيقة.تأكد من قطع أصغر قطعة ممكنة لتجنب وسم هياكل أخرى عند الإدخال في الأنسجة الرخوة، مثل الدماغ مباشرةً. أدخل المرشح باستخدام إحدى زوايا مثلث المرشح لثقب النسيج. وبالنسبة للأنسجة الأكثر صلابة، قم بعمل شق للسماح بإدخال D بشكل أسهل. لا تستخدم إبرة تشريح لدفع المرشح داخل النسيج.ضع العينات في قارورة مغلقة بإحكام تحتوي على 4% para formaldehyde، ثم قم بتحضينها عند درجة حرارة 36 degrees Celsius في الظلام لمدة تتراوح من يومين إلى 14 يوماً، وذلك اعتماداً على العمر ومسافة الانتشار المطلوب تغطيتها. وباستخدام مجهر تشريحي مزود بفلورة فوقية (epi fluorescence)، تحقق من انتشار الصبغة إلى الموقع المطلوب، ثم قم بتشريح النسيج المستهدف. ثبت العينة على شريحة باستخدام الجلسرين (glycerol) للتصوير بواسطة مجهر بؤري (confocal microscope).بعد تصوير العيون المحبة للدهون في عينات النقل المجهري البؤري، يتم نقلها إلى أنبوب Eppendorf سعة 2 mL خالٍ من الـ RNases مع محلول PBS خالٍ من الـ RNases لشطف الجلسرول بشكل منهجي. تُعالج العينات من خلال عمليات التجفيف وإعادة الترطيب باستخدام سلسلة متدرجة من الميثانول عند درجة حرارة 4 °C. ابدأ بالتحضين في ميثانول بتركيز 100% لمدة ساعة واحدة على الأقل، ثم تدرج نزولاً وصولاً إلى ميثانول بتركيز 25% لمدة 15 دقيقة.اغسل ثلاث مرات باستخدام محلول PBS (بتركيز 1x) لمدة خمس دقائق لكل غسلة. قم بهضم النسيج باستخدام 2 µL من محلول البروتينيز K (proteinase K) بتركيز 20 mg/mL في 2 mL من محلول PBS طازج. راقب تفاعل الهضم من خلال تغير عتامة النسيج من عاتم إلى شفاف تقريبًا.من أجل إيقاف الهضم الإنزيمي، يتم تحضين العينات في 4%para formaldehyde لمدة خمس دقائق. ثم تُغسل بـ PBS مرة واحدة لمدة دقيقة واحدة، تليها ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق لكل منها. يتم التخلص من غسلة PBS النهائية مع إيلاء اهتمام خاص لإزالة أكبر قدر ممكن كخطوة ما قبل التهجين.قم بتحضين العينات في 1.8 milliliters من محلول التهجين. اخلط العينات لمدة ساعة واحدة عند 60 degrees Celsius باستخدام جهاز قلّاب، ثم قم بمسخ DNA الحيوانات المنوية لسلمون salmon sperm DNA عن طريق التحضين عند 85 degrees Celsius لمدة 10 دقائق، ثم ضعها على الثلج، وأضف 200 microliters من DNA أحادي السلاسل الممسوخ وما يقرب من 100 nanograms من مسبار riba الموسوم بـ DIG إلى كل عينة، ثم قم بإجراء التهجين طوال الليل عند 60 degrees Celsius في فرن تهجين.تُعالَج العينات بثلاث غسلات لمدة 10 دقائق لكل منها باستخدام محلول SSC بتركيز 2× عند درجة حرارة 60 درجة مئوية في فرن التهجين. ومن المهم إزالة أي نشاط داخلي لإنزيم الفوسفاتاز القلوي (alkaline phosphatase) عن طريق الغسل بمحلول SSC بتركيز 2× لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة 70 درجة مئوية في كتلة تسخين ISO temp. تُغسل العينات بمحلول PBS لمدة خمس دقائق.الآن، استبدل PBS وأضف ميكرولتر واحد من 10 mg/mL من RNAs A، ثم حضن لمدة 60 دقيقة عند 37 °C في كتلة تسخين ISO temp. تخلص من PBS RNAs A واغسل ثلاث مرات بمحلول الغسيل لمدة 10 دقائق في كل مرة.أخيرًا، قم بتسخين وتنشيط أي RNAs متبقية عن طريق التحضين لمدة 60 دقيقة عند 70 درجة مئوية في كتلة تسخين ISO temp. الخطوة النهائية هي تصوير المسبار الريبوزي (ribo probe). قم بتحضين العينات في محلول درء (block buffer) بتركيز مرة واحدة لمدة ساعة واحدة.تخلص من محلول الحجز وأضف ملليلترين من محلول الحجز الذي يحتوي على ميكرولتر واحد من الجسم المضاد anti ditch إلى كل عينة. احضن العينات طوال الليل ثم اغسلها عدة مرات باستخدام محلول غسيل بتركيز 1× كما هو موضح. بعد ذلك، احضن العينات في محلول غسيل بتركيز 1× طوال الليل.اغسل العينات باستخدام محلول الكشف (detection buffer) لمرة واحدة لمدة 10 دقائق، ثم انقل العينات إلى طبق معايرة (well plate). تخلص من محلول الكشف وقم بإظهار اللون باستخدام BM purple، نظرًا لأن BM purple حساس للضوء. غطِّ الطبق بورق ألومنيوم أو بصندوق عند الوصول إلى قوة الإشارة المطلوبة.اشطف العينات باستخدام محلول التخفيف الكاشف (detection buffer) مرة واحدة في الآبار لمدة خمس دقائق. قم بتصوير العينات باستخدام المجهر النافذ أو خزنها في 4% Para formaldehyde عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. قم بإزالة الأصباغ المحبة للدهون من النسيج باستخدام سلسلة متدرجة من الإيثانول عند الحاجة.بعد ذلك، أعد ترطيب النسيج عن طريق إضافة PBS تدريجياً على مدار خمس إلى 10 دقائق. الآن، قم بحجب النسيج لمدة ساعة واحدة في مصل ماعز طبيعي بنسبة 2.5% و Triton X 100 بنسبة 0.5% في درجة حرارة الغرفة على هزاز، ثم حضنه مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب لمدة 48 ساعة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية على هزاز، واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة ساعة واحدة في كل مرة. قم بحجب العينات مرة أخرى، ثم حضنها مع أجسام مضادة ثانوية مقترنة بفلورسنت ومخففة في محلول الحجب لمدة تتراوح من 12 إلى 24 ساعة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية على هزاز. ومن هذه النقطة فصاعداً، يجب توخي الحذر لحجب الضوء عن العينة لأن الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء.مرة أخرى، اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة ساعة واحدة في كل مرة. وأخيراً، قم بتحليل العينات عن طريق التصوير باستخدام المجهر الفلوري العكسي (epi fluorescent) والمجهر البؤري (confocal microscopy). يتطلب التضمين في الإيبوكسي والتقطيع تثبيت الأنسجة في 2.5%GLUTARALDEHYDE و 1%PFA في محلول منظم من الفوسفات بتركيز 0.1 molar، وعادة ما يكون ذلك طوال الليل في قارورة عينات زجاجية؛ ثم جفف الأنسجة باستخدام حضنات من الإيثانول المتدرج للانتقال الآن إلى المذيبات عبر الحضانة في محلول مكون من إيثانول مطلق وبروبيلين أكسيد بنسبة واحد إلى واحد لمدة خمس دقائق، تليها خمس غسلات لمدة 10 دقائق في بروبيلين أكسيد فقط؛ ثم قم بتسريب العينة بالراتنج عن طريق حضانة بسيطة في محلول من بروبيلين أكسيد وراتنج بنسبة واحد إلى واحد طوال الليل على جهاز هزاز.صُب المحلول الذي يحتوي على العينة في قالب تضمين مسطح، واتركه على المنضدة لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات لتبخير propylene oxide. انقل العينات إلى resin بتركيز 100% لمدة أربع ساعات في القالب النهائي. قم بتضمين العينات في resin ووضع ملصق تعريفي.اترك الراتنج ليتلمر عن طريق التحضين عند 60 درجة مئوية لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة. ومن أجل تقليل الراتنج الزائد، قم بنحت كتلة الراتنج باستخدام شفرة حلاقة حسب الحاجة. باستخدام جهاز الميكروتوم الفائق (ultra microtome).قم بقطع مقاطع متسلسلة بسمك 1 إلى 2 ميكرون، ثم ثبّت العينات وصوّرها باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ والمجهر الفلوري فوق البؤري. يمكن أن تسهل الأصباغ المحبة للدهون ذات الأطوال الموجية المختلفة رؤية الإسقاطات المركزية لثلاثة أعصاب قحفية مختلفة. هنا، يتم وضع الصبغة المحبة للدهون في الأجزاء الطرفية من العصب ثلاثي التوائم والعصب اللساني البلعومي والعصب الحائر.بعد الحضن للسماح بانتشار الصبغة، يتم تصوير الاستطالات المركزية للأعصاب المتجهة إلى جذع الدماغ باستخدام المجهر الضوئي. وعند تشريح الدماغ الخلفي وتثبيته بشكل مسطح، يظهر بوضوح بعض الوسم للاستطالات المركزية للأعصاب الثلاثة الموُسمة. وفي حين يُستخدم المجهر الضوئي، يتيح المجهر البؤري (confocal microscope) تحديد الأبعاد حيث يتم إضاءة مناطق محددة، كما يسمح استخدام ثلاث صبغات مختلفة بتقييم توزيع كل مجموعة.بالنسبة للعينات الأخرى، تم هنا تتبع الألياف الواردة في الأذن الداخلية لفأر حديث الولادة باستخدام تقنية neuro view. يظهر اللون الأحمر في التهجين الموضعي C لـ prox one، مع مزيج من التفاعل المناعي لـ anti tubulin و anti prox. One لتصوير الألياف الواردة.بالإضافة إلى ذلك، يتم تصوير مقطع من راتنج الإيبوكسي بسمك 2 micron من القوقعة كمقطع عرضي. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم اختيار موضع العين المحبة للدهون بعناية. سيساعد الفهم الجيد للتشريح العصبي في هذه العملية، كما يجب توخي الحذر في جميع الخطوات الحساسة للضوء.سيقلل هذا الإجراء من كمية عمليات التربية والوقت اللازم للحصول على بيانات قابلة للنشر، مع تحسين المعلومات المتعلقة بالتوطن المشترك وتأثيرات التغطية في الطفرات.

combining-lipophilic-dye-situ-hybridization-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

وهناك تقنية تجمع في تلطيخ tetramer الموقع والتهجين الموضع (ISTH) تمكن التصور ورسم الخرائط وتحليل القرب المكاني للمحددة فيروس CD8 خلايا تي + لأهداف المصابة بالفيروسات على ، وتحديد العلاقات الكمية بين هذه المستجيبات المناعي والأهداف إلى نتائج العدوى.

تقنية لتصور في الوقت نفسه للفيروسات محددة CD8 + الخلايا T والخلايا المصابة بالفيروسات في الموضع</em

المصدر: جولي، س.، et.al. الجمع بين التألق المزدوج  في الموقع  التهجين مع الملصقات المناعية للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات في أقسام دماغ الفأر. J. Vis. Exp.  (2016). يوضح هذا الفيديو استخدام التألق المزدوج في التهجين في الموقع لتصور التعبير عن هدفين من الحمض النووي الريبي في أقسام دماغ الفأر. يتضمن البروتوكول الكشف المتسلسل عن الحمض النووي الريبي باستخدام مجسات مصنفة بفلوريسين إيزوثيوسيانات وديجوكسيجينين ، متبوعا بتضخيم الإشارة الأنزيمية لتعزيز الحساسية. يتيح التألق الناتج تحليل التوطين المشترك...

 إجراء التهجين المزدوج في الموقع للكشف عن التعبير الجيني في أقسام دماغ الفئران

نحن هنا وصف كامل الفلورسنت...

كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

نحن تصف مولد اللون كله جبل في الموقع التهجين (MC-WISH) إجراء متعدد الاهداف في أجنة ذبابة الفاكهة سليمة مما يتيح كشف في وقت واحد ومحدد من ثلاثة أنماط توزيع مرنا مختلفة المتناقضة رواسب اللون.

متعددة الهدف اللونية الجامع جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لمقارنة الجينات مجالات التعبير في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

قد يكون توطين التعبير الجيني لأنواع معينة من الخلايا أمرا صعبا بسبب نقص الأجسام المضادة المحددة. نصف هنا بروتوكولا للكشف الثلاثي المتزامن للتعبير الجيني من خلال الجمع بين الحمض النووي الريبي المضان المزدوج في الموقع مع التلوين المناعي.

الجمع بين نقرا الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين مع Immunolabelling للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات في أقسام الدماغ ماوس

الجيش الملكي النيبالي هو موضح في الموقع البروتوكول التهجين يسمح الكشف عن الحمض النووي الريبي في أسرة المورفولوجية أجنة أو أنسجة تشريح. استخدام لوحات microtiter 96-جيدا وتضخيم إشارة تيراميدي، يمكن اكتشاف النصوص في عالية الدقة والحساسية، والإنتاجية، وتكلفة منخفضة نسبيا.

عالية الدقة الفلورسنت في الموقع التهجين في المورفولوجية الأجنة والأنسجة باستخدام التضخيم الإشارات تيراميدي

هنا يمكننا وصف بروتوكول متعدد المناعي الفلورسنت تلطيخ والتصوير للترجمة المتزامنة متعددة المستضدات المرتبطة بالسرطان في الأورام اللمفاوية. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتحليل المؤشرات الحيوية داخل جميع أقسام الأنسجة كولوكاليزيشن.

متعدد الفلورسنت المناعي تلطيخ والتصوير والتحليل في عينات نسيجية من سرطان الغدد الليمفاوية

نحن نصف طريقة تلطيخ سريعة لإجراء التصوير متعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة.

طريقة سريعة لتصوير الفلورسينس متعدد الأطياف لأقسام الأنسجة المجمدة

يصف هذا البروتوكول طريقة للجمع بين التهجين الفلوري في الموقع (FISH) والكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية (IHC) في كل من أقسام دماغ الفأر المجمدة والثابتة الطازجة ، بهدف تحقيق إشارة FISH متعددة العلامات و IHC مضان. استهدفت المدينة العالمية للخدمات الإنسانية البروتينات السيتوبلازمية والأغشية المرفقة.

الجمع بين التهجين الفلوري المتعدد في الموقع مع الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية على أقسام دماغ الفأر الطازجة المجمدة أو الثابتة

في هذه المقالة ، تم وصف بروتوكول لتضخيم إشارة التيراميد اليدوي (TSA) متعدد الإرسال المناعي (mIF) جنبا إلى جنب مع تحليل الصور والتحليل المكاني. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع أقسام البارافين المضمنة في الفورمالين (FFPE) لتلطيخ اثنين إلى ستة مستضدات لكل شريحة اعتمادا على ماسح الشرائح المتاح في المختبر.

التألق المناعي المتعدد جنبا إلى جنب مع تحليل الصور المكانية للتقييم السريري والبيولوجي للبيئة المكروية للورم

يحدد هذا البروتوكول الخطوات التفصيلية للفحص المجهري الإلكتروني المناعي قبل التضمين ، مع التركيز على استكشاف الدوائر المشبكية وتوطين البروتين في شبكية العين.

فحص دوائر الشبكية والتوطين الجزيئي عن طريق التضمين المسبق للمجهر الإلكتروني المناعي

تعلم دمج صبغة الدهون والتهجين الموضعي والمناعة والأنسجة لتحليل أنسجة الفئران. تتيح هذه الطريقة ربط الطفرات الوراثية بالتشوهات المورفولوجية ونمط التعبير الجيني والبروتيني.

الجمع بين صبغ محبة للدهون ، في الموقع التهجين ، المناعية ، والأنسجة

استكشف المزيد من الفيديوهات