الميتوكوندريا من عزل العضلات والهيكل العظمي
مارس 30, 2011
يصف هذا البروتوكول إجراء دراسة التنفس من الميتوكوندريا المعزولة من عضلات الهيكل العظمي. وقد تم تكييف هذا الأسلوب من Scorrano وآخرون. (2007). لإجراء العزل الميتوكوندريا يتطلب حوالي 2 ساعة. ويمكن الانتهاء من تنفس الميتوكوندريا في حوالي 1 ساعة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الميتوكوندريا وإجراء تنفس الميتوكوندريا. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل العضلات الهيكلية أولا عن الفئران الرذاذ. بعد ذلك ، يتم تجانس العضلات وعزل الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي.
ثم يتم تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد. أخيرا ، يتم قياس تنفس الميتوكوندريا عن طريق كشف الكذب. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر استهلاك الأكسجين من خلال حالات تنفس الميتوكوندريا المختلفة.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العضلات الهيكلية ، مثل تأثير التدخلات المختلفة لوظيفة الميتوكوندريا. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على التمثيل الغذائي للعضلات الهيكلية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أعضاء أخرى مثل الكبد أو الدماغ أو الكلى أو أي نسيج تقريبا قبل بدء الإجراء. لعزل العضلات الهيكلية ، قم بإعداد المحاليل التالية ، P-B-S-P-B-S بالإضافة إلى 10 مللي مولار EDTA ، ثماني مرات عازل عازلة الميتوكوندريا واحد أو IB واحد ، عازل العزل الثاني أو IB اثنين والمخزن المؤقت التجريبي أو eb.
راجع البروتوكول المكتوب المصاحب للحصول على التعليمات. بعد ذلك ، قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي واضبطه على أربع درجات مئوية. قم بتشغيل حمام مائي واضبطه على 37 درجة مئوية.
في دلو جميل ، ضع ثلاثة أكواب سعة 10 مليلتر ، ومرفق خزاف ، ومطاحن مناديل أحجار كريمة ، ومقص جراحي صغير ، و 10 أنابيب طرد مركزي صغيرة على الجليد. يجب أن يظل كل شيء باردا طوال التجربة. ضع IB واحد و IB اثنين على ICE و EB في حمام ماء دافئ.
ثم أضف المحاليل التالية إلى الأكواب الثلاثة على دورق الثلج ، واحد 10 مل من دورق PBS ، واثنين من 10 ملليلتر من دورق P-B-S-E-D-T-A. تلاتة. ثلاثة ملليلتر من ib. أحدهم قتل فأر وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل لجنة رعاية والعصير المؤسسية المحلية.
بعد ذلك ، قم بعزل 250 إلى 500 ملليغرام من العضلات الهيكلية بسرعة باستخدام ملقط ومقص Mayo Clinic. اشطفه في بيكا واحد ، ثم انقله إلى بيكا اثنين ، لتجانس العضلات. أولا ، انقله إلى دورق ثلاثة ، وأخيرا افرمه بالمقص.
انقل المحلول إلى الخزاف Elva gem homogenizer لتجانس العضلات باستخدام مدقة آلية 10 مرات ، مع الحفاظ على الأنبوب في الجليد في جميع الأوقات. بعد ذلك ، انقل المتجانس إلى جهاز طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر مبرد مسبقا وأنابيب وأجهزة طرد مركزي عند 700 جي ث لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية S إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد تم تقديمه مسبقا وتخلص من جهاز الطرد المركزي الحبيبات.
المادة الطافية S عند 10 ، 500 Gs لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، انقل SNAT إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مملوء مسبقا وقم بتسميتها ب SN one ونوع العضلات Reese. الحبيبات في 500 ميكرولتر من IB اثنين ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 10 ، 500 Gs لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل supinate إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مملوء مسبقا وقم بتسميه ب SN two ونوع العضلات.
قم بتعليق حبيبات الميتوكوندريا النهائية في 100 ميكرولتر من IB اثنين. قم بتدويرها في سحر صغير لبضع ثوان. إذا كان هناك بيليه ، فقم بنقل السوبينات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد مملوء مسبقا وتخلص من الحبيبات تعد معايرة قطب الأكسجين خطوة أساسية في هذا البروتوكول ويجب إجراؤها يوميا.
يمكن إكمال معايرة القطب أثناء عزل الميتوكوندريا. للبدء ، أضف 100 مل من الماء المقطر إلى قارورة سعة 250 ملليلتر بقوة لمدة 20 دقيقة. لموازنة الماء مع الغاز الجوي ، قم بتغطية قطب GRAT ببضع قطرات من 50٪ كلوريد البوتاسيوم.
بعد ذلك ، ضع قطعة صغيرة من ورق درفلة ريزلا الأزرق فوق القطب. ثم قطعة من غشاء PTFE. فوق ورق المتداول.
ضع الحلقة الداخلية باستخدام قضيب الحلقة ، ثم ضع الحلقة الخارجية في أخدود القطب. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية وقم بتجميع قاعدة الحلقة البلاستيكية الأكبر وغرفة الميتوكوندريا وخراطيم المياه. قم بتشغيل صناديق GRAT وابدأ تشغيل برنامج GRAS.
أضف الماء المتوازن إلى غرفة الميتوكوندريا. ثم أضف شريط التحريك لتشغيل شريط التقليب. انقر فوق الأجهزة.
ثم حرك بسرعة. اضبط السرعة على 60 وانقر فوق. بعد ذلك ، ابدأ تجربة جديدة.
انقر فوق معايرة ثم معايرة الطور السائل. بالنسبة للمربع الأول ، قم بتغيير درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية وانقر فوق موافق مرتين. عند تجاوز التغييرات ، حسنا ، انقر فوقه وافتح خزان غاز النيتروجين.
ضع الطرف المتصل بخزان النيتروجين في الغرفة وقم بإنشاء أي أكسجين. انقر فوق موافق عند التبديل من التجاوز. استنشق الماء وأضف 500 ميكرولتر من EB إلى غرف الميتوكوندريا.
أغلق الغرفة بمكبس. إذا كنت تستخدم مربعات متعددة، كرر ذلك من خطوة المعايرة لكل صندوق. ابدأ تجربة جديدة واتركها تعمل لمدة دقيقة واحدة تقريبا.
لتحقيق الاستقرار في الإشارة ، أضف الحجم اللازم لتعليق الميتوكوندريا للوصول إلى 150 ميكروغراما في كل غرفة. ضع علامة على الحدث واتركه يعمل. لمدة دقيقة واحدة ، أضف 10 ميكرولترات من الغلوتامات الدافئة 250 مللي مولار ، و 125 مللي مولار من المالات للتركيز النهائي من خمسة مللي مولار الغلوتامات ، و 2.5 ملليمولار علامة المالات ، واتركها تعمل لمدة دقيقة واحدة.
يتم تعريف هذا على أنه الحالة الثانية. بعد ذلك ، أضف 7.5 ميكرولتر من 10 ملليمولار DP للحصول على تركيز نهائي يبلغ 150 ميكرومولار. ثم ضع علامة واتركها تعمل لمدة 30 ثانية.
يتم تعريف هذا على أنه الحالة الثالثة. أضف 7.5 ميكرولتر أخرى من 10 مللي مولار علامة DP ، واتركها تعمل لمدة 1.5 دقيقة. أضف 0.5 ميكرولتر من 10 ملليمولار أوليغو مايسين بارد للحصول على تركيز نهائي لعلامة ميكرومولار واحدة ، واتركه يعمل لمدة ثلاث دقائق.
يتم تعريف هذا على أنه الحالة الرابعة. أضف ميكرولتر واحد من FCCP البارد ، 0.1 ملليمولار للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.2 ميكرومولار ، واترك RUM لمدة ثلاث دقائق. يتم تعريف هذا على أنه الحالة الخامسة.
عند الانتهاء ، قم بإنهاء التجربة واحفظها. احصل على معدلات التنفس باستخدام برنامج الطوافة. أدخل عامل التطبيع.
في حالة إضافة 150 ميكروغراما من بروتين الميتوكوندريا ، سيكون عامل التطبيع 0.15. احسب معدلات التنفس الطبيعية لحالات التنفس المختلفة. احسب نسبة التحكم في الجهاز التنفسي أو RCR بقسمة الحالة ثلاثة على الحالة أربعة.
يوضح هذا الشكل تتبعا تمثيليا لاستهلاك الأكسجين بواسطة العضلات الهيكلية. الميتوكوندريا. بعد استقرار إشارة القطب الكهربائي ، تتم إضافة عينة الميتوكوندريا إلى غرفة GRAT. الحالة الثانية ، يبدأ التنفس بإضافة الغلوتامات والمالات.
إضافة DP يزيد من استهلاك الأكسجين. تحديد الحالة الثالثة. التنفس يتم حظر سينتاز TP عن طريق إضافة ليجا مايسين للحصول على تنفس الحالة الرابعة.
أخيرا ، يضاف FCCP إلى تنفس الميتوكوندريا غير الزوجي. يوضح هذا الرسم البياني معدلات استهلاك الأكسجين التمثيلية للحالات 2 و 3 و 4 و 5. يتم حساب نسبة التحكم في الجهاز التنفسي أو RCR لكل تجربة.
يعتبر RCR أكبر من أربعة دليلا على تحضير الميتوكوندريا القابل للتطبيق أثناء محاولة هذا الإجراء. من المهم الاحتفاظ بعينات الميتوكوندريا في الجليد في جميع الأوقات. باتباع هذا الإجراء.
يمكن إجراء طرق أخرى مثل اللطخات الغربية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل محتوى بروتينات الميتوكوندريا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الميتوكوندريا عن عضلة الهيكل العظمي وكذلك تنفس الميتوكوندريا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول إجراءً لعزل الميتوكوندريا من عضلات الهيكل العظمي وقياس التنفس الخاص بها. تسمح الطريقة بتقييم وظيفة الميتوكوندريا من خلال تحليل استهلاك الأكسجين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- التمثيل الغذائي
الخلفية
- تلعب الميتوكوندريا دورًا حيويًا في إنتاج الطاقة.
- فهم التنفس الميتوكوندريا ضروري لدراسة الاضطرابات الأيضية.
- هذا البروتوكول مقتبس من المنهجيات المثبتة.
- عزل الميتوكوندريا ضروري لقياس دقيق لوظيفتها.
هدف الدراسة
- لعزل الميتوكوندريا من أنسجة العضلات الهيكلية.
- لقياس معدلات التنفس الميتوكوندريا.
- لتحليل استهلاك الأكسجين في حالات تنفس الميتوكوندريا المختلفة.
الطرق المستخدمة
- عزل العضلات الهيكلية من الفئران المجففة بالرش.
- تجانس أنسجة العضلات.
- الطرد المركزي لعزل الميتوكوندريا.
- تحديد تركيز البروتين باستخدام اختبار برادفورد.
- قياس التنفس الميتوكوندريا باستخدام مخطط كهربائي.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للميتوكوندريا من العضلات الهيكلية.
- تقييم كمي للتنفس الميتوكوندريا.
- تشير النتائج إلى اختلاف استهلاك الأكسجين عبر حالات التنفس الميتوكوندريا المختلفة.
الاستنتاجات
- يعزّل البروتوكول الميتوكوندريا بفعالية لدراسات التنفس.
- تسهم النتائج في فهم وظيفة الميتوكوندريا في العمليات الأيضية.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في المزيد من الأبحاث في استقلاب العضلات.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Isolating functional mitochondria from skeletal muscle enables mechanistic de-risking of metabolic targets in preclinical discovery. Quantitative respiration readouts provide predictive confidence for target validation and pathway interrogation. This method supports early go/no-go decisions by establishing mitochondrial viability thresholds before compound screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mitochondrial function to skeletal muscle metabolism and energy homeostasis.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized isolation of viable mitochondria with RCR ≥4 as a functional benchmark.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying respiratory control ratios that reflect mitochondrial integrity and coupling efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated mitochondrial systems for downstream biochemical and functional assays including enzyme activity and proteomics.
- Operational Value: Ensures assay standardization via daily oxygen electrode calibration and consistent protein normalization using Bradford assay.
- Scalability Value: Enables reliable compound evaluation through reproducible state 2-5 respiration measurements under controlled substrate and inhibitor conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by studying mitochondrial respiration in skeletal muscle, a key tissue in metabolic disorders.
- Operational Value: Provides translational continuity from discovery through preclinical validation via quantitative oxygen consumption across respiration states.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions by measuring uncoupled (state 5) and ATP-linked (state 3) respiration to assess bioenergetic health.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, supporting mitochondrial-targeted programs in metabolic disease.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating mitochondria to clarify pathways involved in ATP synthesis and metabolic signaling.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible respiration measurements that enable comparison of compound effects on oxygen consumption.
- Analytics: Generates quantitative readouts (state 2-5 respiration, RCR) that help teams compare conditions and assess mitochondrial function.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing functional mitochondrial data relevant to muscle metabolism and energy expenditure models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation and respiration platform applicable across skeletal muscle types and adaptable to other tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in mitochondrial viability, reduction of mechanistic ambiguity in energy metabolism studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of mitochondrial isolation and respiration assays.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in metabolic target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on respiratory control ratios and substrate-specific respiration profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation techniques, centrifugation, and respiration measurement.
- Dependent on instrumentation including homogenizers, centrifuges kept at 4°C, water baths at 37°C, and polarographic oxygen electrode systems.
- Necessitates cross-team standardization of buffer preparation, daily electrode calibration, and strict ice-cold sample handling.
- Adaptation considerations include adjusting muscle input (250-500 mg) and mitochondrial protein load (150 µg) across different skeletal muscle types.
- Practical limitations include the need for fresh reagents, short functional study window (~1 hr post-isolation), and daily calibration of oxygen electrodes.
