أساليب التنمية للنقل الدم البلاعم التي تنقلها من العقاقير المضادة للفيروسات Nanoformulated

الهدف من هذا الإجراء هو تصنيع واختبار الامتصاص الخلوي، والإفراز، والخصائص المضادة للفيروسات القهقرية لجسيمات نانوية بلورية مضادة للفيروسات القهقرية، والتي نشير إليها باسم nano art. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق معالجة الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية بواسطة التجانس بالموجات فوق الصوتية، أو الطحن الرطب. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في توصيف الخصائص الفيزيائية لجسيمات nano art بعد عزل الخلايا الوحيدة الأولية عن طريق الطرد المركزي بتيار مضاد.

يتم استزراعها لمدة سبعة أيام في وسط DMEM يحتوي على عامل تحفيز مستعمرات البلاعم، أو MCSF، والذي يحفز تمايزها إلى بلاعم مشتقة من الخلايا الوحيدة. الخطوة الثالثة هي اختبار امتصاص Nano ART واحتجازه وتحرره في البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة البشرية. الخطوة النهائية من الإجراء هي اختبار الفعالية المضادة للفيروسات القهقرية لـ Nano ART في المختبر في البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر الامتصاص المسهّل والتحرر البطيء لـ nano art من الخلايا، بالإضافة إلى فعالية قوية مضادة للفيروسات القهقرية. ويتم تحديد ذلك من خلال قياسات مستويات الدواء، بواسطة تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء أو HPLC، ومن خلال اختبار مواد السائل الطافي للمستنبتات المصابة عن طريق قياس نشاط إنزيم reverse transcriptase. مرحباً، أنا هانتا ألدي، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتور هوارد جيلمان في مركز جامعة نبراسكا الطبي.

يمكن للطرق التي نعرضها أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في الطب النانوي، بما في ذلك كيفية استخدام أنظمة توصيل الأدوية القائمة على الخلايا لتطوير أنشطة البحوث الانتقالية. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام العلاج المضاد للفيروسات القهقرية المصاغ نانوياً والذي يتميز بفترات نصف عمر ممتدة. وتدعم دراساتنا إمكانية استخدام nano art للاستخدام السريري.

مرحبًا، اسمي آري نوشي، وأنا طالب وباحث في برنامج MD PhD أعمل في مختبر كارول شوارتز لعلوم الأعصاب الناشئة. تحت إشراف الدكتور جيندلمان، تمتد تطبيقات التقنيات التي نعرضها لكم هنا إلى العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية، لأن المركبات المصاغة نانويًا يمكنها تحسين التوافر الحيوي والحركية الدوائية في آن واحد، مع تقليل الآثار الجانبية المرتبطة بالأدوية. ومن خلال أخذ الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية المتاحة سريريًا وإعادة تعبئتها في جسيمات نانوية، قد نتمكن من تحسين امتثال المرضى للعلاج والتأثير إيجابًا على نتائج المرض.

مرحباً، أنا الدكتور هوارد جيندلمان. أنا عالم إكلينيكي وأستاذ ورئيس قسم علم الأدوية وعلم الأعصاب التجريبي هنا في المركز الطبي بجامعة نبراسكا. هدفنا العام هو تبسيط الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية لجعلها متاحة بسهولة وتحسين التوزيع الحيوي والحركية الدوائية.

أترككم الآن مع آري وشون اللذين سيصطحبانكم إلى المختبر البحثي ليوضحا لكم كيفية تصنيع وتطوير هذه الجسيمات النانوية. الفائدة السريرية والتطوير هنا في مركز جامعة نبراسكا الطبي لتصنيع جسيمات نانوية عبر الطحن الرطب. أولاً، قم بوزن بلورات الدواء والمواد الخافضة للتوتر السطحي المختلفة التي ستُستخدم لتحضير الصيغ النانوية، وامزجها مع 10 millimolar heis buffer pH 7.8 باستخدام خلاط T 18 ultra Turx حتى تتوزع تماماً؛ ويجب أن تكون نسبة الدواء في الصيغة بين 1% و2% لعملية الطحن المستمر.

تأكد من تشغيل المبرد والضاغط وأن ضغط المخرج يبلغ حوالي 100 PSI، ثم قم بإعداد الجهاز بحيث يمكن تحميل وسائط الطحن في الخزان وأضف 50 milliliters من الكرات إلى غرفة الطحن. باستخدام قمع، تأكد من عدم وجود كرات في الأسنان اللولبية أو في أي مكان خارج غرفة الطحن لتجنب حدوث تسريبات في مانع التسرب الميكانيكي. الآن، تأكد من وجود الحلقة الدائرية (O-ring) في مكانها الصحيح على غرفة الطحن.

بعد ذلك، اختر حجم شبكة غربال مناسب وقم بتثبيت الأغطية عن طريق شد الصواميل. يجب أن يكون حجم شبكة الغربال نصف حجم الخرز على الأقل. استخدم شبكة غربال ذات حجم كبير لتجنب انسداد المرشح بالمنتج أثناء عملية الطحن المستمر.

بعد خفض غرفة الطحن، أضف معلق الدواء الذي يحتوي على كميات متنوعة من المواد الخافضة للتوتر السطحي إلى مدخل المنتج. يجب أن يكون الحد الأدنى لحجم المعلق 100 milliliters. سيمنع ذلك غرفة الطحن من السخونة المفرطة كما يتجنب تلوث الخرزات بسبب تقليل تآكل الأجزاء.

بعد ذلك، قم بتشغيل المضخة. استخدم وحدة التحكم لضبط معدل التدفق المطلوب وفقاً للتركيبة الخاصة بك. ثم قم بتشغيل جهاز التقليب وضبط السرعة من خلال وحدة التحكم.

يمكن زيادة السرعة من 600 دورة في الدقيقة إلى 4,320 دورة في الدقيقة. في حالة استخدام micro sur، راقب درجة الحرارة باستخدام مقياس درجة الحرارة المثبت أعلى غرفة الطحن للتأكد من عدم حدوث ارتفاع مفرط في درجة الحرارة. الآن، قم بطحن العينة بسرعات ومعدلات تدفق مختلفة، واسحب كميات صغيرة تبلغ حوالي 1 mL من التركيبة لإجراء قياسات الحجم والشحنة باستخدام جهاز diffraction light scattering malvern zeta sizer.

بعد الحصول على الحجم المطلوب، أوقف عملية الطحن باستخدام وحدة التحكم، ومع استمرار عمل المضخة، اجمع العينة في دورق، مع السماح للعقار بالتصريف تماماً. تذكر إيقاف تشغيل المضخة عند الانتهاء، ثم قم بإزالة الكرات وتنظيفها. الآن، انقل معلق الطحن إلى أنابيب طرد مركزي سعة 50 milliliter واضبط جهاز الطرد المركزي على 10,000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.

عند اكتمال دورة الطرد المركزي، قم بقياس كمية الراسب واستبدالها بنفس الكمية من محلول خافض للتوتر السطحي جديد. وبمجرد اكتمال عملية إعادة التعليق، انقل المعلق إلى غرفة الطحن وقم بالطحن لمدة 10 دقائق. خذ عينة بحجم مل واحد تقريبًا وقم بقياس حجم وشحنة العينة مرة أخرى باستخدام جهاز Zeta sizer.

أخيرًا، قم بقياس تركيز تركيبات الفنون النانوية باستخدام HBLC لتصنيع الفنون النانوية عبر التجانس. وباستخدام Avastin Emulex C five، قم بتحضير بلورات الدواء والمواد الخافضة للتوتر السطحي المختلفة كما تم وصفه سابقًا، وانقل المعلق إلى وعاء التجانس وابدأ عملية إعادة التدوير. تأكد من تشغيل المبرد قبل البدء في تجانس العينة.

قم بزيادة الضغط تدريجياً حتى تظهر القراءة على المقياس 20,000 ± 2000 PSI واستمر في التجانس حتى يتم الوصول إلى حجم الجسيمات المستهدف. يستغرق هذا عادةً ما بين 45 إلى 60 دقيقة. خذ عينة حجمها حوالي واحد مللي لتر بشكل دوري وقم بقياس حجم وشحنة العينة باستخدام جهاز zeta sizer centrifuge، وذلك باستخدام المعلق المتجانس كما تم وصفه سابقاً.

بعد تعليق Resus، انقل المعلق إلى المجانس C five. أعد تشغيل الدورة وأرجع ضغط التجانس إلى 20,000 ± 2000 PSI وقم بالتجانس لمدة 30 دقيقة للتصنيع عبر الموجات فوق الصوتية باستخدام معالج Palmer ultrasonic البارد. صب محلول الكلوروميثان وPLGA والدواء في محلول خافض للتوتر السطحي PVA بنسبة 1% وضعه في حمام ثلجي داخل جهاز الموجات فوق الصوتية.

ابدأ عملية السونكة (sonication) عند سعة 50%، علماً أنه يمكن تقليل سعة السونكة إلى حوالي 30% للعينات ذات الكميات الصغيرة، وقم بعملية السونكة للعينة لمدة 10 دقائق. خذ جزءاً صغيراً (aliquot) لتحليل حجم الجسيمات. إذا كان حجم الجسيمات أكبر من 1.5 microns، فاستمر في عملية السونكة للعينات على فترات زمنية مدتها دقيقتان وصولاً إلى حد أقصى يبلغ 16 دقيقة إجمالاً.

افحص العينات تحت المجهر بتكبير 20 مرة ودوّن الملاحظات. استخدم لوحة تحريك لإنشاء دوامة مناسبة للمزيج المعلق واستمر في الخلط طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. اجمع المزيج المعلق بعد 24 ساعة واسكبه في أنابيب طرد مركزي سعة 50 milliliter.

قم بطرد العينات مركزياً بسرعة 8,000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 5 °C، ثم اسحب الراشح وأعد تعليق نصف العينة في 75 ملليلتر من مياه التناضح العكسي المفلترة، والنصف الآخر في 75 ملليلتر من مادة خافض التوتر السطحي 0.5% CTAB (بروميد ثلاثي ميثيل الأمونيوم). قم بطرد العينات مركزياً مرة أخرى بسرعة 8,000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 5 °C، وأعد تعليق كل من الرواسب في إجمالي 20 ملليلتر من محلول المانيتول. وأخيراً، بالنسبة للجزيئات المصنعة إما عن طريق التجانس أو الموجات فوق الصوتية، قم بقياس حجم الجزيئات باستخدام جهاز zeta sizer وقياس تركيز العينات باستخدام جهاز HPLC.

للتحضير للتصوير المجهري، خذ معلقات الفن النانوي (nano art) المُحضرة وعرضها للموجات فوق الصوتية لمدة 10 ثوانٍ. باستخدام مسبار سونيكاتور بقوة 20%amplitude، خذ شريحة زجاجية غطاءً ووضعها على مجهر مقلوب. على غطاء الشريحة.

امزج 15 µL من معلق جسيمات النانو الفنية مع 100 µL من المحلول الملحي الملحق بمحلول الفوسفات المنظم، وقم بالمزج عن طريق السحب والضخ بالماصة عدة مرات. بعد ذلك، قم بمعاينة الجسيمات النانوية باستخدام عدسة شيئية بقوة تكبير 20 مرة لفحص المورفولوجيا. كما يمكن تحضير العينات للمعاينة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.

نرى هنا صوراً تم الحصول عليها بواسطة مجهر A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F الإلكتروني الماسح بانبعاث مجالي منخفض الجهد بعد عزل الخلايا الوحيدة المحمولة في الدم عن طريق الطرد المركزي، حيث تم الحصول على خلايا وحيدة منقاة بتركيز 1×10⁶ خلية/مل في وسط DMEM مضاف إليه المكملات التالية. بعد ذلك، يتم توزيع 2×10⁶ خلية لكل بئر في أطباق ذات ستة آبار ضمن بيئة رطبة، ومزودة بـ 5% carbon dioxide، وتُحضن لمدة سبعة أيام للسماح للخلايا الوحيدة بالتمايز إلى خلايا بلعمية لتحليل امتصاص الخلايا وجمعها. اخلط nano art مع وسط الزرع للوصول إلى تركيز نهائي قدره 100 micromolar وأضف 1 ml من وسط المعالجة إلى كل بئر في النقطة الزمنية المطلوبة أو عندما يتم تحميل الخلايا بالكامل بـ nano art.

أزل جميع أوساط المعالجة واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 ml من PBS لإزالة أي جزيئات لم تمتصها الخلايا في 1 ml من PBS. أزل الخلايا الملتصقة من قاع البئر باستخدام رافع الخلايا (cell lifter) وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 ml. ثم قم بطرد الخلايا مركزياً عند 1000 RCF في درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق.

قم بإزالة السائل الطافي وأضف 200 µL من الميثانول بتركيز 100% لتحليل الخلايا وإذابة nano art عن طريق تعريض الراسب لفترة وجيزة للموجات فوق الصوتية باستخدام مسبار سونيك عند سعة 20% لمدة تتراوح بين ثانيتين إلى خمس ثوانٍ. تُحفظ العينات في درجة حرارة -80 °C حتى يحين وقت تحليل محتوى الدواء. كما يمكن تصور الاحتفاظ بـ nano art داخل الخلايا باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ بعد تحضير المقاطع بواسطة الميكروتوم كما هو موضح هنا.

راجع النص المصاحب لهذا المقال للحصول على تفاصيل تحليل تحرر nano arch ومعاملة الخلايا كما تم وصفه سابقاً لتحليل امتصاص الخلايا وجمعها. ومع ذلك، بدلاً من جمع الخلايا بعد الغسيل، استبدل PBS بملليلترين من وسط زراعة الخلايا الخالي من MCSF والخالي من nano art في الأيام المحددة أو عندما يشير تحول الوسط إلى اللون الأصفر إلى ذلك؛ استبدل نصف الوسط في اليوم المطلوب. اجمع ملليلتر واحد من وسط الخلايا مع الخلايا المكررة وقم بمعالجتها لتحليل الدواء.

لتصوير عملية الامتصاص في الوقت الفعلي باستخدام مجهر nano art bifocal، قم أولاً بأخذ صبغة DRE مثل vibrant وإضافتها إلى الوسط. وباتباع تعليمات الشركة المصنعة، أضف الوسط المحتوي على الصبغة إلى الخلايا البلعمية الناضجة المشتقة من الخلايا الوحيدة، ثم اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 mL من وسط الزرع لإزالة أي صبغة زائدة. الآن اخلط nano art مع وسط الزرع باستخدام nano art مُعلم فلوروسنتياً، وأضف وسط المعالجة الذي يحتوي على nano art المُعلم. وقبل التصوير مباشرة باستخدام المجهر البؤري (confocal microscope)، التقط صورة كل 30 ثانية لمدة أربع ساعات باستخدام عدسة شيئية بقوة 60x.

أخيراً، يمكن إجراء مقايسات العدوى والقدرة الإعدائية لفيروس HIV-1. أولاً، تُعامل الخلايا كما هو موضح في عملية تصوير إطلاق art. ثم في الأيام المحددة، يتم إزالة جميع الأوساط واستبدالها بوسط خالٍ من MCSF يحتوي على HIV-1-A بتعدد عدوى قدره 0.01 جسيم فيروسي لكل خلية، ثم تُحضن لمدة 24 ساعة.

ثم قم بإزالة الوسط الفيروسي واستبداله بفيروس جديد، واترك الخلايا المستزرعة في وسط خالٍ من الفيروس لمدة 10 أيام، مع استبدال نصف الوسط كل يومين أو حسب الضرورة للحفاظ على حيوية الخلايا لمدة 10 أيام بعد الإصابة. اجمع 10 µL من الوسط من كل بئر وضعها في لوحة ذات 96 بئراً، وخزنها عند درجة حرارة -80 °C حتى يحين موعد إجراء تحليل النسخ العكسي. كما يمكن أيضاً إجراء كشوفات لاحقة لبروتين HIV-1 p24.

يمكننا هنا أن نرى بوضوح مورفولوجيا الخلايا التي تعرضت للفيروس عند تعدد عدوى قدره 0.011 بعد يوم واحد من العلاج بالفن النانوي. وفي هذه الخلايا البلعمية المشتقة من الخلايا أحادية النواة، لا يوجد دليل على حدوث عدوى فيروسية، وتظهر الجسيمات النانوية بوضوح داخل سيتوبلازم الخلية. هنا، تم تعريض الخلايا للفيروس بعد 10 أيام من العلاج بالفن النانوي.

أُصيبت بعض هذه الخلايا كما يتضح من صبغ P 24 وتكون الخلايا العملاقة متعددة النوى، ومع ذلك لا تزال هناك حماية ملحوظة مقارنة بالخلايا غير المعالجة. يلاحظ أن الجسيمات النانوية لا تزال مرئية داخل سيتوبلازم الخلايا في B، ولكن ليس بقدر ما شوهد في a، وهذه التراكيب غير موجودة في الخلايا التي لم تُعالج بـ nano art. في فيديوهات المجهر البؤري للخلايا الحية هذه، نرى الخلايا البلعمية مميزة باللون الأخضر و nano art مميزة باللون الأحمر.

نرى هنا أن الخلايا تراكم عدداً قليلاً جداً من الجسيمات النانوية. وهنا، تراكم الخلايا الجسيمات بسرعة كما يتضح من زيادة الفلورة الحمراء. وتتوازى هذه الاختلافات مع النتائج التي تظهر عند تحليل امتصاص الدواء باستخدام HPLC؛ وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا رؤية الخلايا وهي تمتص الجسيمات بنشاط.

يعكس الاختلاف في معدلات تراكم الفنون النانوية الخلوية تأثيرات الخصائص الفيزيائية مثل الحجم والشكل والشحنة على قدرات الخلايا البلعمية في امتصاص الفنون النانوية والاحتفاظ بها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع الفنون النانوية باستخدام تقنيات التجانس بالطحن الرطب والمعالجة بالموجات فوق الصوتية. وتعد هذه طرقاً فعالة لتصنيع الجسيمات النانوية المضادة للفيروسات القهقرية.

يُستخدم الطحن الرطب والتجانس لتجزئة جزيئات البلورات الدوائية الكبيرة إلى جسيمات نانوية أصغر ضمن خافضات توتر سطحي دهنية، بينما تنتج تقنية سونيكاتيون قطيرات دوائية فردية بحجم نانوي ضمن بوليمر. وقد استعرضنا هنا أيضاً كيفية استخدام البلاعم المشتقة من الوحيدات البشرية كمنصة اختبار لتقييم نقل الجسيمات النانوية. وتتيح طريقتنا في الاختبار إجراء فحص بسيط للغاية لقدرة الجسيمات على الامتصاص والاحتفاظ بها وإطلاقها بواسطة الخلايا، بالإضافة إلى قدرتها على تثبيط التكاثر الفيروسي.

يتيح ذلك للباحث تحديد الفنون النانوية التي قد تكون لها أفضل فرصة للنجاح داخل الجسم الحي، وفي نهاية المطاف لاستخدامها في البشر المصابين. نُشرت النتائج الكاملة لهذه التجارب في مقالنا Online Nano. المقال بعنوان Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics في مجلة Journal of Neuro Immune Pharmacology لعام 2010.

شكراً جزيلاً لك.