أساليب التنمية للنقل الدم البلاعم التي تنقلها من العقاقير المضادة للفيروسات Nanoformulated

الهدف من هذا الإجراء هو تصنيع واختبار الامتصاص الخلوي، والإفراز، والخصائص المضادة للفيروسات القهقرية لجسيمات نانوية بلورية مضادة للفيروسات القهقرية، والتي نشير إليها باسم nano art. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق معالجة الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية باستخدام التجانس بالموجات فوق الصوتية، أو الطحن الرطب. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في توصيف الخصائص الفيزيائية لجسيمات nano art بعد عزل الخلايا الوحيدة الأولية عن طريق الطرد المركزي بالتضاد.

يتم استنباتها لمدة سبعة أيام في وسط DMEM المحتوي على عامل تحفيز مستعمرات البلاعم، أو MCSF، والذي يحفز تمايزها إلى بلاعم مشتقة من الخلايا الوحيدة. وتتمثل الخطوة الثالثة في اختبار امتصاص nano art واحتجازه وإطلاقه في البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة البشرية. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي اختبار الفعالية المضادة للفيروسات القهقرية لـ nano art في المختبر في البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر تسهيل امتصاص nano art وإطلاقه ببطء من الخلايا، بالإضافة إلى فعالية قوية كمضاد للفيروسات القهقرية. ويتم تحديد ذلك من خلال قياس مستويات الدواء باستخدام تقنية الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC)، ومن خلال اختبار مواد الرائق من المزارع المصابة عبر قياس نشاط إنزيم reverse transcriptase. مرحباً، أنا Hanta Aldi، باحثة في مرحلة ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتور Howard Gelman في المركز الطبي بجامعة Nebraska.

يمكن للطرق التي نعرضها أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في الطب النانوي، بما في ذلك كيفية استخدام أنظمة إيصال الأدوية القائمة على الخلايا لتطوير أنشطة البحوث الانتقالية. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام العلاج المضاد للفيروسات القهقرية بصيغة نانوية ذات عمر نصف ممتد. وتدعم دراساتنا إمكانية استخدام العلاج المضاد للفيروسات القهقرية النانوي (nano art) في الاستخدام السريري.

مرحباً، اسمي آري نوشي، وأنا طالب وباحث في برنامج MD PhD أعمل في مختبر كارول شواتز لعلوم الأعصاب الناشئة. تحت إشراف الدكتور جيندلمان، تمتد تطبيقات التقنيات التي نعرضها لكم هنا إلى العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية، لأن المركبات المصاغة نانوياً يمكنها تحسين التوافر الحيوي والحركية الدوائية في آن واحد، مع تقليل الآثار الجانبية المرتبطة بالأدوية. ومن خلال أخذ الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية المتاحة سريرياً وإعادة تعبئتها في جسيمات نانوية، قد نتمكن من تحسين الامتثال العلاجي والتأثير إيجاباً على نتائج المرض.

مرحباً، أنا الدكتور هوارد جيندلمان. أنا عالم إكلينيكي وأستاذ ورئيس قسم الصيدلة وعلم الأعصاب التجريبي هنا في المركز الطبي بجامعة نبراسكا. هدفنا العام هو تبسيط الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية لجعلها متاحة بسهولة وتحسين التوزيع الحيوي والحركية الدوائية.

أترككم الآن مع آري وشون اللذين سينقلانكم إلى مختبر الأبحاث ليوضحا لكم كيفية تصنيع وتطوير هذه الجسيمات النانوية. الفائدة السريرية والتطوير هنا في المركز الطبي بجامعة نبراسكا لتصنيع nano art عبر الطحن الرطب. أولاً، يتم وزن بلورات الدواء ومختلف المواد الخافضة للتوتر السطحي التي ستُستخدم لتحضير التركيبات النانوية وخلطها مع heis buffer بتركيز 10 millimolar وpH 7.8 باستخدام خلاط T 18 ultra Turx حتى تتشتت تماماً، ويجب أن تكون نسبة الدواء في التركيبة بين 1% و2% لعملية الطحن المستمر.

تأكد من تشغيل المبرد والضاغط ومن أن ضغط المخرج يبلغ حوالي 100 PSI، ثم قم بإعداد الجهاز بحيث يمكن تحميل وسائط الطحن في الخزان وأضف 50 milliliters من الخرز إلى غرفة الطحن. وباستخدام قمع، تأكد من عدم وجود خرز في أسنان اللولب أو في أي مكان خارج غرفة الطحن لتجنب حدوث تسريبات في السدادة الميكانيكية. الآن، تأكد من أن الحلقة الدائرية O-ring في مكانها الصحيح على غرفة الطحن.

بعد ذلك، اختر حجماً مناسباً لشبكة الغربال وثبّت الأغطية عن طريق شد الصواميل. يجب أن يكون حجم شبكة الغربال نصف حجم الخرز على الأقل. استخدم شبكة غربال ذات حجم كبير لتجنب انسداد المرشح بالمنتج أثناء عملية الطحن المستمر.

بعد خفض غرفة الطحن، أضف معلق الدواء الذي يحتوي على كميات متنوعة من المواد الخافضة للتوتر السطحي إلى مدخل المنتج. يجب ألا يقل الحجم الأدنى للمعلق عن 100 milliliters. سيؤدي ذلك إلى منع ارتفاع درجة حرارة غرفة الطحن، كما يتجنب تلوث الخرز نتيجة تقليل تآكل الأجزاء.

بعد ذلك، ابدأ بتشغيل المضخة. وباستخدام وحدة التحكم، قم بتغيير معدل التدفق وفقاً لما تتطلبه تركيبتك. ثم قم بتشغيل جهاز التقليب واضبط السرعة من خلال وحدة التحكم.

يمكن زيادة السرعة من 600 دورة في الدقيقة إلى 4,320 دورة في الدقيقة. في حالة استخدام micro sur، راقب درجة الحرارة باستخدام مقياس الحرارة المثبت أعلى غرفة الطحن للتأكد من عدم حدوث ارتفاع مفرط في درجة الحرارة. الآن، قم بطحن العينة بسرعات ومعدلات تدفق مختلفة، واسحب كميات صغيرة (aliquots) تبلغ حوالي 1 مل من التركيبة لقياس الحجم والشحنة باستخدام جهاز malvern zeta sizer لتشتت الضوء بالحيود.

بعد الحصول على الحجم المطلوب، أوقف عملية الطحن باستخدام وحدة التحكم، ومع استمرار تشغيل المضخة، اجمع العينة في دورق، مع السماح للدواء بالتصريف الكامل. تذكر إيقاف تشغيل المضخة عند الانتهاء، ثم قم بإزالة الخرز وتنظيفه. الآن انقل معلق الطحن إلى أنابيب طرد مركزي سعة 50 milliliter واضبط جهاز الطرد المركزي على 10,000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.

عند اكتمال دورة الطرد المركزي، قم بقياس كمية الراسب واستبدالها بنفس الكمية من محلول خافض للتوتر السطحي حديث. وبمجرد اكتمال عملية إعادة التعليق، انقل المعلق إلى غرفة الطحن وقم بالطحن لمدة 10 دقائق. خذ عينة بحجم مل واحد تقريباً وقم بقياس حجم وشحنة العينة مرة أخرى باستخدام جهاز Zeta sizer.

وأخيراً، قم بقياس تركيز تركيبات الفن النانوي باستخدام HPLC لتصنيع الفن النانوي عبر التجانس. وباستخدام جهاز Avastin Emulex C five، قم بتحضير بلورات الدواء والمواد الخافضة للتوتر السطحي المختلفة كما تم وصفه سابقاً، وانقل المعلق إلى وعاء التجانس وابدأ عملية إعادة التدوير. تأكد من تشغيل المبرد قبل البدء في تجانس العينة.

قم بزيادة الضغط تدريجياً حتى يقرأ المقياس 20,000 ± 2000 PSI واستمر في التجانس حتى يتم الوصول إلى حجم الجسيمات المستهدف. يستغرق هذا عادةً ما بين 45 إلى 60 دقيقة. خذ عينة من Eloqua بحجم ملليمتر واحد تقريباً بشكل دوري، وقم بقياس حجم وشحنة العينة باستخدام جهاز zeta sizer centrifuge، وذلك للتعليق المتجانس كما تم وصفه سابقاً.

بعد ذلك، وبعد تعليق Resus، انقل المعلق إلى جهاز التجانس C five. أعد تشغيل الدورة وأعد ضغط التجانس إلى 20,000 ± 2000 PSI وقم بالتجانس لمدة 30 دقيقة للتصنيع عبر الموجات فوق الصوتية باستخدام معالج Palmer ultrasonic البارد. صب محلول PLGA والكلورو ميثان والدواء في محلول خافض للتوتر السطحي PVA بنسبة 1% وضعه في حمام ثلجي داخل جهاز الموجات فوق الصوتية.

ابدأ عملية السونيكة بـ 50%amplitude، علماً بأنه يمكن خفض سعة السونيكة إلى حوالي 30%amplitude للدفعات الصغيرة من العينات، وقم بمعالجة العينة بالسونيكة لمدة 10 دقائق. خذ كمية صغيرة (aliquot) لتحليل حجم الجسيمات. إذا كان حجم الجسيمات أكبر من 1.5 microns، استمر في معالجة العينات بالسونيكة على فترات زمنية مدتها دقيقتان حتى تصل إلى 16 دقائق كحد أقصى في المجمل.

افحص العينات تحت المجهر بقوة تكبير 20 مرة ودوّن الملاحظات. استخدم لوح تحريك لإنشاء دوامة مناسبة للمعلق واستمر في الخلط طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. اجمع المعلق بعد 24 ساعة واسكبه في أنابيب طرد مركزي سعة 50 milliliter.

قم بطرد العينات مركزياً بسرعة 8,000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 5 °C، ثم اسحب السائل الطافي وأعد تعليق نصف العينة في 75 milliliters من مياه التناضح العكسي المفلترة، والنصف الآخر في 75 milliliters من خافض التوتر السطحي 0.5%Ctal trimethyl ammonium bromide. اطرد العينات مركزياً مرة أخرى بسرعة 8,000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 5 °C، وأعد تعليق كل من الرواسب في إجمالي 20 milliliters من محلول المانيتول. وأخيراً، بالنسبة للجزيئات المصنعة إما عن طريق التجانس أو المعالجة بالموجات فوق الصوتية، قم بقياس حجم الجزيئات باستخدام zeta sizer وقياس تركيز العينات باستخدام HPLC.

للتحضير للتصوير المجهري، خذ معلقات الفن النانوي المُحضرة وعرضها للموجات فوق الصوتية لمدة 10 ثوانٍ. وباستخدام مسبار سونيكات بمدى سعة 20%، خذ شريحة غطاء مجهرية وضعها على مجهر مقلوب. وعلى شريحة الغطاء.

امزج 15 µL من معلق الفن النانوي مع 100 µL من محلول ملحي منظم بالفوسفات، واخلطهما عن طريق السحب والطرد بالممصّة لعدة مرات. بعد ذلك، قم بفحص الجسيمات النانوية باستخدام عدسة شيئية بقوة تكبير 20x لمعاينة المورفولوجيا. كما يمكن تحضير العينات للفحص باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.

نرى هنا صوراً تم الحصول عليها باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح بانبعاث مجال منخفض الجهد A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F بعد عزل الخلايا الوحيدة المنقولة بالدم عن طريق الطرد المركزي، حيث وُضعت الخلايا الوحيدة المنقاة بتركيز 1×10⁶ خلية/mL في وسط DMEM مدعم بالإضافات التالية. بعد ذلك، يتم توزيع 2×10⁶ خلية لكل بئر في أطباق ذات ستة آبار ضمن بيئة رطبة، مدعمة بـ 5% carbon dioxide، وتُحضن لمدة سبعة أيام للسماح للخلايا الوحيدة بالتمايز إلى خلايا بلعمية لتحليل امتصاص الخلايا وجمعها. اخلط nano art مع وسط الزرع للوصول إلى تركيز نهائي قدره 100 µM، وأضف 1 mL من وسط المعالجة إلى كل بئر في النقطة الزمنية المحددة أو عندما تكون الخلايا محملة بالكامل بـ nano art.

قم بإزالة جميع أوساط المعالجة واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 mL من PBS لإزالة أي جزيئات لم يتم امتصاصها من قبل الخلايا في 1 mL من PBS. قم بإزالة الخلايا الملتصقة من قاع البئر باستخدام رافع الخلايا (cell lifter) وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 mL. الآن قم بطرد الخلايا مركزياً عند 1000 RCF في درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق.

قم بإزالة السائل الطافي وأضف 200 µL من الميثانول بتركيز 100% لتحليل الخلايا وإذابة nano art عن طريق تعريض الراسب لموجات فوق صوتية لفترة وجيزة باستخدام مسبار سونيك بقدرة 20% amplitude لمدة تتراوح من ثانيتين إلى خمس ثوانٍ. تُحفظ العينات في درجة حرارة -80 °C حتى يحين وقت تحليل محتوى الدواء. كما يمكن تصور الاحتفاظ بـ nano art داخل الخلايا باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ بعد تحضير المقاطع بواسطة الميكروتوم كما هو موضح هنا.

راجع النص المصاحب لهذا المقال للحصول على تفاصيل تحليل تحرر الـ nano arch ومعاملة الخلايا كما تم وصفه سابقاً لتحليل امتصاص الخلايا وجمعها. ومع ذلك، بدلاً من جمع الخلايا بعد الغسيل، استبدل PBS بـ 2 mL من وسط زراعة الخلايا الخالي من MCSF والـ nano art في الأيام المحددة أو عندما يتحول لون الوسط إلى اللون الأصفر. استبدل نصف الوسط في اليوم المطلوب. اجمع 1 mL من وسط الخلايا مع الخلايا المكررة وقم بمعالجتها لتحليل الدواء.

لتصوير عملية الامتصاص في الوقت الفعلي باستخدام مجهر nano art bifocal، ابدأ أولاً بأخذ صبغة DRE مثل vibrant وإضافتها إلى الوسط الغذائي وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، ثم أضف الوسط الذي يحتوي على الصبغة إلى البلاعم الناضجة المشتقة من الخلايا الوحيدة، وبعد ذلك اشطف الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 mL من وسط الزرع لإزالة أي صبغة زائدة. الآن، امزج nano art مع وسط الزرع باستخدام nano art المسمى فلورياً، وأضف وسط المعالجة الذي يحتوي على nano art المسمى. وقبل التصوير مباشرة باستخدام المجهر البؤري (confocal microscope)، قم بالتقاط صورة كل 30 ثانية لمدة أربع ساعات باستخدام عدسة شيئية بقوة 60x.

أخيراً، يمكن إجراء اختبارات العدوى والقدرة الإعدائية لفيروس HIV-1. أولاً، تُعالج الخلايا كما هو موضح في عملية تصوير إطلاق الـ art. ثم في الأيام المحددة، يتم إزالة جميع الأوساط واستبدالها بوسط خالٍ من MCSF يحتوي على HIV-1-ΔA بتعدد عدوى يبلغ 0.01 جسيم فيروسي لكل خلية، وتُحضن لمدة 24 ساعة.

بعد ذلك، قم بإزالة الوسط الفيروسي واستبدله بفيروس جديد، واترك الخلايا المستزرعة في وسط خالٍ من الفيروس لمدة 10 أيام، مع استبدال نصف الوسط كل يومين أو حسب الضرورة للحفاظ على حيوية الخلايا بعد 10 أيام من العدوى. اجمع 10 µL من الوسط من كل بئر وضعها في طبق مكون من 96 بئراً، واحفظها في درجة حرارة -80 °C حتى يحين وقت إجراء تحليل النسخ العكسي. كما يمكن إجراء عمليات الكشف اللاحقة عن HIV-1 p24.

يمكننا هنا أن نرى بوضوح مورفولوجيا الخلايا التي تعرضت للفيروس بمعدل عدوى مضاعفة قدره 0.011 بعد يوم واحد من العلاج بـ nano art. وفي هذه البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة، لا يوجد دليل على حدوث عدوى فيروسية، بينما تظهر الجسيمات النانوية بوضوح داخل سيتوبلازم الخلية. وهنا، تم تعريض الخلايا للفيروس بعد 10 أيام من العلاج بـ nano art.

أُصيبت بعض هذه الخلايا كما يتضح من صبغة P 24 وتكون الخلايا العملاقة متعددة النوى، ولكن لا تزال هناك حماية ملحوظة مقارنة بالخلايا غير المعالجة. لاحظ أن الجسيمات النانوية لا تزال مرئية داخل سيتوبلازم الخلايا في B، ولكن ليس بنفس القدر الذي شوهد في a، وهذه الهياكل غير موجودة في الخلايا التي لم تُعالج بـ nano art. في فيديوهات المجهر البؤري للخلايا الحية هذه، نرى الخلايا البلعمية مميزة باللون الأخضر و nano art مميزة باللون الأحمر.

نرى هنا أن الخلايا تراكم عدداً قليلاً جداً من الجسيمات النانوية. أما هنا، فتراكم الخلايا الجسيمات بسرعة كما يشير إليه زيادة الفلورة الحمراء. توازي هذه الاختلافات النتائج التي تظهر عند تحليل امتصاص الدواء باستخدام HPLC، وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا رؤية الخلايا وهي تمتص الجسيمات بنشاط.

يعكس الاختلاف في معدلات تراكم الفن النانوي الخلوي تأثيرات الخصائص الفيزيائية مثل الحجم والشكل والشحنة على قدرات الخلايا البلعمية في امتصاص الفن النانوي والاحتفاظ به. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع الفن النانوي باستخدام تقنيات التجانس بالطحن الرطب والمعالجة بالموجات فوق الصوتية. وتعد هذه طرقاً فعالة لتصنيع الجسيمات النانوية المضادة للفيروسات القهقرية.

يعمل الطحن الرطب والتجانس على تجزئة جزيئات البلورات الدوائية الكبيرة إلى جسيمات نانوية أصغر داخل المواد الخافضة للتوتر السطحي الدهنية، بينما تنتج تقنية سونيكة (الموجات فوق الصوتية) قطيرات دوائية فردية بحجم النانو داخل بوليمر. كما أوضحنا هنا كيفية استخدام البلعوميات المشتقة من الخلايا الوحيدة البشرية كمنصة اختبار لتقييم نقل الجسيمات النانوية. وتسمح طريقتنا في الاختبار بإجراء مسح بسيط للغاية لقدرة الجسيمات على الامتصاص والاحتفاظ والإطلاق بواسطة الخلايا، بالإضافة إلى قدرتها على تثبيط التكاثر الفيروسي.

يتيح ذلك للباحث تحديد الفنون النانوية التي قد تكون لديها أفضل فرصة للنجاح في الجسم الحي، وفي نهاية المطاف للاستخدام في البشر المصابين. نُشرت النتائج الكاملة لهذه التجارب في مقالنا Online Nano. المقال بعنوان Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics في مجلة Journal of Neuro Immune Pharmacology عام 2010.

شكراً جزيلاً لكم.