شاشة إنتاجية عالية للنشاط Biomining سلولاز من مكتبات Metagenomic

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد السليولاز الذي يعبر عن المستنسخة من مكتبة ميتاجينومية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تكرار مكتبة ميتاجينومية تم إنشاؤها مسبقا باستخدام روبوت بعد حضانة المكتبة المكررة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. يتم قياس نمو استنساخ الإشريكية القولونية ، ثم يتم إضافة التحلل والمخزن المؤقت والركيزة إلى المكتبة المكررة.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح نشاط السليلوز من خلال قياسات امتصاص الألوان باستخدام قارئ الألواح. مرحبا ، أنا كيث من مختبر ستيفن هالام في قسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة في جامعة كولومبيا البريطانية. سنعرض لك اليوم إجراء للفحص الوظيفي عالي الإنتاجية لمكتبات الميتاجينوم.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة نشاط السليولاز الحيوي من مكتبات الميتاجينوم. لذلك دعونا نبدأ. قبل البدء في هذا البروتوكول ، قم بإعداد مكتبة ميتاجينومية مخزنة بتنسيق 384 لوحة بئر.

استخدمت هذه الدراسة ناقل SMID للتحكم في النسخ الواحدة PCC بالاشتراك مع Farge T واحد مقاوم TRANSFECT max EPI 300 T خلايا الإشريكية القولونية المقاومة كمضيف للمكتبة لبدء هذا الإجراء ، وإزالة الألواح التي تحتوي على المكتبة من 80 درجة مئوية تحت الصفر وقم بإذابة الثلج عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا. وفي الوقت نفسه ، استخدم ميزة التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية في QIX اثنين لتعقيم الروبوت لمدة 15 دقيقة. قم بإعداد Q fill three وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع زجاجة الوسائط المرفقة بالمشعب عبر برنامج الأنابيب المعقمة.

يملأ Q ثلاثة للحصول على الكمية المناسبة من الوسائط ويضبطها لملء حجم 45 ميكرولتر. في كل منها ، قم بتطهير الهواء جيدا من الأنبوب والمشعب باستخدام ميزة التطهير للروبوت حتى تصبح الوسائط مرئية. في كل دبوس من المشعب ، املأ العدد المطلوب من الألواح بوسائط LB باستخدام Q fill three.

تستغرق كل لوحة حوالي 20 ثانية لملئها. بعد ذلك ، قم بتحميل لوحات المكتبة واللوحات الجديدة في المناطق المناسبة من اختيارات Q. للروبوت ملء حمامات التنظيف مع الكواشف المناسبة.

2٪ مايكرو 90 في الحمام الخلفي ، والماء المقطر الأوتوكلاف في الحمام الأوسط ، و 80٪ الإيثانول في الحمام الأمامي. باستخدام برنامج النسخ المتماثل ل qix two ، حدد الرأس المناسب بالإضافة إلى عدد وأنواع كل من لوحات المصدر والوجهة. قم أيضا بإعداد الرأس للتنظيف بين النسخ المتماثلة.

عادة ما تكون ست دورات في كل حمام كافية. سعة الماكينة 10 لوحات في المرة الواحدة. اضبط الجهاز على التشغيل.

سيستغرق تكراره حوالي 15 دقيقة. سعة كاملة برأس 384 دبوس. بمجرد تكرار الألواح ، قم بزراعة الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في صندوق الرطوبة.

يعد وقت الحضانة الطويل ضروريا حيث يتم تحفيز عدد كبير من النسخ مع إضافة الأرابينوز. وفي الوقت نفسه ، قم بتنظيف Q ملء ثلاثة روبوتات كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. بعد الحضانة ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة 37 درجة مئوية.

ضع الأغطية جانبا وضع الألواح على منصة تحميل المجلة المزودة بالمكدس السريع. تأكد من تتبع ترتيب اللوحات لأن البرنامج لا يفعل ذلك. ستتم قراءة اللوحات الموجودة أسفل المكدس.

أولا ، قم بإزالة مجلة واحدة من المكدس السريع. تأكد من أنها فارغة وادفعها إلى كومة اللوحات المراد قراءتها. أمسك المجلة من المقبض ويجب تحميل اللوحة في المجلة.

قم بتحميل المجلة في المكدس السريع في الاتجاه الصحيح. افتح برنامج إعادة الفحص الخاص به على الكمبيوتر المتصل. حدد جلسة جديدة وقم بتسميتها بشكل مناسب.

اختر استدعاء لوحة البئر المسطحة 384 كلوحة. اكتب في منطقة تخطيط اللوحة. حدد زر المعالج واختره لإضافة 384 مجهول إلى اللوحة.

في منطقة البروتوكول ، حدد خيار حلقة البئر وأدخل ل 384 بئرا. ستظهر أيقونة حلقة البئر في شجرة التدفق على الجانب الأيسر من الشاشة. حدد الرمز وانقر لإضافة قياس ضوئي.

اضبطه على القراءة عند 600 نانومتر. احفظ البروتوكول باسم فريد وأغلق برنامج إعادة الفحص الخاص به. ثم افتح برنامج polara RS.

يوجد في الصفحة الرئيسية جدول يسرد الأدوات المتصلة بجهاز المكدس السريع تحت عنوان فحص VARI ، انقر فوق خيار جلسة التشغيل. يجب أن تظهر نافذة الفحص بعد ذلك مع مخطط انسيابي في المنتصف. حدد عنصر جلسة التشغيل، ثم ابحث عن اسم الفحص المحفوظ.

إعادة تشغيله في القائمة المنسدلة التي تظهر على الجانب الأيمن من الشاشة. بمجرد تحديد البروتوكول، انقر فوق تشغيل. سيظهر مربع في هذا الفحص يسأل عن المجلة التي يجب استخدامها كمصدر والمجلة الفارغة.

يتوافق المربع السفلي على الشاشة مع المجلة الأمامية zine. تأكد من تشغيل كل من المكدس السريع وفحص Vario وانقر فوق ابدأ. سيقوم المكدس السريع تلقائيا بتحميل الألواح في قارئ اللوحة مما يسمح بقياسات مستمرة للألواح.

راقب تحميل اللوحة الأولى في فحص Vario لضمان المحاذاة المناسبة للآلات المراد قراءتها. تستغرق 25 لوحة حوالي 50 دقيقة. بمجرد الانتهاء من فحص Barrios ، قم بإزالة المجلة الكاملة وضعها على منصة تحميل المجلة.

ارفع المستطيل الخارجي للمنصة ويجب أن تنزلق المجلة ، تاركة الألواح تقف في كومة في المنتصف. أخيرا ، استبدل الأغطية الموجودة على الألواح للحصول على شاشة قائمة على المحلول. لنشاط السليلوز أولا ، قم بإعداد مزيج الفحص باستخدام مخزون 10 مرات من التحلل.

امزج 50 ملليمولار من أسيتات البوتاسيوم عند درجة الحموضة 5.5 كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ثم قم بإعداد مخزون يصل إلى 75 ملليغرام لكل مليلتر ، أو ركيزة مبيدات حيوية ثنائي الفينيل الكروموجينيك أو DNP في DMSO ، مع التأكد من إذابة الركيزة بالكامل. أضف محلول مخزون المبيدات الحيوية لخلايا DNP إلى مزيج الفحص إلى التركيز النهائي البالغ 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر.

ضع في اعتبارك أن كل لوحة تستخدم ما يقرب من 20 مل من المحلول وأن 50 مل إضافية ضرورية للسماح بالحجم الميت. قم بإعداد Q ملء ثلاثة كما كان من قبل في مزيج الفحص لكل لوحة باستخدام Q ملء ثلاثة. تستغرق كل لوحة حوالي 20 ثانية لملئها.

بمجرد إضافة مزيج الفحص ، احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة. في صندوق الرطوبة ، قم بإزالة الألواح من حاضنة 37 درجة مئوية. ضع الأغطية جانبا وضع الألواح على منصة تحميل المجلة المزودة بالمكدس السريع بنفس الطريقة السابقة.

افتح برنامج إعادة المسح الضوئي الخاص به وقم بإعداده كما تم سابقا باستثناء القياس الضوئي ، والذي يجب ضبطه على القراءة عند 400 نانومتر. ثم أدخل المعلمات في برنامج POLARA RS. كما اتضح سابقا.

اسمح لمسح Vario بقراءة اللوحات. بعد التشغيل ، قم بإزالة الألواح والتخلص منها. لتصدير قراءات الامتصاص المفتوحة ، قم بمسحها ضوئيا واختيارها.

افتح ملفا موجودا. حدد الدليل حيث تم حفظ الجلسة واضغط على أيقونة علامة الجمع لتوسيع القائمة. تحت عنوان العنوان ستكون هناك خيارات تسمى حاوية واحدة إلى حاوية N.اعتمادا على عدد اللوحات ، حدد اللوحة الأولى ليتم تحليلها في شريط القائمة أعلى الصفحة ، وحدد تصدير تقرير البيانات.

اختر خيارات للتصدير مثل تخطيط اللوحة والبيانات الضوئية. انقر على عرض التقرير، ثم حفظ الملف. اختر الدليل المطلوب.

تنسيق الإخراج هو جدول بيانات Microsoft Excel. هنا ، قراءات الامتصاص من 384 واحد. تظهر لوحة البئر التي تحتوي على استنساخ إيجابي كما هو موضح ، تظهر المستنسخة الإيجابية زيادة ملحوظة في الامتصاص مقارنة بالحيوانات المستنسخة التي لا تعبر عن نشاط السليولاز.

أن تؤثر الاختلافات في وقت الفحص ، حسنا ، الموقع على اللوحة أو تركيز DNP على قراءات الامتصاص المطلق. تعد قراءات الامتصاص النسبي مثل الاختلاف في الامتصاص فوق متوسط اللوحة أو متوسط العمود طريقة أكثر قوة لتحديد المستنسخة الإيجابية للسليلاز. لقد أوضحنا لك للتو كيفية التعرف على المستنسخة الإيجابية للسليولاز من مكتبة ميتاجينومية.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إذابة الجانب الحيوي لخلية DNP في DMSO واحتضان أطباقك في غرفة الرطوبة. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.