تحديد آثار الطفرات BRCA1 على التوحد باستخدام خلايا متماثلة التي تعبر عن الذاتية وحشية من نوع BRCA1

الهدف العام من التجربة التالية هو اختبار متغيرات محددة في بروتين BRCA1 باستخدام مقايسة إعادة التركيب المتماثل في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق استبدال بروتين BRCA1 البري الداخلي بالمتغير المراد اختباره من خلال ترنسفكشن لكل من الـ RNA المتداخل القصير، الخاص بـ BRCA1، وبلازميد لإعادة التعبير عن بروتينات متغير BRCA1 المختبرة في الخلايا؛ وفي خطوة ثانية، يتم ترنسفكشن الـ RNA المتداخل القصير وبلازميد التعبير عن BRCA1 الطافر، بالإضافة إلى بلازميد للتعبير عن بروتين I SCE1، الذي يسبب تلفاً في الحمض النووي عند موقع محدد في جينوم DNA للخلية المختبرة. بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا لمدة يومين إلى ثلاثة أيام للسماح بحدوث تلف DNA وإصلاحه، وتُستخلص النتائج التي توضح ما إذا كانت متغيرات بروتينية محددة من بروتين BRCA1 تعمل في إصلاح DNA عن طريق إعادة التركيب المتماثل، وذلك استناداً إلى تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا التي تعبر عن GFP.

تجمع هذه التقنية بين طريقتين معتمدتين لإنشاء نظام متعدد الاستخدامات لتحليل متغيرات بروتينية محددة في عملية إصلاح تلف DNA عن طريق إعادة الاندماج المتماثل. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أن الطرق المعتمدة سابقاً كانت تعتمد على خطوط خلوية تعاني من تعطيل جيني لبروتين BRCA1. أما نحن، فنستخدم خطاً خلوياً أكثر سهولة في التعامل مشتقاً من خلايا HELOC، وهو ما يسمح باستنزاف BRCA1 عن طريق تداخل RNA للبروتين الداخلي، ثم إعادة إضافة البروتين المختبر في هذه الخلايا.

بعد التعبير عن بروتين BRC1 متغاير، يمكننا الآن اختبار إعادة الاتحاد المتماثل. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب الموت الخلوي المفرط أثناء الإجراء. ومن المهم ضبط ظروف القطع بدقة لتحقيق أقصى تأثير لتفاعل إعادة الاتحاد مع الحد من السمية الخلوية.

قبل البدء في هذا البروتوكول، تم إنشاء الخط الخلوي hela DR 13 عن طريق ترانزفيكشن خلايا hela باستخدام P-D-R-G-F-P. يتم الحفاظ على الخط الخلوي في أطباق بتري مقاس 10 سنتيمتر في وسط يحتوي على pur mycin لاختيار الخلايا التي تم نقل الجينات إليها بشكل مستقر. تحتوي ركيزة إعادة التركيب في بلازميد P-D-R-G-F-P وفي المتحولات المستقرة على أليلين غير نشطين من GFP. أحد الأليلين غير نشط بسبب إدراج موقع تعرف لإنزيم التقييد مكون من 18 زوجاً قاعدياً لـ ISCE one.

في تسلسله التشفيري، يؤدي التعبير عن ISCE one في هذه الخلايا إلى إحداث كسر مزدوج السلسلة في الحمض النووي (DSB) في الأليل الثاني من GFP غير النشط. ويكون الجزء من تسلسله المرتبط بموقع I SCE E one في الأليل الأول من النوع البري. ويمكن لهذا الأليل الثاني من GFP أن يعمل كمانح للتسلسل لعملية إصلاح الكسر مزدوج السلسلة عن طريق إعادة الاتحاد المتماثل، مما يؤدي إلى تكوين أليل GFP نشط، والذي يمكن اكتشافه بسهولة بواسطة قياس التدفق الخلوي في اليوم السابق لعملية عفن الخلايا الأولى.

احصل على طبق بقطر 10 سنتيمتر من خلايا hela DR 13 تكون درجة تلاقيها 90% على الأقل. قم بهضم الخلايا باستخدام التريبسين في 1 ملليلتر لمدة تتراوح من دقيقتين إلى ثلاث دقائق. أوقف التفاعل بإضافة 9 ملليلتر من D-M-E-M-F-B-S وامزج معلق الخلايا جيداً باستخدام الماصة. أضف 40 ميكروليتراً من الخلايا المهضومة بالتريبسين لكل بئر في طبق يحتوي على 24 بئراً في 0.5 ملليلتر من D-M-E-M-F-B-S. حضّن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل.

في اليوم الأول، يجب أن تكون الخلايا في حالة تلاقي تتراوح بين 40 و 50%. ابدأ عملية التعداء عن طريق خلط كل من irna لاستنزاف B RCA 1 الداخلي والبلازميد المعبر عن B RCA 1 الطافر في وسط optimum. بعد ذلك، ادمج الأحماض النووية مع lip في وسط optimum.

باشر عملية عفن الليبكتومي (lipectomy transfection) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة بعد عملية عفن الخلايا. أعد الخلايا إلى الحاضنة. استبدل الوسط الغذائي بعد مرور أربع إلى ست ساعات بوسط لا يحتوي على مضادات حيوية.

أعد الخلايا للحضانة طوال الليل في اليوم الثاني. يتم فصل الخلايا باستخدام التريبسين عن طريق إضافة 0.3 milliliters من كاشف t-r-y-p l-e t-r-y-p-s-i-n إلى كل بئر؛ وبعد فترة حضانة قصيرة عند 37 °C، يتم تحرير الخلايا عن طريق سحبها ودفعها بالماصة داخل كاشف التريبسين. وبمجرد إتمام عملية التريبسين، يتم نقل الخلايا من الطبق ذي الـ 24 بئراً إلى طبق ذي 6 آبار يحتوي على 2 milliliters من D-M-E-M-F-B-S لإيقاف نشاط التريبسين.

اترك طبق الستة آبار ليتخضن طوال الليل تحت نفس الظروف السابقة، وذلك قبل يومين من عملية عفن التحول الأولي. قم بتحضير SIR A، وDNA البلازميد المعبر عن طفرة BRCA one، والبلازميد المعبر عن ISCE one في 62.5 µL من Optum. اخلط هذا المحلول مع 2.5 µL من LIPECTOMY 2060 و2.5 µL من Optum.

باشر بعملية عفن الخلايا (transfection) بعد فترة حضانة تتراوح من أربع إلى ست ساعات. استبدل الوسط الغذائي بوسط D-M-E-M-F-P-S الخالي من المضادات الحيوية. أعد الخلايا إلى الحاضنة في اليوم السادس.

قم بهضم الخلايا في كل بئر عن طريق إضافة 0.5 milliliters من كاشف trypsin. أوقف التفاعل بإضافة 2 milliliters من D-M-E-M-F-B-S، ثم اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في 1 milliliter من D-M-E-M-F-B-S الطازج، ثم قم بتحليل 10,000 خلية لكل بئر للكشف عن تعبير GFP.

باستخدام قياس التدفق الخلوي، يتم فرز الخلايا الحية المفردة باستخدام معاملات التشتت الأمامي والحجمي. وتُوجَّه الخلايا الموجبة لـ GFP باستخدام كاشف الفلورية الخاص بـ GFP، وتُعرض النتائج على شكل مدرج تكراري. ويمكن إعادة زراعة الخلايا المتبقية لغرض التصوير بالفلورية.

ينظم بروتين BRCA1 المسار الخاص بإصلاح كسور الحمض النووي DNA مزدوج الشريط عن طريق إعادة الاندماج المتماثل. ويمكن الكشف بسهولة عن الخلايا التي خضعت للإصلاح بواسطة إعادة الاندماج المتماثل باستخدام المجهر الفلوري. ويؤدي استنفاد BRCA1 عن طريق تداخل الحمض النووي الريبي RNAi إلى انخفاض حاد في عدد الخلايا الموجبة لـ GFP التي يتم الكشف عنها.

تكون مخرجات تحليل التدفق الخلوي (FCA) على شكل مدرج تكراري يوضح كثافة GFP لكل خلية على المحور السيني وعدد الخلايا على المحور الصادي. في حالة عدم وجود بلازميد تعبيري منقول، لا يتم اكتشاف أي خلايا موجبة لـ GFP.

تم الحصول على النتائج في الأعمدة من الثاني إلى السادس جميعها من خلايا تم ترانسفكشن البلازميد المعبر عن I SCE 1 فيها في اليوم الثالث. وفي مجموعة نموذجية من نتائج تجربة واحدة، كانت 15.5% من الخلايا موجبة لـ GFP بعد تعبير I SCE 1 واستنفاد RNAi الضابط لجين غير ذي صلة؛ وبالمقارنة، أدى استنفاد BRCA 1 وإضافة ناقل بلازميد فارغ إلى خفض تحول GFP إلى 0.7%. بينما أدت إضافة BRCA 1 البري الخارجي إلى استعادة إعادة الاندماج المتماثل بالكامل، كما تم الكشف عن ذلك من خلال الحصول على 15 إلى 16% من الخلايا الموجبة لـ GFP.

وبالمثل، فإن التعبير عن متغير آخر غير محدد الأهمية. لقد استعاد طفرة BRCA1 21B الوظيفة بالكامل. أما بالنسبة لوظيفة إعادة الاندماج المتماثل المعتمدة على BRCA1، فإن إضافة طفرة BRCA1 M18T كان لها تأثير مماثل للمتحكم الناقل.

بما أن هذا المتغير قد تم التعبير عنه بمستويات مماثلة للبروتين الداخلي، فإن ذلك يشير إلى أن المتغير BRCA one M 18 T غير فعال في عملية إعادة الاندماج المتماثل. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر مراقبة نمو الخلايا، حيث تنمو الخلايا ببطء وبكثافة منخفضة، لذا يجب تقليل كمية خليط عفن الخلايا (transfection mixture) المستخدمة. كما أنه من الضروري إزالة وسط عفن الخلايا في الوقت المناسب.

وجدنا أنه في الأيام التي تلي عملية عفن التحول (transfection)، تظهر درجة عالية من السمية الخلوية في حال إضافة المضادات الحيوية إلى الوسط. لهذا السبب، تخلو جميع الأوساط من المضادات الحيوية بعد اليوم الأول من تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث سرطان الثدي لاستكشاف وراثيات متغيرات BRC one ذات الأهمية السريرية غير المعروفة في عيادات السرطان.

نأمل أن يساهم اختبار BRC one الوظيفي الذي تم تطويره في هذا العمل في تحسين التنبؤ بتأثيرات متغيرات BRC one على التأهب للإصابة بالسرطان.