تحديد آثار الطفرات BRCA1 على التوحد باستخدام خلايا متماثلة التي تعبر عن الذاتية وحشية من نوع BRCA1

الهدف العام من التجربة التالية هو اختبار متغيرات محددة في بروتين BRCA واحد باستخدام اختبار إعادة التركيب المتماثل في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق استبدال بروتين BRCA واحد من النوع البري الداخلي مع المتغير الذي يتم اختباره من خلال تعدي كل من الحمض النووي الريبي المتداخل القصير ، الخاص ب BRCA one والبلازميد لإعادة التعبير عن اختبار البروتينات المتغيرة BRCA في الخلايا كخطوة ثانية ، يتم استئصال الحمض النووي الريبي المتداخل القصير والبلازميد للتعبير عن BRCA المتحور واحد RET بالإضافة إلى بلازميد للتعبير عن بروتين ISCE واحد ، مما يسبب تلف الحمض النووي في موقع معين في جينوم الحمض النووي لخلية الاختبار. بعد ذلك ، يتم تحضين الخلايا لمدة يومين إلى ثلاثة أيام من أجل السماح بحدوث تلف الحمض النووي وإصلاحه ، يتم الحصول على نتائج توضح ما إذا كانت متغيرات بروتينية معينة من بروتين BRCA واحد تعمل في إصلاح الحمض النووي عن طريق إعادة التركيب المتماثل بناء على تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا التي تعبر عن GFP.

تجمع هذه التقنية بين طريقتين راسختين من أجل إنشاء نظام متعدد الاستخدامات لتحليل متغيرات بروتينية معينة في إصلاح تلف الحمض النووي عن طريق إعادة التركيب المتماثل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أن الأساليب التي تم إنشاؤها سابقا تعتمد على خطوط الخلايا التي كان لها ضربة قاضية وراثية من BRCA one. نحن نستخدم خط خلوي أكثر قابلية للإدارة مشتق من خلايا HELOC التي تمكن BRC من استنفاد واحد عن طريق تداخل الحمض النووي الريبي للبروتين الداخلي وإضافة بروتين الاختبار في هذه الخلايا.

الآن نعبر عن بروتين BRC واحد متغير يمكننا اختباره لإعادة التركيب المتماثل. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب الموت المفرط للخلايا أثناء العملية. من المهم أن يكون لديك حالة استئصال محددة بعناية لزيادة تأثير تفاعل إعادة التركيب مع الحد من السمية الخلوية.

قبل بدء هذا البروتوكول ، تم إنشاء خط الخلايا التسعة hela DR 13 عن طريق نقل خلايا hela باستخدام P-D-R-G-F-P حافظ على خط الخلية على أطباق بتري 10 سم في pur mycin لاختيار الخلايا المنقولة بثبات. تحتوي ركيزة إعادة التركيب في بلازميد P-D-R-G-F-P وفي المحولات المستقرة على أليلين غير نشطين من GFP. أليل واحد غير نشط بسبب إدراج موقع التعرف على إنزيم تقييد الزوج الأساسي المكون من 18 لمعيار ISCE واحد.

في تسلسل الترميز الخاص به ، يخلق تعبير ISCE واحدا في هذه الخلايا كسر DNA مزدوج تقطعت به السبل أو DSB على الأليل الثاني من GFP غير النشط. جزء تسلسله المرتبط بموقع I SCE E على الأليل الأول هو نوع بري. يمكن أن يعمل هذا الأليل الثاني GFP كمانح تسلسل لإصلاح إعادة التركيب المتماثل ل DSP وسيؤدي إلى أليل GFP نشط ، والذي يتم اكتشافه بسهولة عن طريق قياس التدفق الخلوي في اليوم السابق للتعداء الأول.

احصل على طبق 10 سم من hela DR 13 تسع خلايا تتمثل في 90٪ على الأقل من التربسين المتقارب ، وتعين الخلايا في مليلتر واحد لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. أوقف التفاعل بإضافة تسعة ملليلتر من D-M-E-M-F-B-S واخلط معلق الخلية جيدا عن طريق سحب العينات. أضف 40 ميكرولترا من الخلايا المدخلة لكل بئر من صفيحة 24 بئر في 0.5 مل من D-M-E-M-F-B-S تحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها.

في اليوم الأول ، يجب أن تكون الخلايا بين 40 و 50٪ ملتقية. ابدأ التعداء عن طريق خلط كل من irna لاستنفاد ب RCA واحد و B RCA واحد متحور يعبر عن البلازميد في الوسط الأمثل. ثم امزج الأحماض النووية مع الشفة في الوسائط المثلى.

استمر في تعداء استئصال الدهون وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بعد التعداد. أعد الخلايا للاحتضان. استبدل الوسائط بعد أربع إلى ست ساعات بوسيط لا يحتوي على مضادات حيوية.

أعد الخلايا لتحتضن طوال الليل في اليوم الثاني. التربسين هي الخلايا عن طريق إضافة 0.3 مل من كاشف التربسين إلى كل بئر بعد حضانة قصيرة عند 37 درجة مئوية ، قم بفك الخلايا عن طريق سحب الخلايا لأعلى ولأسفل في كاشف التربسين. بمجرد أن يتم نقل التربسين ، تنقل الخلايا من صفيحة 24 بئر إلى صفيحة بستة آبار تحتوي على ملليلترين من D-M-E-M-F-B-S لوقف نشاط التريبسين.

اسمح للوحة الآبار الستة بالتحتضن طوال الليل في نفس الظروف كما كانت قبل يومين من التعدي الأولي. قم بإعداد SIR A ، وهو BRCA واحد متحور يعبر عن الحمض النووي للبلازما و ISCE الذي يعبر عن البلازميد في 62.5 ميكرولتر من Optum. امزج هذا المحلول مع 2.5 ميكرولتر من استئصال الدهون 2060 2.5 ميكرولتر من Optum.

استمر في نقل الخلايا بعد حضانة من أربع إلى ست ساعات. استبدل الوسائط ب D-M-E-M-F-P-S التي تفتقر إلى المضادات الحيوية. أعد الخلايا إلى الحاضنة في اليوم السادس.

التربسين هو الخلايا الموجودة في كل بئر عن طريق إضافة 0.5 مل من كاشف التربسين Trip. أوقف التفاعل بإضافة ملليلترين من D-M-E-M-F-B-S لجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من D-M-E-M-F-B-S الطازج قم بتحليل 10،000 خلية لكل بئر لتعبير GFP.

عن طريق قياس التدفق الخلوي ، يتم بوابات الخلايا الحية المفردة باستخدام معلمات متناثرة للأمام والحجم. يتم توجيه الخلايا الإيجابية ل GFP باستخدام كاشف مضان GFP ويتم تقديم النتائج كرسم بياني. يمكن إعادة طلاء الخلايا المتبقية للتصوير الفوتوغرافي عن طريق التألق.

ينظم الفحص المجهري ل BRCA المرغوب المسار لإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بهم السبل عن طريق إعادة التركيب المتماثل. يتم اكتشاف تلك الخلايا التي خضعت للإصلاح عن طريق إعادة التركيب المتماثل بسهولة عن طريق المجهر الفلوري. يؤدي استنفاد BRCA one بواسطة RNAi إلى انخفاض حاد في الخلايا الإيجابية GFP المكتشفة.

الإخراج من FCA هو رسم بياني بكثافة GFP لكل خلية على المحور x وعدد الخلايا على المحور Y. في حالة عدم وجود transfected ، أنا SCE واحد يعبر عن البلازميد. لم يتم اكتشاف خلايا إيجابية GFP.

تم أخذ جميع النتائج في الأعمدة من اثنين إلى ستة من الخلايا التي تم فيها نقل ISC واحد يعبر عن البلازميد في اليوم الثالث. في مجموعة نموذجية من النتائج من تجربة واحدة ، 15.5٪ من الخلايا إيجابية GFP بعد I SCE تعبير واحد والتحكم في استنفاد RNAi لجين غير ذي صلة عن طريق المقارنة استنفاد BRCA واحد وإضافة ناقل البلازميد الفارغ. تقليل تحويل GFP إلى 0.7٪ إضافة BRCA من النوع البري الخارجي ، إعادة التركيب المتماثل المستعاد بالكامل كما تم اكتشافه من خلال الحصول على 15 إلى 16٪ خلايا إيجابية GFP.

وبالمثل ، التعبير عن متغير آخر غير معروف الأهمية. تم استعادة طفرة BRCA one I 21 B بالكامل. BRCA واحدة تابعة وظيفة إعادة التركيب المتماثل إضافة مرة أخرى من BRCA واحد M 18 T كان له تأثير مماثل للتحكم في النواقل.

نظرا لأن هذا المتغير يتم التعبير عنه بمستويات مماثلة للبروتين الداخلي ، فإنه يشير إلى أن متغير BRCA one M 18 T غير وظيفي في إعادة التركيب المتماثل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مراقبة نمو الخلايا ، وأن الخلايا تنمو ببطء وبطلاقة منخفضة ويجب تقليل كمية خليط التعدي المستخدمة. من المهم أيضا إزالة وسيط التعداء في الوقت المناسب.

نجد أنه في الأيام التي تلي التعدي ، هناك قدر كبير من السمية الخلوية إذا تم تضمين المضادات الحيوية في الوسط. لهذا السبب ، كل الوسائط بعد اليوم الأول تفتقر إلى المضادات الحيوية بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث سرطان الثدي لاستكشاف علم الوراثة لمتغيرات BRC one ذات الأهمية السريرية غير المعروفة في عيادات السرطان.

نأمل أن يمكن اختبار BRC الوظيفي الذي تم تطويره في هذا العمل من تحسين التنبؤ بتأثيرات متغيرات BRC one على الاستعداد للسرطان.