تنقية DNA البلازميد من المستعمرات البكتيرية باستخدام Miniprep Qiagen كيت

أنا من مختبر مايك هيلن بقسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية في جامعة كاليفورنيا، إيرفاين. سأوضح لكم اليوم كيفية استخدام collagen mini fabricate لتنقية DNA من البكتيريا. أقوم بهذا كإحدى خطوات تجربة الطفرات الموجهة للموقع.

بعد الحصول على البلازميد، سأقوم بإجراء تسلسل للقسيمة المدرجة للتحقق من أن المستعمرات المختارة تحتوي على الطفرات المطلوبة. وقبل البدء في عملية التحضير المصغر (mini preparation)، سأقوم بتقديم شرح موجز لما قمنا به بالأمس. ومن أجل تنمية البكتيريا، أحتاج أولاً إلى تلقيح 5 mL من وسط LB في أنابيب منفصلة.

وكما ترون، يكون الوسط صافياً قبل وضع البكتيريا في الأنبوب. بعد ذلك، أستخدم الماصة لنقل مستعمرة واحدة من طبق الآجار، مع تغيير الرأس في كل مرة لتجنب التلوث. ثم أضع الأنابيب في جهاز هزاز بسرعة 300 RPM للنمو لمدة ثماني ساعات على الأقل، وعادة ما نتركها تنمو طوال الليل.

توجد ثلاث محاليل منظمة مهمة في مجموعة تحضير الكولاجين المصغرة، وهي P one وP two وN three. عادةً ما نحفظ P one عند درجة حرارة 4 °C لأنه يحتوي على RNAs، بينما نترك P two في درجة حرارة الغرفة، أما بالنسبة لـ N three فسنقوم بتبريده قبل بدء التجربة بثماني ساعات.

كما تلاحظون، أصبح الوسط الآن عكراً بسبب نمو البكتيريا بداخله، وسأقوم بنقل 5 µL من الوسط إلى طبق آخر. وبمجرد التحقق من المستنسخات، يمكنني العودة مباشرة إلى البكتيريا دون الحاجة إلى إجراء عملية تحول أخرى. بعد طرد الوسط مركزياً، يمكنكم رؤية كتلة بكتيرية واضحة في قاع الأنبوب، وسنقوم بسحب السائل الطافي ونقله إلى مبيض لضمان عدم حدوث أي تلوث في البيئة المحيطة مع بقاء الكتلة البكتيرية في مكانها.

سأقوم الآن بإضافة المنظم P1 إلى أقراص البكتيريا. المنظم P1 هو منظم إعادة التعليق لإعادة تعليق البكتيريا. والآن سأقوم بسحب المحلول وإطلاقه بالماصة صعوداً وهبوطاً لخلط البكتيريا مع المنظم.

في هذه المرحلة، يجب ألا تظهر أي كتل بكتيرية في المحلول. سأقوم الآن بنقل البكتيريا المعاد تعليقها إلى أنبوب Eppendorf جديد. أقوم دائمًا بتمييز الأنابيب الخاصة بي حتى أتمكن من تتبعها ومعرفة المحلول الناتج عن كل مستعمرة.

الآن قمت بإضافة المنظم P2 إلى كل أنبوب، والمنظم P2 هو منظم تحليل يُستخدم لتحليل البكتيريا. بعد إضافة المنظم P2، يمكن ملاحظة أن المحلول لا يزال غير رائق. سأقوم الآن بقلب جميع الأنابيب عدة مرات لضمان خلط المحلول جيداً.

والآن يمكنكم ملاحظة أن المحلول أصبح رائقاً. سأقوم الآن بإضافة buffer N three إلى كل أنبوب، حيث أن buffer M three هو محلول معادلة. وبمجرد إضافة buffer N three، ألاحظ فوراً ترسب البروتين، ومع ذلك سأستمر في قلب الأنابيب عدة مرات لخلط المحلول جيداً.

بعد خلط المحلول جيداً، يكون هذا هو المظهر المتوقع بعد إضافة المحلول المنظم (buffer) رقم ثلاثة. سأستخدم الآن جهاز الطرد المركزي لترسيب البروتينات عن طريق الدوران لمدة 10 دقائق، حيث قمت بتجميع أنبوب Cal VAC 6 s.

قمت بتجميع كافة القطع بالترتيب ثم وصلتها بنظام تفريغ. والآن أضيف وسيلة تحضير المعايرة، والحزام إلى المجمع. سنقوم بتنفيذ واحدة فقط اليوم، لذا سأقوم بسد الفتحات الأخرى.

لقد حصلنا على تفريغ هوائي جيد. كما تلاحظون، قمت بتمييز الشريط وفقاً للأنابيب الخاصة بي، وبمجرد تشغيل مضخة التفريغ أحصل على تفريغ جيد. حسناً، بعد تدوير الأنبوب بجهاز الطرد المركزي، يمكنك رؤية كتلة البروتين في القاع، بينما يجب أن يظل الـ DNA ذائباً في السائل العلوي.

الآن نقوم بنقل السائل الطافي العلوي، الذي يحتوي على DNA، إلى شرائط تحضير Cow؛ ويجب أن أشير إلى أننا نحتاج دائماً إلى تغيير الرؤوس لتجنب التلوث الخلطي. الآن أقوم بتشغيل المكنسة الكهربائية. والآن أقوم بإيقاف تشغيل المكنسة الكهربائية وإضافة المنظم PB لغسل الشريط، الذي يحتوي حالياً على DNA في المرشح.

أقوم الآن بإضافة المحلول PB إلى الشريط لغسله، بينما لا يزال الشريط يحتوي على DNA في المرشح. في هذه المرحلة، لا أحتاج إلى تغيير الرؤوس إذا لم ألمس الشريط. والآن، أضيف المنظم p إلى الشريط بنفس الطريقة التي اتبعتها مع المنظم pb.

وسأقوم بتكرار هذه العملية مرتين بعد تشغيل المكنسة الكهربائية. وكما تلاحظون، فإن محلول P يمر الآن عبر الشريط، وسنترك المكنسة الكهربائية تعمل لمدة خمس دقائق أخرى للتأكد من جفاف المرشح تماماً. بعد مرور خمس دقائق من الشفط، أخرج الشريط من الصندوق ثم لفه بمناديل Kimwipe، واضربه برفق على الطاولة لإزالة بقايا محلول P المنظم.

والآن يمكنك أن ترى أنه لم تتبقَ سوى قطرات قليلة من P buffer، ويجب أن يظل الـ DNA في المرشح. هذه هي أنابيب جمع العينات الدقيقة، وقد قمت بتسميتها وفقًا للشريط.

أقوم الآن بفتح جهاز الشفط الخاص بالسيارة وإعادة تجميعه مع أنابيب التجميع الدقيقة، وأتأكد من مطابقة الشريط مع الأنابيب الدقيقة. هذا هو الشكل الذي يجب أن يبدو عليه المجمع الآن. إليكم نظرة على مجمع الشفط، الذي تم تجهيزه لاستخلاص DNA من الشريط إلى الأنبوب الدقيق.

توضع الشريحة في الأعلى والأنبوب تحتها مباشرة، ويتم وضع العلامات عليهما بنفس الطريقة. الآن، أضف الماء المعقم إلى الشريحة بدون تفريغ هوائي واتركها لمدة دقيقة. هذه المرة، عندما يطول تفريغ الهواء، كما ترى، يمر الماء عبر الشريحة وينتقل إلى أنابيب التجميع الدقيقة.

يحتوي الماء على الـ DNA. كما أترك جهاز التفريغ يعمل لفترة من الوقت للتأكد من جمع كل الماء. إليكم أنابيب الجمع الدقيقة التي تحتوي على محلول الـ DNA بعد هذه الخطوة.

مرحباً، لقد أوضحتُ لكم للتو كيفية استخدام طقم استخلاص الحمض النووي المصغر بالكالسيوم (calcium mini prep kit) لتنقية الـ DNA من البكتيريا. الآن، سأقوم بتسلسل القطعة المدرجة (insert) للتحقق من المستنسخات الصحيحة، ويجب أن أشير إلى استخدام هذه الطريقة. عادةً ما تكون كمية الـ DNA في حدود الميكروجرام.

مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم. شكراً للمشاهدة.