استخدام الري بالتنقيط وتدفق مفاعلات الأقراص الدوارة ل المكورات العنقودية الذهبية التحليل بيوفيلم

الهدف العام من هذا الإجراء هو زراعة الأغشية الحيوية البكتيرية تحت قوة منخفضة أو معتدلة باستخدام مفاعل غشاء حيوي بتدفق بالتنقيط أو مفاعل قرص دوار. تتفاعل القسائم الموجودة في الأغشية الحيوية كما يتم تلقيحها أولا بالبكتيريا وتحضنها عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا البكتيرية بالالتصاق بأسطح النمو. بمجرد أن تلتصق الخلايا بالقسائم ، يبدأ تدفق وسائط النمو في إنتاج قوة هائلة تعمل أثناء تطوير الأغشية الحيوية.

يمكن بعد ذلك حصاد الأغشية الحيوية الناضجة لتحليل الأغشية الحيوية ومراقبتها. يمكن إجراء المجهر الإلكتروني باستخدام المسح لتحديد البنية الفائقة للأغشية الحيوية المنتجة. أنا كرات اللهب.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل خلايا التدفق هي أن إنتاج الكتلة الحيوية العالية والأغشية الحيوية المتطابقة المتعددة يمكن تحقيقها بسهولة. ستظهر هذا الإجراء راشيل ستيفنسون وكيلي شوارتز ، وهي فنية وطالبة دراسات عليا من مختبري. يتكون مفاعل الأغشية الحيوية للتدفق بالتنقيط من أربع غرف مع منافذ إدخال لدخول الوسائط ومنافذ التدفق الخارج للخروج من النفايات.

يوجد داخل كل غرفة قسيمة قابلة للإزالة ينمو عليها الأغشية الحيوية. لتجميع مفاعل الأغشية الحيوية لتدفق التنقيط ، ضع القسائم في كل غرفة متوازية وقم بتأمين أغطية الغرفة. قم بالتعقيم في المفاعل المجمع بالإضافة إلى أنابيب المغذيات بطلاقة لتعقيم النظام قبل الاستخدام.

أيضا الأوتوكلاف وسط نمو الأغشية الحيوية لتلقيح مفاعل تدفق التنقيط المعقم. ضع الجهاز على سطح مستو وقم بتثبيت خطوط النفايات السائلة. بعد ذلك ، املأ كل غرفة ب 10 ملليلتر من وسط النمو المعقم القائم على مرق الصويا ثلاثي الحروف ، وأضف 100 ميكرولتر من المكورات العنقودية الذهبية.

نمت الثقافة بين عشية وضحاها في نفس الوسط لكل غرفة على حدة. ضع المفاعل الملقح في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة للسماح للخلايا بالالتصاق بسطح القسيمة. بعد الحضانة ، تقوم UNC بتثبيت أنابيب النفايات السائلة ووضع المفاعل على قاطع كتلة خشبية منحدر بزاوية 10 درجات. معقم.

قم بتوصيل أنبوب المغذيات بطلاقة بزجاجة تحتوي على مرق مغذي مستمر التدفق. قم بتغذية خط الأنبوب من خلال المضخة وقم بتجهيز الأنبوب عن طريق تشغيل المضخة بأقصى سرعة. بمجرد تحضير الأنبوب بطلاقة ، أوقف المضخة وقم بتوصيل إبر قياس 22 بوصة واحدة في نهاية كل أنبوب.

امسح سدادة مدخل الغرفة بمنديل من الإيثانول وبشكل معقم. أدخل الإبر من خلال سدادة المدخل. قم بتشغيل المضخة واترك الوسط يتساقط فوق القسائم.

بمعدل تدفق يبلغ حوالي 125 ميكرولتر في الدقيقة ، يجب أن تتدفق الوسائط لأسفل من منفذ سدادة المدخل إلى منفذ النفايات السائلة. قم بتشغيل المفاعل في تدفق مستمر لمدة ثلاثة أيام. فحص المفاعل من حين لآخر بحثا عن الصرف المناسب.

يتم فحص الصرف عن طريق الفحص البصري للغرف للتأكد من عدم تجمع الوسائط في الغرف. إذا كانت الوسائط تتجمع ، تقرص ، فعادة ما تعزز أنابيب التدفق الخارج الصرف المناسب لحصاد الأغشية الحيوية ، وإيقاف المضخة وإزالة الإبر من المفاعل. ثم ضع المفاعل على سطح مستو.

بعد ثلاثة أيام من التدفق المستمر ، تظهر الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية الذهبية ككتلة حيوية صفراء تنتشر على طول القسائم الملقحة. يكشف تصوير مجهر إلكتروني ماسح للأغشية الحيوية عن المكورات العنقودية الذهبية التي تغطي القسيمة في مجتمع الأغشية الحيوية المرتبط بالسطح. من أجل تحديد كمية الكتلة الحيوية التي تم الحصول عليها ، استخدم ملقطا معقما لإزالة القسائم ، وحصاد البكتيريا باستخدام مكشطة الخلية ، ثم نقلها إلى أنبوب مخروطي يحتوي على خمسة ملليلتر من PBS المعقم.

باستخدام الأنسجة ، يقوم الخالط بتقسيم الكتل البكتيرية حتى يتم الحصول على تعليق موحد. يتم تحديد وحدات تشكيل المستعمرة عن طريق طلاء التخفيفات التسلسلية على ألواح سوغار ثلاثية الأجزاء تحتضن لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية وعد المستعمرات. يتكون مفاعل الأغشية الحيوية للقرص الدوار من إحصائيات كيميائية يتم من خلالها ضخ وسط النمو.

قرص دوار مع شريط نجمة و 18 قسيمة مصممة لتناسب قرص الغزل. لتجميع المفاعل أولا ، قم بتحميل كوبونات قرص الغزل في فتحات قرص الغزل. بعد ذلك ، ضع القرص المحمل داخل دورق زجاجي سعة لتر واحد مع منفذ فائض وقم بتغطية المفاعل بسدادة مطاطية رقم 15 مع فتحة واحدة لتدفق الوسائط وثقب واحد للتهوية.

الأوتوكلاف والمفاعل المجمع وأنابيب المدخل لتعقيم النظام. لتلقيح المفاعل ، املأ الدورق ب 250 مل من وسط الاستزراع المعقم وأضف 500 ميكرولتر من ثقافة المكورات العنقودية الذهبية الليلية المزروعة في مرق الصويا الثلاثي. ضع المفاعل على لوح تقليب مضبوطا على 250 دورة في الدقيقة واحتضنه طوال الليل عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالالتصاق بالقسائم.

بعد الحضانة الليلية ، قم بتوصيل أنبوب المدخل بالمنفذ الموجود على الخزان المتوسط والمضخة التمعجية. قم بتشغيل المضخة واضبط التدفق على 0.25 مل في الدقيقة. اسمح للمفاعل بالعمل لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية لحصاد الأغشية الحيوية الناتجة.

أوقف المفاعل ومعقما. قم بإزالة القرص دون لمس القسائم. باستخدام ملقط معقم ، قم بإزالة القسائم واغمس كل واحدة بعناية في PBS معقم لإزالة البكتيريا المرتبطة بشكل فضفاض لاختبار المركبات المضادة للميكروبات.

بشكل معقم ، ضع القسائم في آبار فردية من لوحة بئر 96 تحتوي على مركبات ذات أهمية. احتضان الطبق لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية. ثم انقل القسائم إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مليلتر تحتوي على PBS مرة واحدة وتفريق الأغشية الحيوية باستخدام الخالط.

أخيرا ، التخفيفات التسلسلية للخلايا على وسط أجار المغذيات لتحديد عدد وحدات تشكيل المستعمرة القابلة للحياة لكل عينة كما هو موضح سابقا. يوضح هذا الرسم البياني عدد وحدات تشكيل المستعمرات في الأغشية الحيوية المحضرة باستخدام مفاعل القرص الدوار والمعرضة لبيروكسيد الهيدروجين ، والقدرة على إنتاج ما يصل إلى 18 طبقة حيوية متطابقة. إن استخدام مفاعل القرص الدوار يجعل هذه التقنية مثالية لاختبار المركبات المضادة للميكروبات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشغيل التدفق بالتنقيط والأغشية الحيوية لمفاعل القرص الدوار. توفر مفاعلات الأغشية الحيوية هذه بدائل للأغشية الحيوية لخلايا التدفق وألواح الميكروتيتر ، وهي مثالية عند الحاجة إلى كمية كبيرة من الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية أو اختبار مضادات الميكروبات على الأغشية الحيوية القائمة.