الطاقة البيولوجية التجربة الملف باستخدام الخلايا Myoblast C2C12

الهدف العام من التجربة التالية هو اختبار الحالة الوظيفية للميتوكوندريا في الخلايا الحية والميتوكوندريا المعزولة عن طريق قياس بارامترات متعددة للأيض التأكسدي باستخدام محلل التدفق خارج الخلوي XF 96. وتتمثل هذه البارامترات في التنفس الأساسي، ودوران ATP، وتسرب البروتونات، والتنفس الأقصى أو السعة التنفسية الاحتياطية. ويتم تحقيق ذلك من خلال الإضافة المتسلسلة لمعدلات محددة للتنفس الميتوكوندري إلى خلايا C two C 12 العضلية الأولية، وقياس التغير في معدل استهلاك الأكسجين، أو OAR، وهو مؤشر على التنفس، وتحول الجلوكوز إلى لاكتات، وهو ما يولد ATP من خلال تحلل السكر.

يتم قياس مسار الطاقة الرئيسي الآخر في الخلايا أيضًا على أنه ECAR أو معدل التحمض خارج الخلية. ويمكن الحصول على نتائج توصيف الميتوكوندريا التي توفر رؤية حول الدور المركزي الذي تلعبه وظيفة الميتوكوندريا في تحديد عمر الخلايا. مرحبًا، اسمي ديفيد نيكولز.

لقد كنت متخصصاً في دراسة الميتوكوندريا طوال مسيرتي المهنية، وكان أهم جهاز استخدمته في دراساتي هو قطب الأكسجين. فإذا تمكنت من قياس معدل استهلاك الأكسجين في ظروف مختلفة باستخدام ميتوكوندريا معزولة، فستحصل على معلومات هامة للغاية. ولكن عند الانتقال إلى الخلايا، وخاصة الخلايا المستزرعة في أطباق متعددة الفجوات أو على شرائح غطاء مجهرية، فإن الطرق التقليدية لا تكون مجدية.

تعد هذه مشكلة رئيسية، تم التغلب عليها قبل بضع سنوات من خلال تطوير مقايسة باستخدام أطباق متعددة الآبار، مما مكننا من دراسة تنفس الخلايا بالتوازي في تنسيق أطباق متعددة الآبار. ما ستشاهدونه اليوم هو تجربة بسيطة للغاية ولكنها غنية بالمعلومات، قمنا بتصميمها من أجل مراقبة الوظيفة الحيوية الأساسية للميتوكوندريا في الخلايا المستزرعة. للبدء، قم بزراعة الخلايا في أطباق زراعة الخلايا XF 96 بمعدل 10,000 خلية لكل بئر في 100 µL من وسط النمو، وضعها في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C مع 10% carbon dioxide.

يمكن إجراء تحليل الخلايا في جهاز XF 96 بعد 24 ساعة من الاستزراع باستخدام المقايسة. يقوم معالج المقايسة (Assay Wizard) بإنشاء نموذج بتخطيط المجموعات التالي: تحتوي الأعمدة من 1 إلى 12 جميعها على 10,000 خلية من نوع C2C12.

تُستخدم المجموعة الأولى باللون الأزرق كخلايا ضابطة. أما المجموعة الثانية باللون الأحمر، فسيتم إعطاؤها من العقاقير oligo Mycin وFCCP وroone. بعد ذلك، قم بتحضير المركبات في وسط مقايسة X-F-D-M-E-M كما هو موضح في الجزء المكتوب من البروتوكول.

يتم تحضير مركبات Oligo Mycin و FCCP و rotenone مسبقاً في مجموعة اختبار XF cell MIT stress test. وباستخدام محطة تحضير XF، استبدل وسط النمو بوسط التشغيل DMEM.

أخيرًا، يتم تحضين الخلايا في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C بدون ثاني أكسيد الكربون لمدة 60 دقيقة للسماح للخلايا بالوصول إلى حالة التوازن المسبق مع وسط المقايسة قبل إضافة المركبات القابلة للحقن إلى خرطوشة المستشعر، مع تدفئة المركبات حتى تصل درجة حرارتها إلى 37 °C. ثم يتم تحميلها في منافذ الحقن على النحو التالي: بالنسبة للأعمدة من واحد إلى أربعة، يتم تحميل 16 و 18 و 20 µL من وسط مقايسة XF أو DMEM في المنافذ A و B و C على التوالي.

بالنسبة للأعمدة من 5 إلى 12، قم بتحميل 16 µL من alliga mycin في المنفذ A، و18 µL من FCCP في المنفذ B، و20 µL من rot known في المنفذ C. بعد ذلك، حدد أوامر البروتوكول بضبط التكرار (loop) على ثلاث مرات، والخلط (Mix) لمدة ثلاث دقائق، والقياس (measure) لمدة ثلاث دقائق. وأخيرًا، انقر على بدء (start).

اتبع التعليمات التي ستظهر على الشاشة والتي ستوجه المستخدم إلى موعد تحميل الخرطوشة عند اكتمال المعايرة. اتبع مطالبات المستخدم وأضف لوحة الخلايا الخاصة بالتجربة. بعد ذلك، انقر فوق متابعة واسمح ببدء تشغيل المقايسة.

قم بإزالة الطبق عند انتهاء التجربة. يُشتق هذا المقايسة من التجربة الكلاسيكية لتوصيف الوظيفة الميتوكوندرية، وتعمل كإطار عمل لبناء تجارب أكثر تعقيداً تهدف إلى فهم تأثيرات المركبات المختلفة على عملية التمثيل الغذائي الخلوي، والوظيفة الميتوكوندرية، والأنشطة الحيوية الطاقية العامة. لقد لاحظنا هنا الاستجابة المتوقعة في معدل استهلاك الأكسجين عند معالجة الخلايا بكل سلسلة من المركبات.

بالنسبة لـ liga Mycin، انخفض Oard نتيجة لمنع تخليق TP عند المعقد الميتوكوندري الخامس. وبما أن الخلايا كانت غير قادرة على تخليق TP عبر الفسفرة التأكسدية بعد المعالجة بـ liga mycin، فقد عادت إلى تحلل السكر لتلبية حاجتها من TP. وبناءً على ذلك، لاحظنا زيادة في ECAR، وهو معدل التحمض خارج الخلية، والذي يعد مؤشراً على تحلل السكر كما تم توضيحه سابقاً. يعمل FCCP كعامل فك اقتران ويزيل القيد المفروض على إعادة دخول البروتونات.

يتسارع التنفس ويصبح الآن محدوداً بنقل الإلكترونات. وأخيراً، يعمل الـ rote known على تثبيط المعقد الميتوكوندري الأول، مما يؤدي إلى توقف تدفق الإلكترونات في سلسلة نقل الإلكترونات، وبالتالي انخفض استهلاك الأكسجين بشكل حاد. ومن هنا يتم الحصول على معلومات حول التنفس الأساسي للخلايا، والنسبة المئوية لاستهلاك الأكسجين المخصص لإنتاج الـ TP، بالإضافة إلى الكمية المخصصة للحفاظ على تدرج البروتون الناتج عن تسرب البروتون.

علاوة على ذلك، يمكننا الحصول على أقصى معدل للتنفس في ظل ظروف التنفس غير المقترن، وهو ما يشار إليه أحياناً بالسعة التنفسية الاحتياطية. وأخيراً، يمكننا تحديد كمية استهلاك الأكسجين التي لا تعود إلى العمليات الميتوكوندرية. لقد رأيتم ذلك للتو باستخدام جهاز seahorse.

تعتبر XF 96 سلسلة من التجارب التي توفر قدرًا هائلًا من المعلومات حول طاقة التركيب الحيوي الإلكتروني (BIE) للميتوكوندريا في الخلية. وتمنحك التجربة الأساسية، والتي تكتسب أهمية بالغة ونسميها التجربة رقم واحد، معلومات حول التنفس الأساسي، ومعدل دوران الـ ATP، وتسرب البروتونات الميتوكوندري، والقدرة التنفسية الاحتياطية. وتوفر هذه المعايير هذه المعلومات الجوهرية حول حالة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في الخلية.