وهو أداة تحليلية للعلبة التقييم الشامل الكيمياء الحيوية ، والهيكلية والأغشية الحيوية عن طريق الفم من Transcriptome بوساطة العقديات الطافرة

الأغشية الحيوية المتكونة على أسطح الأسنان معقدة للغاية ومنظمة. المجتمعات الميكروبية المتشابكة في مصفوفة خارج الخلية ، والتي تتعرض لتحديات بيئية مستمرة. الهدف العام هنا هو إظهار مكونين محددين لصندوق أدوات تحليلي مصمم لتسهيل الدراسات الهيكلية والجزيئية ، مع الأخذ في الاعتبار الطبيعة المعقدة للأغشية الحيوية عن طريق الفم من خلال الجمع بين تقنية تصوير مضان جديدة وبرامج مخصصة لمعالجة البيانات وتحليلها.

يتم تحقيق ذلك عن طريق اختيار فحوصات محددة أولا للأغشية الحيوية والنسخ وتحليل الهيكل ، بما في ذلك نهج تصوير متحد البؤر جديد للتصور المتزامن ل EPS والبكتيريا. الخطوة الثانية من الإجراء هي جمع البيانات الأولية من المقايسات الحيوية. تتمثل الخطوة الثالثة في معالجة البيانات الأولية باستخدام برنامج محدد ، بما في ذلك إحصائيات الثنائي المطورة حديثا لتحليل التوطين المشترك.

تتمثل الخطوة الأخيرة في تحليل بيانات العملية ، بما في ذلك استخدام التنقيب عن البيانات الدقيقة وبرامج التنظيم microarray أو متخيل البيانات أو MDV. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح كيف تغير مسببات الأمراض عن طريق الفم نسخها وبنية الأغشية الحيوية استجابة لنظام غذائي معقد ، وتستضيف التفاعلات الميكروبية باستخدام صندوق الأدوات التحليلية المتكامل بشكل فريد ، مما يوفر تحليلا أكثر شمولا للأغشية الحيوية وتفسيرا للبيانات. مرحبا ، اسمي ميشيل كوه ، أستاذة مشاركة في المركز ، علم الأحياء فورال هنا في مركز يونيفرسال أوف روتشستر الطبي.

اليوم ، نقدم مجموعة أدوات تحليلية لتحليل الأغشية الحيوية. يمكن أن يساعد صندوق الأدوات هذا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث الأغشية الحيوية مثل كيفية هيكلة خلايا الأغشية الحيوية وترتيبها مع مصفوفة خارج الخلية وكيف تستجيب للتحديات البيئية المعقدة على مستوى النسخ. اسمي جان ، هي ، أنا زميل ما بعد الدكتوراه في مختبر Dr.Ks.

اليوم سأعرض جزء التصوير من صندوق الأدوات الخاص بنا. مرحبا ، أنا آيس كلاين. أنا أستاذ مساعد باحث في مختبر Dr.Ks.

اليوم ، سأقدم برنامج MDV لتحليل بيانات الأشعة الدقيقة. في هذا الإجراء ، يتم استخدام أقراص شهية الهيدروكسي المغلفة باللعاب كبدائل لسطح الأسنان تزرع عليها الأغشية الحيوية. أولا ، أضف 2.8 مل من وسط الاستزراع الملقح بطفرات S في كل بئر من صفيحة 24 بئر تحمي اللوحة من الضوء عند صبغة LOR 6 47 المترافقة مع دكسترين إلى كل بئر إلى تركيز نهائي من ميكرومولار واحد وماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لخلط الصبغة في وسط الاستزراع.

بعد ذلك ، باستخدام ملقط معقم ، اغسل أقراص هيدروكسيباتيت المطلية باللعاب المعقم مرتين في عازلة AB معقمة لإزالة أي لعاب زائد أو مكونات لعابية غير مرتبطة. ثم ضع الأقراص عموديا في وسط الثقافة المكملة بالصبغة ، مع التأكد من غمر كل قرص بالكامل. قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة 20 ساعة للسماح للأغشية الحيوية بالتشكل ودمج الملمس المترافق في السكريات الخارجية التي تنتجها الخلايا البكتيرية.

لتسمية الخلايا البكتيرية أولا ، قم بإعداد صفيحة 24 بئرا مع 2.8 مل من الماء المعقم لكل بئر. أضف 1.5 ميكرولتر من صبغة cyto nine إلى كل بئر إلى تركيز نهائي من ميكرومولار واحد وحماية اللوحة من الضوء. بمجرد تكوين الأغشية الحيوية ، قم بإزالة اللوحة التي تحتوي على الأقراص من تراجع الحاضنة.

اغسل كل قرص في محلول 0.89٪ كلوريد الصوديوم. ثم انقلها إلى اللوحة الجديدة التي تحتوي على صبغة cyto nine. غطي الطبق بورق الألمنيوم واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد تلطيخ الخلايا ، اغسل الأغشية الحيوية وكلوريد الصوديوم كما كان من قبل. ثم باستخدام الملقط ، قم بتحرير الأغشية الحيوية من السلك إلى طبق بتري يحتوي على كلوريد الصوديوم. لف طبق بتري بورق الألمنيوم.

الأغشية الحيوية جاهزة الآن للتصور عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام مجهر متحد البؤر بالمسح بالليزر. امسح كل غشاء حيوي في خمسة إلى 10 مواضع مختارة عشوائيا وقم بإنشاء سلسلة Z في كل موضع. للسماح بإعادة البناء ثلاثية الأبعاد، افتح الصور متحدة البؤر وقم بمعالجتها باستخدام برنامج مرآة.

يظهر هذا العرض ثلاثي الأبعاد للصور متحدة البؤر التي تم إنتاجها باستخدام البرنامج ، أميرة غشاء حيوي للطفرات S تشكلت على السطح اللامبالاثي باستخدام الإجراء المظهر. تظهر الخلايا البكتيرية والمستعمرات الدقيقة باللون الأخضر وهي مدمجة في مصفوفة الأغشية الحيوية التي تحتوي على السكريات الخارجية. باللون الأحمر ، يمكن إنشاء منظر عن قرب لمنطقة محددة ، مما يوضح العلاقة الهيكلية المحددة للبكتيريا EPS على النطاق الصغير.

استخدم برنامج الإحصائيات الثنائي لتحديد مقدار التموضع المشترك لمكونات الأغشية الحيوية المنفصلة مثل البكتيريا والسكريات الخارجية. أولا ، قم بإعداد مسار stat الثنائي المطور حديثا في الإصدار 5.1 من MATLAB وافتح مجلدات الصور التي تحتوي على صور سلسلة Z لمكوني الأغشية الحيوية. بعد ذلك ، اختر قناتين سيتم ربطهما وتحليلهما.

يجب أن يكون لمكدسات الصور أحجام بكسل متطابقة في جميع الأبعاد ونفس عدد الصور في كل مكدس. قم بتعيين الحدود لكل قناة واتبع التعليمات الموجودة في واجهة البرنامج وأدخل البيانات في ملف معالجة البيانات لتحليلها. يوضح هذا الشكل كيف يفسر المكدس الثنائي كميا العلاقة المكانية بين البكتيريا و DBS.

داخل الأغشية الحيوية ، يحسب مكدس Duo التوزيع الرأسي للبكتيريا و DPS من سطح القرص إلى مرحلة السائل كما هو موضح هنا في الخط الأخضر للبكتيريا والخط الأحمر ل EPS. كما أنه يحسب التوطين المشترك للبكتيريا و DPS عبر سمك الأغشية الحيوية. كما هو موضح في الخط الأصفر ، تظهر البيانات نسبا أعلى من EPS من البكتيريا عبر عمق الأغشية الحيوية ، وترتبط معظم الخلايا البكتيرية ب EPS ، خاصة من الطبقات الوسطى وما فوق Duo stat مع عرض ثلاثي الأبعاد يوفر فهما محسنا للتنظيم الهيكلي وتفاعل البكتيريا و DPS في الأغشية الحيوية.

من أجل ضمان الحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الأغشية الحيوية ، نوصي بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي وفقا للبروتوكول الخاص بالغشاء الحيوي الموصوف في مقال Curian KU المنشور في عام 2007. في المجلة ، يتم استخدام البروتوكولات القياسية للكيمياء الحيوية التحليلية لإعداد المصفوفات الدقيقة CD NA وفحوصات PCR الكمية في الوقت الفعلي. من أجل تسهيل تحليل مجموعات البيانات الكبيرة التي تم إنشاؤها بواسطة تجارب المصفوفات الدقيقة ، قمنا بتصميم برنامج التنقيب عن البيانات وتنظيمها ، وهو متخيل بيانات المصفوفات الدقيقة أو MDV ، وهو متاح عبر الإنترنت في www.oralgen.anl.gov.

قبل تقديم البيانات إلى MDV ، قم بإجراء تحليل إحصائي مثل اختبار T المقترن مع نموذج التباين العشوائي باستخدام برنامج أداة مصفوفة BRB المتاح عبر الإنترنت بقيمة P مقطوعة تبلغ 0.001 لمقارنة الفئات. في هذا المثال ، تم إجراء تحليل لحم الضأن ، تم إجراء الأغشية الحيوية المزروعة في ثلاثة تركيزات مميزة للسكر وأربع نقاط زمنية. تم إجراء مقارنات مزدوجة نشأت عن ثلاثة ملفات BRB شرطها 0.5٪ سكروز بالإضافة إلى 1٪ نشا مقابل 1٪ سكروز الحالة B 0.5٪ سكروز بالإضافة إلى 1٪ نشا مقابل 0.5٪ سكروز والحالة C 0.5٪ سكروز مقابل 1٪ سكروز.

تمثل هذه اللوحة عدد الجينات المكتشفة كما تم التعبير عنها بشكل تفاضلي في كل حالة ونقطة زمنية تم تقييمها من خلال مقارنة الفئة القياسية باستخدام أداة مصفوفة BRB ، مما ينتج عنه عدد كبير من الجينات المسماة بيانات BRB الأولية. لعرض MDV ، سنركز على النقطة الزمنية 30 ساعة باستخدام Excel. قم بتحويل بيانات BRB الأولية إلى ملفات نصية محدودة لعلامة التبويب MDV.

تأكد من إزالة جميع الأحرف التي تأتي مع رقم علامة تبويب موضع الجين ، على سبيل المثال في اسم SMU dot 1432 C.احذف الحرف C ، افتح MDV. افتح قائمة الملفات واختر تحديد مصدر التعليقات التوضيحية. حدد خيار الملف الثابت عند ظهور مربع حوار.

استخدم أزرار الاستعراض لاختيار الملفات التي تحتوي على تعليقات توضيحية لعلم الأنطولوجيا الجيني ومسار المسار والتصنيف الوظيفي وبيانات التصنيف الوظيفي واسم الجينات. انتقل إلى ملف وقم باستيراد كل ملف من الملفات المحولة إلى تنسيق MDV. يمثل كل ملف شرطا تجريبيا.

قارن الجينات المعبر عنها في كل حالة تجريبية A مقابل B مقابل C.In هذا المثال ، باستخدام ميزة مخطط Venn. في هذا العرض التوضيحي ، نركز على الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي والتي ترتبط بشكل فريد بتأثيرات السكروز والنشا معا. تستخدم الميزة المستندة إلى مخطط Venn لتصور عدد الجينات الفريدة والمشتركة المعبر عنها في ظل هذه الظروف المختلفة وتساعدنا في تحديد الجينات التي سيتم اختيارها لمزيد من التحليل.

هنا نختار فقط الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي والتي تكون فريدة من نوعها في الحالة A و / B ، ولكن ليس تلك المكتشفة في C كما هو موضح باللون الرمادي كما هو موضح هنا. قلل MDV بشكل كبير من العدد الإجمالي للجينات المراد تحليلها ، وفي نفس الوقت قام بتصفية الجينات غير ذات الصلة للحالة التجريبية. من قائمة الملف ، اختر خيار التصدير لحفظ البيانات.

كملفات محدودة علامات التبويب ، يمكن بعد ذلك فتح الملفات في Excel حيث يمكن تنظيم إخراج البيانات وتحويلها إلى شاشات العرض الرسومية المطلوبة. تسمح منظمة البيانات في Excel بالعرض الرسومي لإخراج MDV. يوضح هذا الرسم البياني نظرة عامة على التعبير التفاضلي للمجموعات الفرعية الوظيفية الفريدة من الجينات التي تتأثر بمزيج النشا والسكروز في مراحل متميزة من تطور الأغشية الحيوية.

التأثيرات على نسخ الطفرات S أكثر وضوحا عند 30 ساعة من تطوير الأغشية الحيوية مقارنة بالنقاط الزمنية الأخرى. ساعدنا الناتج على تحديد مجموعات فرعية وظيفية محددة بدقة من الجينات ذات الصلة بفرضية العمل الخاصة بنا ، مع الأخذ في الاعتبار التأثيرات الزمنية التي سهلت اختيار الجينات وعملية التحقق الإضافية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن أيضا إجراء طرق كيميائية حيوية وبروتينية للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما هي الاستجابات الفسيولوجية والتمثيل الغذائي المحددة للكائنات الحية داخل الأغشية الحيوية.

المؤكد أن مثل هذا التحليل الشامل والمتكامل سيساعد على فهم كيفية تعديل الأغشية الحيوية للإمراضية في التجويف الداخلي ، وهي بيئة ديناميكية ومعقدة للغاية. لمزيد من التفاصيل ، يرجى مراجعة ملف PDF المرفق بمقال الفيديو هذا.