عزل الخلايا الظهارية ماوس الجهاز التنفسي والتعرض لدخان السجائر في واجهة تجريبية الهواء السائل

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الظهارية للمجاري التنفسية من أجل دراسة التأثيرات السامة للتعرض لدخان السجائر. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح القصبات الهوائية للفئران، ثم هضم القصبات الهوائية في محلول pronase. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في جمع الخلايا الظهارية وإكثار المزرعة السائلة.

تتمثل الخطوة الثالثة في تمايز المزارع عند الواجهة الهوائية السائلة. والخطوة النهائية من الإجراء هي تعريض الخلايا الظهارية لدخان السجائر من الجانب القمي عند الواجهة الهوائية السائلة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر طبقة أحادية متمايزة تماماً من الخلايا الظهارية بواسطة مجهر التألق المناعي.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال مرض الانسداد الرئوي المزمن، مثل تأثيرات التعرض لدخان السجائر على مورفولوجيا CLIA والمؤشرات الحيوية الكيميائية لإصابة الخلايا الناجمة عن دخان السجائر. ابدأ التحضيرات لهذا الإجراء قبل يوم واحد من عملية التشريح عن طريق تحضير أوساط hams. F 12 التي تحتوي على مضادات حيوية، وأوساط hams F 12 التي تحتوي على مضادات حيوية و 20%F-B-S-M-T-E-C، والوسط الأساسي الذي يحتوي على مضادات حيوية.

قم بتحضير وسط MTEC مع 5% FBS، ومحاليل DNA's one solution، ومحاليل ريتينويك أسيد المخزنة، ووسط تكاثر MTEC وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب. قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية التي ستُستخدم في عملية التشريح في يوم التشريح نفسه. تأكد من نظافة منطقة التشريح ومن توفر جميع أدوات التشريح في متناول اليد.

قم بتعقيم كبينة زراعة الأنسجة. بعد ذلك، وبالعمل داخل كبينة زراعة الأنسجة، قم بتحضير محلول من pronase بتركيز 0.15%.

أضف 15 milligrams من pronase إلى 10 milliliters من وسط hams. F 12 الذي يحتوي على مضادات حيوية في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. يُحفظ على الثلج لحين الاستخدام.

يتم تشريح الرغامى من الفئران باستخدام الإجراءات الجراحية القياسية، ثم يتم تعقيم الأنبوب الذي يحتوي على الرغامى ووضعه في غطاء زراعة الأنسجة. انقل أنسجة الرغامى إلى طبق بتري بقطر 100 millimeter يحتوي على وسط hams F 12 مع المضادات الحيوية. استخدم ملاقط جراحية معقمة لإزالة النسيج الضام من الرغامى.

ثم انقل القصبات الهوائية النظيفة إلى طبق بتري الثاني بقطر 100 millimeter الذي يحتوي على وسط hams. F 12 مع المضادات الحيوية. استخدم مقص التشريح لقص القصبات الهوائية على طول المحور العمودي وكشف التجويف.

انقل القصبات الهوائية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter يحتوي على 10 milliliters من محلول Pronase وضعه في الثلاجة للحضن طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وأخيراً، قم بتجهيز أطباق transwell المعالجة بـ collagen one للاستخدام. وفي اليوم التالي، أضف 50 milligrams من collagen one لكل milliliter من حمض الأسيتيك بتركيز 0.02 N، ثم انقل باستخدام الماصة 1 milliliter من هذا المحلول إلى كل بئر من آبار طبق 12.

قم بتجفيف طبق الآبار جيداً. غلف الطبق بفيلم البارافين (Parafilm) واتركه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة داخل كابينة زراعة الأنسجة. في اليوم التالي.

اقلب الأنبوب الذي يحتوي على القصبات الهوائية للفئران بلطف من 10 إلى 12 مرة. ثم اترك محتويات الأنبوب تحضن لمدة إضافية تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. وبداخل غطاء زراعة الأنسجة، اسحب بواسطة الماصة 10 mL من وسط hams F 12 الذي يحتوي على مضادات حيوية في 20% FBS وأضفه إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على أنسجة القصبة الهوائية المهضومة، ثم اقلب الأنبوب 12 مرة.

بعد ذلك، اسحب بواسطة الماصة 10 milliliters من وسط hams F 12 الذي يحتوي على مضادات حيوية في 20%FBS وضعها في كل أنبوب من ثلاثة أنابيب مخروطية سعة 15 milliliter. استخدم ماصة باستير معقمة لنقل نسيج الرغامى من محلول pronase إلى الأنبوب الأول الذي يحتوي على وسط hams F 12 المدعم.

ضع محلول Pronase على الثلج، ثم أغلق الأنبوب الذي يحتوي على النسيج الرغامى بإحكام واقلبه بلطف 12 مرة للمزج. بعد ذلك، وباستخدام ماصة باستور، انقل النسيج الرغامى إلى الأنبوب المخروطي الثاني سعة 15 milliliter واقلب هذا الأنبوب 12 مرة. كرر إجراء النقل والقلب باستخدام الأنبوب المخروطي الأخير سعة 15 milliliter.

أخيراً، استخدم ماصة باستور لإزالة وأتلاف أنسجة الرغامى. بعد ذلك، استخرج محلول البروناز من الثلج واجمع ثلاثة أحجام، كل منها 15 milliliter، من وسط hams F 12 المكمل مع محلول البروناز. قم بطرد العينة مركزياً في جهاز طرد مركزي مبرد عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 minutes وبسرعة 1,400 rpm، وبعد انتهاء عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي، ثم انقل بواسطة الماصة ما يقرب من 100 إلى 200 µL من محلول DNA's 1 لكل رغامى فوق الراسب وأعد تعليقه.

قم بالتعليق عن طريق النقر الخفيف. حضن الخلايا على الثلج لمدة خمس دقائق. قم بطرد الأنبوب مركزياً بسرعة 1,400 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C وتخلص من الراشح.

بعد ذلك، يتم سحب ثمانية مليليتر من وسط MTEC الذي يحتوي على 10%FBS بواسطة الماصة وإضافتها فوق الراسب، ثم يتم إعادة تعليق الخلايا في الطبق. تُحضن الخلايا المعلقة في طبق paria عند درجة حرارة 37 °C في جو يتكون من 95% هواء و5% ثاني أكسيد الكربون لمدة تتراوح من خمس إلى ست ساعات. وتعد هذه الخطوة مرحلة اختيار سلبي لإزالة الخلايا الليفية.

بعد انتهاء فترة الحضن، يتم جمع المعلق الخلوي من طبق paria ونقله باستخدام الماصة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. بعد ذلك، يُشطف الطبق مرتين باستخدام 4 milliliter من وسط MTEC الذي يحتوي على 10%FBS. وتُنقل كلتا غسلتين إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 milliliter الذي يحتوي على المعلق الخلوي.

اسحب بماصة 1 ml من معلق الخلايا وضعه في أنبوب einor. احتفظ بهذه الحصة لتحليل الدوران الخلوي (cyto spin) وعد الخلايا باستخدام جهاز الطرد المركزي. أما أنبوب المخروط سعة 50 ml الذي يحتوي على الـ 15 ml المتبقية من معلق الخلايا، فيتم تدويره بسرعة 1,400 دورة في الدقيقة عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق.

أثناء عملية الطرد المركزي، قم بإزالة محلول الكولاجين من طبق transwell الذي تم تحضيره مسبقاً وتخلص منه. اترك الطبق ليجف تحت غطاء التدفق الصفحي لمدة خمس دقائق، ثم اغسله مرتين باستخدام PBS بعد الغسلة النهائية. قم بشفط كل سائل PBS، ثم انقل بواسطة الماصة 1.5 milliliters من وسط التكاثر إلى الحجرة القاعدية لـ trans well بعد انتهاء عملية الطرد المركزي.

تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في حجم مناسب من وسط التكاثر لتسهيل زراعة 7.5 × 10⁴ إلى 1 × 10⁵ خلية في 500 µL من المعلق لكل بئر. انقل بواسطة الماصة 500 µL من معلق الخلايا إلى السطح القمي لغشاء البولي كربونات في Insert Transwell. حضن مزارع MTEC المغمورة عند 37 °C في حضانة رطبة تحتوي على 95% هواء و 5% carbon dioxide لمدة تتراوح من 7 إلى 10 أيام مع تغيير الوسط كل يومين.

قم بقياس المقاومة عبر الخلايا الطلائية باستخدام مقياس الفواصل (intervalometer). وعندما تصل المقاومة الطلائية إلى 1000 ohms per centimeter squared وتظهر المزارع متلاحمة (confluent)، قم بتحويلها إلى مزارع ذات واجهة سائلة-هوائية (LI culture) عن طريق إزالة الوسط الغذائي القمي.

استبدل أيضاً الوسط الأساسي بوسط MTEC الأساسي الذي يحتوي على 2% من المصل الجديد وحمض الريتينويك. قم بحضن المزارع عند 37 °C و 5% carbon dioxide لمدة تتراوح من 10 إلى 14 يوماً للسماح بالتفاضل مع تغيير الأوساط كل يومين. أولاً، قم بإعداد آلة التدخين وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

سجل وزن مرشح pole flex غير مستخدم. ثم ضع المرشح في الحامل المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ والمدمج في أنبوب أخذ العينات الممتد من منفذ أخذ العينات في غرفة التدخين إلى مضخة التدفق الثابت. صِل وحدة أخذ العينات بمقياس الغاز باستخدام أنبوب تدفق خارجي عبر نظام تعريض خلية CS.

عرض الجانب القمي لمزارع transworld لدخان السجائر المتدفق من ثلاث سجائر مرجعية بحثية من نوع R four F. عرض الخلايا للدخان الناتج عن سيجارة واحدة إلى سيجارتين. عرض المزارع الضابطة لهواء الغرفة لفترة تعريض مكافئة بعد زيادة وزن أخذ عينات الغاز.

بالنسبة لمرشح ثنيات التجميع، يتم تطبيع إجمالي المادة المترسبة على المرشح بالمليغرام. وبالنسبة لإجمالي حجم الهواء الذي تم أخذ عينات منه، فإن دخان سيجارة واحدة إلى سيجارتين ينتج عادةً من 100 إلى 200 مليغرام لكل متر مكعب من TPM. بعد التعرض للسيجارة، يتم جمع الخلايا والوسط الأساسي لإجراء المزيد من التحليلات.

هذا مثال لطبقة أحادية سليمة من الخلايا الظهارية التنفسية للفأر مصبوغة لتمييز النواة والخلايا الظهارية وعلامات C. يتطلب العزل الظهاري والنمو والتمايز الناجح وجود طبقة أحادية سليمة ذات شكل مرصوف (cobblestone morphology). وتعتبر المزارع خالية أساساً من الخلايا الليفية.

تعتبر صور المجهر الإلكتروني هذه ممثلة لمزارع خلايا MTEC السليمة، وتوضح البنية الدقيقة لمختلف أنواع الخلايا ومورفولوجيا CELIA. يظهر فيديو تصوير الخلايا الحية هذا المورفولوجيا السليمة لـ C في مزارع خلايا MTEC. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الظهارية الرغامية للفئران، وتمايزها في واجهة الهواء والسائل، وتعريضها لدخان السجائر الرئيسي.