Name: استراتيجية لتحديد الطفرات دي نوفو في الاضطرابات الشائعة مثل التوحد والفصام (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: اكتشف استراتيجية تحديد الطفرات دي نوفو في الاضطرابات الشائعة مثل التوحد والفصام باستخدام تقنيات التسلسل الجيني. يوفر هذا الإطار رؤى حول الآليات الجينية للأمراض المعقدة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نحن شكرنا مصادر التمويل الجينوم كندا وكيبيك الجينوم ، وجامعة دو مونتريال وكذلك التمويل من المؤسسة الكندية للابتكار في تمويلنا &quot;المشبك لمرض&quot; المشروع (S2D).

1. اختيار الأمراض التي قد تسببها طفرات دي نوفو ويمكن للمرض الذي يتوافق مع المعايير التالية تتناسب مع الطفرة فرضية دي نوفو : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو انخفاض اللياقة البدنية الإنجابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواتر المرض مرتفعة نسبيا وثابتة على الرغم من اختلاف البيئات على نطاق واسع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يترافق هذا المرض مع التقدم في السن أعلى الأب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فشل الربط الكلاسيكي وجمعية دراسات لشرح جزءا كبيرا من وراثة المرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيانات دعم التوافق التوأم نموذجا نوفو دي. </li></ol> تحليل لاحتمال مرض شائع حيث دي نوفو الطفرات قد تساهم جزئيا في تفسير الأساس الجيني هو خطوة أولى حاسمة. 2. اختيار الحالات وعينات من الحمض النووي اختيار العينات المناسبة أمر بالغ الأهمية لنجاح تحديد الطفرات نوفو دي. لتعظيم فرصة العثور دي نوفو الطفرات ، فإننا نوصي بما يلي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الحالات مع التقدم في السن المبكرة من النمط الظاهري ، بداية حادة ، مع والديه لم تتأثر ، وكبار السن والآباء وليس لهم تاريخ العائلة الموسعة لهذا المرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار المرضى الذين يعانون من السلطات الوطنية المعينة المتوفرة كافية لإجراء الدراسة. أهمية خاصة هو توافر من الحمض النووي من مصدر الخلايا الأولية التي لم تكن تخضع لزراعة (مثل الحمض النووي DNA الدم أو اللعاب) ، </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توفر كل من الحمض النووي أولياء الأمور الحاسمة من أجل تحديد حالة انتقال الطفرة (الموروثة مقابل دي نوفو). توافر الأفواج المتضررة إضافية وعناصر طبيعية ضرورية للدراسات الجينية التحقق من مرة واحدة يتم تحديد الجينات مرشح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدير حجم العينة على أساس معدل الطفرات ، فإن كمية من الجينات لفحص وتقدير لنسبة ضئيلة من الحالات التي قد تنجم عن طفرة نوفو دي. </li></ol> 3. الجينات resequencing ؛ منهجين رئيسيين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عالية الجودة الإنتاجية المنخفضة التسلسل ويستند هذا النهج على المرشح الجينات النهج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار مرشح الجينات (ق) تحديد جينات أفضل المرشحين استنادا إلى نظام تسجيل النقاط التي بنيت في 6 المعايير الرئيسية. ثم حساب المجموع التي تتوافق مع مجموع نقاط جميع عزا باستخدام المعايير الستة المدرجة في الجدول 1. انظر مثلا من مشروعنا في الشكل 1 التوزيع المختارة وتحديد الجينات لا. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534table1.jpg" alt="الجدول 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الجدول 1"> الجدول 1. المعايير المستخدمة لاختيار مرشح الجينات <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. رسم بياني يبين توزيع الجينات مختارة ومنتقاة ليس في التسلسل في مشروعنا. حصلنا على توزيع الجينات مرتبة حسب خصائص مرشح الجينات الفرز وفقا لقيمة علاماتهم. على سبيل المثال ، كان SHANK3 NRXN1 والجينات ، واثنين من الجينات التي وجدنا طفرة دي نوفو ، على درجة 7 و 6 على التوالي (الحد الأقصى هو 12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاشعال تصميم البرمجيات من خلال استخدام Primers3 Exonprimer. الترميز فقط المنطقة وينبغي أن تكون مشمولة بما في ذلك لصق تقاطع أزواج من خارج القاعدة 50 على كل جانب من اكسون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين ظروف PCR لاختيار طق ، حجم رد الفعل ، الخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين كافة شظايا PCR </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم 5 نانوغرام من الحمض النووي المستخرج من الجينومية عينات الدم وفقا للاجراءات المتبعة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إرسالها للتسلسل ، لا مراقبة جودة المنتجات التي PCR تحميل 2 ٪ agarose هلام. عينات مختارة عشوائيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسلسل المنتجات PCR على محلل الحمض النووي على أحد حبلا. ويعتبر جزء التسلسل بنجاح إذا كان التحليل أكثر من 90 ٪ من آثار غير ممكن. هذا ينطبق على عملية غربلة واسعة النطاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكشف عن المتغيرات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أدوات لكشف والتنميط الجيني للتغيرات الجينومية مثل PolyPhred ، ومساح Polyscan الطفرة. مزيج من أدوات للكشف عن أكثر من 2 مثالية. على سبيل المثال ، وPolyPhred PolyPhred v.5 v.6 مع الإعدادات الافتراضية لا يكشف عن اختلافات نفسه. Polyscan V.3 لديها أعلى معدل طفرة ايجابية كاذبة لالنيوكلوتايد (96 ٪) وأقل لINDELs (93 ٪). ولم يتم الكشف عن PolyPhred v.6 غالبية INDELs صحيح ولكن لديها طفرة ايجابية كاذبة معدل (لINDELs) أقل من العام V.3 Polyscan (90 ٪). وينبغي أن نلغي خيار الكشف عن النيوكلوتايد Polyscan V.3 والحفاظ على حد سواء وPolyPhred PolyPhred v.5 v.6 لكشف متغير. مساح الطفرات وPolyscan أفضل للكشف عن indels. ملاحظة : يجب أن لا خيار للكشف عن الحزب الوطني الاسكتلندي تطبيقها عند استخدام Polyscan. فقط يجب أن "indel" الخيار يكون على. ولدت لPolyscan ايجابية كاذبة للكشف عن العديد من الحزب الوطني الاسكتلندي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل exonic رواية فريدة الكشف عن المتغيرات ، تأكيدها يدويا بواسطة reamplifying جزء وresequencing في المستلفت وكلا الوالدين باستخدام بادئات العكسي وإلى الأمام للقضاء على أي قطعة أثرية فنية. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسلسل كامل exome هذا النهج هو التسلسل إنتاجية عالية تستهدف غالبية الترميز مناطق الجينوم البشري. نحن الآن حاليا باستخدام هذا النهج الجديد في المختبر ، والإسراع في الكشف عن الجينات المرشحة المحتملة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النظام "SureSelect الإنسان جميع اكسون" التي تستهدف المنطقة من خلال الترميز 16000 الجينات (50 ميغابايت من الجينوم) التي صممها اجيلنت أو أي منتج آخر مشابه من قبل الآخرين مثل روش. قبل أن تأمر عدة أسر ، ينبغي أن يكون تحديد المنصات التسلسل (البورشيد مقابل الصلبة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا الالتقاط وفقا لبروتوكول اجيلنت </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسلسل المنتج على حكوماتكم منصة الجيل المقبل المتاحة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكشف عن البديل من التسلسل exome كله : العديد من الأدوات المعلوماتية الحيوية للكشف عن الاختلافات والتنميط الجيني الجينوم التسلسل من منصة الجيل المقبل من تتوفر مثل التحالف ، Bfast ، Bioscope التي من شأنها أن تؤدي المحاذاة. وبعد ذلك ستكون هناك حاجة إضافية المصب الأدوات المتاحة بحرية (على سبيل المثال SAM الأدوات ، Varscan ، Annovar) أن الدعوة وتعليم المتغيرات. البرمجيات التجارية التي تتضمن المحاذاة تسلسل ويدعو البديل والشرح وتتوفر أيضا ، مثل الجيل القادم (Softgenetics) ، بيو CLC ، وغيرها </li></ol></li></ol> 4. الجينومية المتغيرات الأولويات ثم يتم ترتيب أولويات المتغيرات المحددة للمتابعة وفقا لاحتمال يجري في دي نوفو وضارة وظيفة البروتين أو مرنا و / أو بنية. المتغير متابعة الأولويات للكشف عن البديل دي نوفو ينبغي على النحو التالي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فريد الاختلافات (لاحظ مرة واحدة في حالة واحدة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختلافات غير موجودة في والدي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتين مقطوعة الاختلافات : هراء ، مما أدى إلى انزياح الإطار indels والطفرات الربط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتوقع مغلطة والاختلاف لتكون صامتة التخريبية وظيفيا (على سبيل المثال ، تؤثر الربط مرنا). استخدام Polyphen ، فرزت والفهود من أجل التأثير على التنبؤ وظيفية للبروتين. </li></ol> إذا باستخدام التسلسل exome كله ، يمكن استخدام مجموعة من الجينات المرشحة كاستراتيجية لتحديد أولويات المتغيرات لمزيد من الدراسة. 5. التحقق من صحة الوراثية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resequence الجين بأكمله في حالات المرضى إضافية (لتحديد الطفرات المسببة الأخرى) والضوابط. وسوف تستخدم هذه العينات لتقييم مراقبة الترددات أليلية من المتغيرات ذات الأولوية. وينبغي أن يكون أي الجينات التي تحتوي على ما لا يقل عن اثنين من مختلف دي نوفو الطفرات الضارة (هراء ، الربط ، frameshifts ، وتوقع ضررا مغلطة) وجدت في مختلف المرضى (ولكن ليس في عينات مراقبة أو قواعد بيانات عامة) أولوية عالية للدراسات التحقق من صحة أخرى. وهذا يشمل : 1) لاختبار وجود خلل محتمل في الربط خطوط الخلايا المشتقة من lymphoblastoid المريض. في تجربتنا ، فإن معظم الجينات العائد RT - PCR المنتجات من خطوط الخلايا lymphoblastoid ؛ 2) التحقيق في تغيير مستويات بروتين تعبير عن طريق التحليل الكمي لطخة غربية مقتطفات من البروتين من خطوط الخلايا lymphoblastoid و 3) اختبار المزيد من الطفرة / الجينات على المستوى الوظيفي في الحيوانات (ج ايليجانس ، اسماك الزرد) ونماذج خط الخلية كما فعلت من قبل مجموعتنا (مثال : 5،6). </li></ol> 6. ممثل النتائج : بعد هذا البروتوكول ، وكنا قادرين على تحديد جينات جديدة لمرض انفصام الشخصية والتوحد. مثال واحد هو اكتشاف الجينات لدينا مؤخرا SHANK3 (الشكل 2). مختلفتين دي نوفو طفرات في الجين SHANK3 ، واحدة الطفرة هراء وجدت في ثلاثة شقيقه وأحد المتضررين طفرة مغلطة في امرأة واحدة المتضررة. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. (أ) الفصل بين الطفرة هراء R1117X في ثلاثة أشقاء المتضررين من PED 419 عائلة. يشار إلى المستلفت بواسطة السهم (ب) فصل من طفرة مغلطة R536W في المستلفت ولكن ليس لها أخ غير المتضررة في PED 56.

<ol><li>Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+fitness+in+familial+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Reproductive fitness in familial schizophrenia.</a> Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).</li>
<li>Jablensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia%3A+manifestations%2C+incidence+and+course+in+different+cultures.+A+World+Health+Organization+ten-country+study%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med+Monogr%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study.</a> Psychol Med Monogr. , Suppl 20. 1-97 (1992).</li>
<li>Malaspina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia+risk+and+paternal+age%3A+a+potential+role+for+de+novo+mutations+in+schizophrenia+vulnerability+genes%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Spectr%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes.</a> CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).</li>
<li>DeLisi, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+scan+for+linkage+to+chromosomal+regions+in+382+sibling+pairs+with+schizophrenia+or+schizoaffective+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder.</a> Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).</li>
<li>Gauthier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+SHANK3+Mutations+in+Patients+Ascertained+for+Schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Piton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+calcium-related+gene+IL1RAPL1+are+associated+with+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism.</a> Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).</li>
<li>Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neighboring-nucleotide+effects+on+the+rates+of+germ-line+single-base-pair+substitution+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes.</a> Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الإجراء المذكورة هنا تهدف إلى التعرف على الأمراض الشائعة التي تؤدي على الأرجح محددة ، في جزء منه ، من الطفرات دي نوفو ، وتثبت هذه الفرضية. دي نوفو الطفرات هي آلية راسخة لتطوير عدد من الأمراض ، ومنها على سبيل المثال متلازمات السرطان وراثية ، ولكن لم يتم استكشافها بشكل سيئ في الأمراض الشائعة. هذه النتائج في جزء من التحديات التقنية التي ينطوي عليها تحديد الطفرات دي نوفو ، الأمر الذي يتطلب كميات كبيرة من تسلسل الحمض النووي ، والتي ليس لها إلا مؤخرا جدا أن تصبح فعالة من حيث التكلفة مع ظهور الجيل التسلسل التالي. بالإضافة إلى ذلك ، كان معدل تحور نوفو دي في البشر ، وحتى وقت قريب جدا ، مجرد تقدير. إلا مؤخرا جدا وهناك تقارير مباشرة تحديد معدل تحور في البشر. قبل هذه القياسات ، وكان من الصعب توقع حجم العينة المطلوبة لهذا النوع من الدراسة ، وتحديد ما إذا كان لاحظ تحور دي نوفو معدل أكبر من المعدل الأساسي. تسلسل الجينات مرشح مقابل الجينوم؟ لأن غالبية من الطفرات المرض المبلغ عنها مغلطة / هراء الطفرات والتحولات موقع لصق (وفقا لموقع على شبكة الإنترنت HGMD) استراتيجيتنا الفحص سيحدد أكثر من 68 ٪ من الطفرات المعروفة. هناك أيضا علاقة واضحة بين شدة استبدال الأحماض الأمينية واحتمال وجود النمط الظاهري السريرية. بالمقارنة مع استبدال الأحماض الأمينية المحافظ ، وهو تغيير هراء هو 9،0 مرات اكثر من المرجح أن يقدم سريريا 7. وهكذا ، في هذا الوقت تسلسل الجينات المرشحة هي الاستراتيجية الأكثر فعالية من حيث التكلفة. نجاح الإجراء المذكورة تعتمد على العديد من الخطوات الحاسمة ، والتي ترد بالتفصيل ويتضح به مثالين والتوحد وانفصام الشخصية. هناك كثير من المزالق التي يجب تجنبها ، مثل المرض الذي لتحديد ، أي من المرضى الى المصدر ، على الشاشة من الحمض النووي ، وتفاصيل عن كيفية تحديد كفاءة دي نوفو الطفرات. نحن نقدم طريقة لتحديد أكفأ جزء من الحالات من أي مرض الذي ينجم عن مثل هذه الطفرات العفوية.

استراتيجية لتحديد الطفرات دي نوفو في الاضطرابات الشائعة مثل التوحد والفصام

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

هناك عدة أدلة تدعم دور الطفرات de novo كآلية للاضطرابات الشائعة، مثل التوحد والفصام. أولاً، يعد معدل الطفرات de novo لدى البشر مرتفعاً نسبياً، لذا تتولد طفرات جديدة بتردد عالٍ في المجتمع. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ عن طفرات de novo في معظم الأمراض الشائعة. إن الطفرات في الجينات التي تؤدي إلى أمراض شديدة حيث يوجد انتخاب سلبي قوي ضد النمط الظاهري، مثل الوفاة في المراحل الجنينية أو انخفاض الكفاءة التكاثرية، لن تنتقل إلى العديد من أفراد الأسرة، وبالتالي لن يتم اكتشافها عن طريق رسم خرائط الجينات الارتباطية أو دراسات الارتباط. كما أن ملاحظة التطابق العالي جداً في التوائم أحادية الزيغوت والتطابق المنخفض جداً في التوائم ثنائية الزيغوت تدعم بقوة الفرضية القائلة بأن جزءاً كبيراً من الحالات قد ينتج عن طفرات جديدة. وهذا هو الحال في أمراض مثل التوحد والفصام. ثانياً، على الرغم من انخفاض الكفاءة التكاثرية1 والعوامل البيئية المتغيرة للغاية، فإن معدل حدوث بعض الأمراض يظل ثابتاً ومحافظاً عليه عالمياً بمعدل مرتفع نسبياً. وهذا هو الحال بالنسبة للتوحد والفصام، بمعدل حدوث يبلغ حوالي 1% عالمياً. يمكن اعتبار الحمل الطفري بمثابة توازن بين الانتخاب المؤيد أو المعارض للطفرة الضارة وإنتاجها عن طريق طفرة de novo. وتعتبر معدلات التكاثر المنخفضة عاملاً من عوامل الانتخاب السلبي التي من شأنها أن تقلل عدد الأليلات الطافرة في المجتمع، مما يؤدي في النهاية إلى انخفاض انتشار المرض. وتميل هذه الضغوط الانتخابية إلى أن تكون ذات شدة مختلفة في البيئات المختلفة. ومع ذلك، فقد حافظت هذه الاضطرابات العقلية الشديدة على انتشار ثابت ومرتفع نسبياً في المجتمع العالمي عبر مجموعة واسعة من الثقافات والبلدان على الرغم من الانتخاب السلبي القوي ضدها2. وهذا ليس ما يمكن توقعه في الأمراض التي تعاني من انخفاض الكفاءة التكاثرية، ما لم يكن هناك معدل مرتفع للطفرات الجديدة. وأخيراً، تأثيرات عمر الأب: هناك زيادة ملحوظة في خطر الإصابة بالمرض مع زيادة عمر الأب، وهو ما قد ينتج عن الزيادة المرتبطة بالعمر في طفرات de novo الأبوية. وهذا هو الحال في التوحد والفصام3. ويُقدر معدل الطفرات بين الذكور والإناث بنحو 4-6:1، ويفترض أن ذلك يعود إلى عدد أكبر من انقسامات الخلايا الجرثومية مع تقدم العمر لدى الذكور. وبناءً على ذلك، يُتوقع أن تأتي الطفرات de novo بشكل متكرر من الذكور، وخاصة الذكور الأكبر سناً4. وقد يفسر المعدل المرتفع للطفرات الجديدة جزئياً سبب فشل الدراسات الجينية حتى الآن في تحديد العديد من الجينات المسببة للأمراض المعقدة، مثل التوحد والفصام، وسبب تحديد الأمراض لـ 3% فقط من الجينات في الجينوم البشري. يتطلب تحديد الطفرات de novo كسبب للمرض منهجاً جزيئياً مستهدفاً، يتضمن دراسة الوالدين والأشخاص المصابين. سيتم توضيح عملية تحديد ما إذا كان الأساس الجيني للمرض قد ينتج جزئياً عن طفرات de novo والمنهج الجزيئي لإثبات هذا الارتباط، باستخدام التوحد والفصام كأمثلة.

الوراثية الجزيئية لإيجاد استراتيجية دي نوفو طفرات تسبب الاضطرابات الشائعة مثل التوحد وانفصام الشخصية.

هناك عدة أدلة تدعم دور الطفرات الجينية المستحدثة (de novo mutations) كآلية مسببة للاضطرابات الشائعة، مثل التوحد والفصام. أولاً، ...

الهدف العام من التجربة التالية هو القدرة على تحديد الطفرات الجديدة (de novo) في الاضطرابات الوراثية الشائعة. وبمجرد تحديد المرض الذي يتوافق مع فرضية الطفرة الجديدة، يتم تطبيق معايير دقيقة لاختيار حالات المرضى التي سيتم مسحها بحثاً عن هذه الطفرات. بعد ذلك، يتم استخدام تسلسل عالي الجودة ومنخفض الإنتاجية، أو تسلسل الإكسوم الكامل، لتحديد هذه الطفرات باستخدام هذه الاستراتيجية.وُجدت طفرات جديدة (De Novo) في جين Shank three لدى الأشخاص المصابين بمرض الفصام. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن تقدم رؤى حول الوراثة الخاصة بمرضي الفصام والتوحد، إلا أنه يمكن استخدامها أيضًا لدراسة أمراض شائعة أخرى مثل التخلف العقلي.لا تنطبق مواصفات مرض الطفرة الجديدة (de Novo Disease) على جميع الأمراض. لذا، وقبل تحديد البروتوكول، إليكم المعايير الأساسية التي يجب أن يستوفيها المرض ليكون مرشحاً ليكون مرض طفرة Novo. يظهر المرضى المصابون انخفاضاً في مستوى اللياقة البدنية.يوجد هذا المرض بشكل متكرر في بيئات متنوعة للغاية. ويرتبط المرض أحياناً بزيادة عمر الأب. كما تفشل دراسات الارتباط والصلة التقليدية في تفسير جزء كبير من التوريث الجيني للمرض.وأخيراً، يجب أن تدعم بيانات التوافق بين التوائم نموذج الطفرة الجديدة (de novo). بعد ذلك، يتم تطبيق معايير لاختيار العينات التي يزداد احتمال امتلاكها لطفرة جديدة. ترتبط الطفرة الجديدة بالظهور المبكر للمرض، والأنماط الظاهرية الشديدة، والوالدين غير المصابين، والآباء الأكبر سناً الذين لا تظهر عليهم أعراض المرض.يمكن أن تحد وفرة الحمض النووي (DNA) من اختيار العينات. وما لم تتوفر عينات من المريض ووالديه، فلا يمكن استبعاد احتمالية الانتقال الوراثي. بالإضافة إلى ذلك، ثمة حاجة إلى توفر مجموعات إضافية من المصابين وأفراد أصحاء للتحقق من صحة الجين المرشح الذي تم تحديده.عندما يتم جمع حجم عينة كافٍ من المرشحين والمجموعات الضابطة، يتم المضي قدماً في تحليل اختيار أفضل الجينات المرشحة بناءً على نظام تسجيل. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذه المجموعة من المعايير لتسجيل الجينات المرتبطة بالأمراض المعرفية العصبية.تستخدم الأمراض العصبية، مثل التصلب الجانبي الضموري على سبيل المثال، معايير مختلفة تمامًا. وتشمل هذه المعايير أدلة على التأثر التشابكي، وأدلة على التموضع التشابكي، وبيانات التعبير النسيجي، وبيانات النماذج الحيوانية، وبيانات الإدراك، والحجج المستمدة من التحليل الجيني والمشاركة. وبعد تطبيق هذه المعايير، يمكن استبعاد العديد من الجينات من الدراسة لصالح مرشحين أفضل.بعد عملية التسلسل، يتم تطبيق مزيج من أداتين أو أكثر من أدوات تحليل التسلسل على الجينات المرشحة، وذلك لأنها تعمل عادةً بطرق مختلفة. فعلى سبيل المثال، يكون معدل الطفرات الإيجابية الكاذبة لـ SMPs كما يتم حسابه بواسطة برنامج polys scan الموضح في هذا الرسم البياني، أعلى مما يتم حسابه بواسطة برنامج poly Fred. كما يظهر برنامج polys scan معدل طفرات أقل لـ indels مقارنة ببرنامج poly Fred.كخطوة نهائية لكل متغير إكسوني جديد، يتم استبعاد الشوائب التقنية من خلال التأكيد عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وإعادة التسلسل. المنطقة ذات الأهمية من الحمض النووي المستخلص من عينات دم المريض وكلا الوالدين؛ ويعد تنفيذ هذه الخطوة على الحمض النووي المستخلص من الدم أمراً مهماً لأن بعض الطفرات قد تكون ناتجة عن شوائب ناجمة عن انقسام الخطوط الخلوية للمفاويات المستنبتة. وهناك بديل قوي لتسلسل جينات مرشحة مختارة وهو استخدام التسلسل عالي الإنتاجية لتسلسل المناطق المشفرة لـ 16,000 جين.تتوفر حالياً مجموعات أدوات من شركات تجارية متنوعة لتحضير العينات المخصصة لتسلسل الإكسوم الكامل. وعند إعادة هذه التسلسلات إلى المختبر، توجد العديد من أدوات المعلوماتية الحيوية المتاحة للاختيار من بينها للكشف عن التباين الجينومي وتحديد الأنماط الجينية. والآن، قبل تحديد أولويات الطفرات ضمن الإكسوم الكامل، قم باختيار المتغيرات من الجينات المرشحة المصنفة كما تم شرحه سابقاً.بالنسبة لجميع المتغيرات، يجب ترتيب أولويات كل منها وفقاً لمعيارين. أولاً، يجب أن يكون المتغير فريداً وغير موجود لدى الوالدين، ولا في قواعد البيانات العامة s و p. ثانياً، يُتوقع أن تؤثر المتغيرات على وظيفة الجين وفقاً لموقعها في التسلسل، إما عن طريق البتر أو التغيير.الطلاء. يمكن لبرامج مثل PolyPhen وsift وPanther أن تجري هذه التنبؤات لتحديد الطفرات المسببة الأخرى والتأكد من أن الطفرات المحددة غير موجودة لدى الأفراد الأصحاء، وذلك عبر إعادة تسلسل الجين بالكامل في حالات مرضية إضافية وفي مجموعات الضبط. يجب أن يخضع أي جين يحتوي على طفرة de novo واحدة على الأقل، ويُتوقع أن تكون ضارة، لمزيد من دراسات التحقق. يمكن توصيف المتغيرات المؤكدة وظيفياً عن طريق إجراء تحليل mRNA و/أو تحليل البروتين على خطوط خلوية أو نماذج حيوانية تحمل هذه الطفرات.يمكن إجراء هذه التحليلات الوظيفية على خطوط خلوية أو نماذج حيوانية باستخدام نهج جينات canida منخفض الإنتاجية وعالي الجودة. وقد تم العثور على جين يحتوي على طفرتين مختلفتين ناشئتين (de novo) لدى مرضى الفصام. كما تم رصد طفرة غير معبرة (nonsense mutation) واحدة لدى ثلاثة إخوة مصابين.في هذه العائلة، أدت الطفرة إلى إشارة إنهاء مبكرة عند الكودون 1,117 من جين shank3. وفي عائلة أخرى، وُجدت طفرة مغلطة في الجين نفسه لدى أنثى مصابة؛ حيث تؤدي هذه الطفرة إلى تغيير الحمض الأميني أرجينين إلى تريبتوفان، وهو حمض أميني مختلف تماماً عند الكودون 536.وبعد مشاهدة هذا الفيديو واستخدام الطرق الموضحة، يجب أن تكون قادراً على تقييم المرض الذي تهتم بدراسته لمعرفة ما إذا كانت طفرات Novo تلعب دوراً فيه أم لا.

a-strategy-to-identify-de-novo-mutations-common-disorders-such-as

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

حلت محل مجموعة [ك] للكشف عن الجينومية المتغيرات في عدد النسخ تحليل النمط النووي G النطاقات. وتصف هذه الورقة التكنولوجيا وتطبيقاتها في مختبر خدمة التشخيص.

مجموعة المقارن الجينوم التهجين (صفيف [ك]) عن الكشف عن الجينوم نسخ عدد المتغيرات

تلين عقيدية هيتيروتوبيا (هايتي) هو الشكل الأكثر شيوعاً لتشوه التنمية القشرية (MCD) في مرحلة البلوغ ولكن الأساس الجيني لا يزال غير معروف في بعض الحالات المتفرقة أكثر. مؤخرا قمنا بتطوير استراتيجية لتحديد الجينات المرشحة رواية ل MCDs وتؤكد على دور العامل المسبّب في فيفومباشرة.

رواية استراتيجية الجمع بين CGH الصفيف وتعاقب كل اكسومي وانهانسر في الرحم في القوارض لتحديد الجينات المسببة لتشوهات الدماغ

نقدم خطة وبروتوكولا استراتيجيا لتحديد المتغيرات الجينية غير المشفرة التي تؤثر على ربط الحمض النووي لعامل النسخ (TF). يتم توفير بروتوكول تجريبي مفصل لمقايسة تحول الحركة الكهربية (EMSA) وتحليل مقايسة ترسيب تقارب الحمض النووي (DAPA) لربط الحمض النووي TF المعتمد على النمط الجيني.

الكشف عن وظيفية غير الترميز المتغيرات الوراثية عن طريق الكهربي التنقل التحول الفحص (EMSA) والحمض النووي تقارب الهطول الفحص (ضبا)

العمليات النمائية مثل الانتشار، والهجرة، وثمرة نورت هي غالباً بالقلق في الأمراض العصبية. وبالتالي، فإننا نقدم بروتوكولات لتقييم سرعة وتكاثر هذه العمليات النمائية في الشخصيات البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية. كما تسمح هذه البروتوكولات تقييم آثار عوامل النمو ذات الصلة والمداواة في التنمية للمجلس الوطني.

الكشف السريع عن النماء العصبي تعمل في خلايا الإنسان العصبية السلائف (الشخصيات)

تستهدف الجيل التالي التسلسل هو نهج فعال من حيث وقت وتكلفة التي تزداد شعبية في البحوث في مجال الأمراض والتشخيص السريري. البروتوكول هو موضح هنا يعرض سير العمل المعقدة المطلوبة للتسلسل والمعلوماتية الحيوية العملية المستخدمة لتحديد المتغيرات الجينية التي تساهم في المرض.

استهدفت تسلسل الجيل القادم وأنابيب المعلوماتية الحيوية لتقييم المحددات الوراثية للمرض الدستورية

الجيل التالي التسلسل (خ ع) هو أداة قوية لتوصيف الجينوم محدود بنسبة الخطأ عالية من النظام الأساسي (~0.5–2.0%). يصف لنا أساليب عملنا لتصحيح خطأ في تسلسل التي تسمح لنا بتفادي نسبة الخطأ خ ع والكشف عن الطفرات في اليل البديل الكسور نادرة ك 0.0001.

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

يرتبط اضطراب طيف التوحد (ASD) بضعف السلوك الاجتماعي والتواصلي وظهور السلوك المتكرر. لدراسة العلاقة المتبادلة بين جينات ASD والعجز السلوكي في نموذج ذبابة الفاكهة ، تم وصف خمسة نماذج سلوكية في هذه الورقة لفحص التباعد الاجتماعي ، والعدوان ، والمغازلة ، والاستمالة ، وسلوك التعود.

نماذج للتقييم السلوكي في نموذج ذبابة الفاكهة لاضطراب طيف التوحد

هناك تراكم الأدلة، أن شروط مسبقة الدماغية (PC) - تحديا الدماغية غير ضارة الى المخ - يمنح حماية عابر إلى إتلاف إهانة الدماغية لاحقة. أنشأنا الثنائية المشتركة انسداد الشريان السباتي (BCCAO) كحافز شروط مسبقة للحث على التسامح الدماغية المبكرة (IT) إلى عابر نقص التروية الدماغية البؤرية (الناجم عن انسداد الشريان الدماغي الأوسط، MCAO) في C57BL6 / J الفئران.

الثنائية انسداد الشريان السباتي المشترك باعتباره المحفز شروط مسبقة كافية للحث على التسامح الدماغية المبكرة إلى نقص التروية الدماغية البؤري

ال<em&gt; في البيضة</em&gt; CAM-مقايسة باعتبارها Xenograftmodel عن الورم اللحمي

تقدم هذه المخطوطة بسيطة، لكنها قوية، في طريقة المختبر لتقييم انقباض العضلات الملساء ردا على وكلاء الدوائية أو تحفيز العصب. التطبيقات الرئيسية هي فحص المخدرات والأنسجة علم وظائف الأعضاء فهم، والصيدلة، وعلم الأمراض.

المثانة العضلات الملساء قطاع انقباض كوسيلة لتقييم المسالك البولية السفلى الصيدلة

اكتشف استراتيجية تحديد الطفرات دي نوفو في الاضطرابات الشائعة مثل التوحد والفصام باستخدام تقنيات التسلسل الجيني. يوفر هذا الإطار رؤى حول الآليات الجينية للأمراض المعقدة.

استراتيجية لتحديد الطفرات دي نوفو في الاضطرابات الشائعة مثل التوحد والفصام

استكشف المزيد من الفيديوهات