باستخدام الفحص ميكروأري عموم الفيروسي (Virochip) إلى الشاشة العينات السريرية لمسببات الأمراض الفيروسية

يستخدم هذا الإجراء شريحة Viro، وهي مقايسة مصفوفة دقيقة شاملة للفيروسات لتحليل العينات السريرية للكشف عن الفيروسات المعروفة وغير المعروفة على حد سواء. أولاً، يتم استخلاص الأحماض النووية من العينات السريرية. بعد ذلك، يتم نسخ الـ RNA المستخلص عكسياً باستخدام بادئات عشوائية.

يتم إجراء تخليق الشريط الثاني من cDNA، ثم يتم تضخيم مكتبة cDNA باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) العشوائي. بعد ذلك، يتم وسم cDNA المضخم بصبغات فلورية وتهجينها على مصفوفة دقيقة لشريحة فيروسية. وتتمثل الخطوة النهائية في مسح المصفوفة الدقيقة وتحليلها.

وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح وجود أو غياب فيروس واحد أو عدة فيروسات من خلال تحليل مصفوفة الرقاقة الدقيقة. إن طرق الكشف واسعة النطاق، مثل مصفوفة الرقاقة الفيروسية، ضرورية في التشخيص الميكروبيولوجي لأن المتلازمات السريرية الشائعة، مثل الالتهاب الرئوي، ليست محددة لممرض واحد، وبسبب التهديد المستمر الناشئ عن ممرضات فيروسية مستجدة مثل فيروس SARS Coronavirus وفيروس إنفلونزا 2009 novel H one N one. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التشخيص الميكروبيولوجي، مثل النسبة المئوية للعدوى غير المشخصة في السياق السريري التي قد تكون ناجمة عن فيروسات مستجدة لم يتم تحديدها بعد. وتمتد آثار هذه التقنية نحو تحسين تشخيص الأمراض السريرية الحادة في المستشفى لأننا نقوم بفحص مئات إلى آلاف الممرضات المحتملة في آن واحد.

جاءتنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة في عام 2002 عندما قررنا تطبيق تقنية المصفوفات الدقيقة التي تم تطويرها حديثاً، والتي رادها مختبر الدكتور Joseph DeRisi في جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو (UCSF)، في الكشف عن الفيروسات. وكانت أول حالة اختبار واقعية لنا هي استخدام الرقاقة الفيروسية لتحديد فيروس كورونا مستجد مسؤول عن متلازمة SARS في عام 2003. وسيقوم فني من مختبري بتوضيح الإجراء من البداية إلى النهاية، حيث سيستعرض استخدام مقايسة الرقاقة الفيروسية على عينة مسحة أنفية مأخوذة من طفلة لتشخيص سبب مرضها التنفسي الحاد. تُجمع عينات مسحات البلعوم الأنفي في حاويات معقمة تحتوي على وسط سائل لنقل الفيروسات، وتُحفظ مجمدة في مجمد بدرجة حرارة -80 °C.

داخل غطاء السلامة البيولوجية، اترك الأنبوب الذي يحتوي على العينة ليذوب الثلج عنه، وحرك المسحة لفترة وجيزة في الوسط قبل التخلص من المسحة في حاوية النفايات البيولوجية الخطرة. ثم انقل 200 µL من العينة إلى أنبوب سعة 1.5 mL. مرر العينة عبر مرشح طرد مركزي بمسامية 0.22 micron لتنقيتها من الجسيمات الفيروسية ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL.

بعد ذلك، استخدم مجموعة Turbo DNA من شركة Ambien وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لتحليل الحمض النووي الجينومي للمضيف وتنقية الحمض النووي الفيروسي المحمي والمغلف. يتبع ذلك استخلاص الـ RNA، باستخدام مجموعة XMO ZR لاستخلاص الـ RNA الفيروسي أو مجموعة Qiagen ultrasound للفيروسات وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. قم بقياس تركيز الـ RNA المستخلص باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأحماض النووية NanoDrop.

يُفضل أن يكون تركيز RNA على الأقل 10 nanograms per microliter، ولكن قد يختلف من عينة إلى أخرى باستخدام أنبوب رقيق الجدران سعة 200 microliter. أضف microliter واحد من البادئ A بتركيز 40 PICA moles per microliter إلى أربعة microliters من RNA المستخلص. سخن العينة عند 65 degrees Celsius لمدة خمس دقائق في جهاز التدوير الحراري، ثم اترك الأنبوب ليبرد حتى درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، أضف 5 µL من المزيج الرئيسي (master mix) الذي يحتوي على 2 µL من منظم تفاعل النسخ العكسي (RT buffer) بتركيز 5x، و1 µL من DNTP بتركيز 12.5 mM، و1 µL من الماء، و0.5 µL من DTT بتركيز 0.1 M، و0.5 µL من superscript three، إنزيم النسخ العكسي (reverse transcriptase) في جهاز الدورات الحرارية (thermocycler). قم بتحضين الأنبوب عند 42 °C لمدة 60 دقيقة. ثم قم بتسخين العينة إلى 94 °C لمدة دقيقتين.

لإيقاف تفاعل النسخ العكسي، يتم التبريد عند 10 °C لمدة دقيقتين ثم إجراء طرد مركزي نبضي لمدة خمس ثوانٍ. بعد ذلك، أضف 5 µL من خليط quease المكون من 1 µL من منظم quease بتركيز 5x، و3.8 µL من الماء، و0.15 µL من quease الخاص بتخليق الشريط الثاني. ارفع درجة حرارة الجهاز الدوري الحراري من 10 °C إلى 37 °C خلال ثماني دقائق.

يُحفظ عند 37 °C لمدة ثماني دقائق. ثم يُسخن عند 94 °C لمدة دقيقتين لتعطيل إنزيم الـ quease، ثم يُبرد إلى 10 °C عند هذه النقطة. وإذا لزم الأمر، تُخزن العينة التي تحتوي على 15 µL من الـ CDNA عند -20 °C.

أولاً، أضف 5 µL من عينة CD NA إلى 45 µL من مزيج رئيسي (master mix) يتكون من 5 µL من منظم PCR بتركيز 10x، و 1 µL من DNTP بتركيز 12.5 mM، و 1 µL من البادئ B بتركيز 100 pmol/µL، و 1 µL من cleantech LA، و 37 µL من الماء. ثم قم بتشغيل بروتوكول PCR على النحو التالي: 94 °C لمدة دقيقتين، تليها 25 دورة تتكون من 94 °C لمدة 30 ثانية، و 50 °C لمدة 45 ثانية، و 72 °C لمدة دقيقة واحدة.

ثم يتم إجراء خطوة تلدين عند 72 درجة Celsius لمدة خمس دقائق، يتبعها الحفظ عند 10 درجة Celsius بعد عملية PCR. يتم التحقق من ناتج PCR باستخدام هلام كهربائي AOSE بنسبة 1.5%. يجب أن يظهر مسح (smear) يتراوح من 200 إلى 1000 زوج قاعدي تقريباً.

لدمج AAD DNTP، أضف خمسة µL من ناتج PCR الفيروسي إلى 45 µL من المزيج الرئيسي (master mix) المكون من خمسة µL من منظم PCR بتركيز 10x، وواحد µL من A-A-D-N-T-P بتركيز 12.5 mM، وواحد µL من بادئ (primer) B بتركيز 100 p، وواحد µL من ClinTech LA، و37 µL من الماء. قم بتشغيل بروتوكول PCR على النحو التالي: 94 °C لمدة دقيقتين، ثم 15 دورة تتكون من 94 °C لمدة 30 ثانية، و50 °C لمدة 45 ثانية.

درجة حرارة 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، ثم خطوة تبريد تدريجي عند 72 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، والتثبيت عند 10 درجة مئوية. بعد ذلك، يتم تنقية ناتج PCR الجديد باستخدام مجموعة DNA clean and concentrator three وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، ثم التخفيف في 10 µL من محلول الاستخلاص (elution buffer). أضف 1 µL من بيكربونات بتركيز 1 M و 1 µL من si three إلى الـ 10 µL من ناتج PCR، ثم يتم التحضين لمدة ساعة واحدة في الظلام.

بعد ذلك، قم بتنظيف العينة الموسومة بـ S مرة أخرى باستخدام مجموعة DNA clean and concentrator five، ثم استخلصها في 12 µL من محلول الاستخلاص (elution buffer). استخدم 1.5 µL من العينة للتحقق من تركيز CDNA وكمية الصبغة المدمجة باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop في أنبوب PCR شريطي يحتوي على 1 µL من fragmentation buffer (مخفف 25 مرة)، و 5 µL من blocking buffer (مخفف 5 مرات)، و 9.5 µL أو الكمية اللازمة للوصول إلى تركيز نهائي موحد قدره 10 pM من العينة الموسومة بـ SI 3، مع إضافة الماء حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 25 µL. ثم أضف 25 µL من GX hybridization buffer (مخفف مرتين)، وقم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لإزالة الفقاعات.

ضع شريحة حشية جديدة في غرفة التهجين. قم بتحميل 40 µL من العينة على شريحة الحشية. بعد ذلك، ضع مصفوفة الفيروسات المطبوعة من Agilent بحيث يكون الجانب الذي يحمل علامة Agilent لأسفل فوق شريحة الحشية، ثم أحكم ربط المسمار جيداً.

ضع غرفة التهجين في فرن عند درجة حرارة 65 °C وقم بإجراء التهجين طوال الليل مع تدوير بطيء بمعدل 10 دورات في الدقيقة لغسل المصفوفات. أولاً، قم بتسخين المحلول المنظم الثاني مسبقاً حتى 37 °C أثناء التسخين. املأ حاوية بلاستيكية سعة 500 ml بنحو 250 ml من المحلول المنظم الأول.

قم بإزالة المصفوفة من غرفة التهجين، ثم اغمر المصفوفة وافصلها عن شريحة الحاشية. انقل المصفوفة إلى وعاء نظيف واغسلها في المحلول المنظم الأول لمدة دقيقة واحدة. ثم استخدم وعاءً بلاستيكيًا منفصلاً سعة 500 milliliter.

اغسل المصفوفة في المحلول المنظم الثاني المسخن مسبقاً لمدة دقيقة واحدة. بعد الغسيل، أخرج المصفوفة ببطء من المحلول المنظم الثاني، مع الحرص على تجنب تكون الفقاعات.

استخدم منديلاً ورقيًا (kim wipe) لامتصاص الرطوبة الزائدة مع الحرص على تجنب لمس الجانب النشط من المصفوفة مباشرةً. وأخيراً، ضع الشريحة في حامل الشرائح بحيث يكون جانب Agilent متجهًا للأعلى، ثم أدخلها في ماسح المصفوفات. وفي هذا الإجراء، نستخدم ماسح Agilent للمصفوفات الدقيقة للحمض النووي بدقة 2 ميكرون.

قم بمسح مصفوفة SI الثلاثية المسمى عند خمس ميكرونات أو ميكرونين وفقاً لبروتوكول المسح القياسي للجهاز. حلل المصفوفات الدقيقة لرقاقة الفيروسات عن طريق تحليل العناقيد (cluster analysis) أو برنامج تحليل رقائق RO الآلي e unpredic. باستخدام المصفوفة الدقيقة لرقاقة Viro Chipp لعام 2009، يمكن الكشف بسهولة عن فيروس الإنفلونزا H one N one المستجد في عينة مسحة أنفية مأخوذة من طفل يعاني من مرض شبيه بالإنفلونزا.

بالإضافة إلى ذلك، فقد أظهرنا أن الشريحة الفيروسية قادرة على تحديد ليس فقط الفيروسات التنفسية، ولكن أيضاً نطاقاً واسعاً من الفيروسات المستخلصة من مجموعة متنوعة من الأنسجة وسوائل الجسم المختلفة. تظهر هنا بعض الأمثلة على الكشف عن الفيروسات في الدم الكامل والمصل باستخدام vichi. هذه هي النداءات المقابلة لمصفوفة viro chip الدقيقة من عينات الدم، سواء كانت دماً كاملاً أو مصلاً مأخوذاً من أربعة مرضى لكل عينة، حيث يتم عرض أعلى توقعين للفيروسات، مع كون التوقع الفيروسي الأعلى هو الذي يمتلك أقل قيمة P value.

على سبيل المثال، في العينة المظللة باللون الأزرق الفاتح، كان التوقع الأعلى لتلك العينة هو فيروس حمى الضنك من النوع الأول. وبينما كان التوقع الثاني في الترتيب هو فيروس حمى الضنك من النوع الثاني، فقد تأكد أن الفيروس الفعلي في عينة الدم الكامل هذه هو بالفعل فيروس حمى الضنك من النوع الأول، بما يتفق مع نتائج dict. وثمة تطبيق آخر لشريحة viro chip يتمثل في اكتشاف مسببات الأمراض الجديدة.

تشمل بعض الأمثلة اكتشاف فيروس كورونا sars X-M-R-V-A، وفيروس OME الارتجاعي المرتبط بسرطان البروستاتا ومتلازمة التعب المزمن لدى البشر، وفيروس HTCV، وهو فيروس قلبي بشري مستجد مرتبط بعدوى الجهاز التنفسي والإسهال لدى الأطفال. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون 12 ساعة إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر ضمان توفر جميع المعدات والكواشف اللازمة وفقاً لهذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى، مثل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الفيروسي النوعي والتسلسل العميق، وذلك من أجل تأكيد ومتابعة أنماط تهجين الرقاقة الفيروسية غير المعتادة أو نتائج الرقاقة الفيروسية التي تشير إلى وجود فيروس جديد بعد تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأورام لاستكشاف العلاقة بين الفيروسات الجديدة والسرطان، وفي مجالات الدفاع البيولوجي والأحياء الدقيقة السريرية لتطوير فحوصات قائمة على المصفوفات الدقيقة المكثفة للتشخيص السريع لمسببات الأمراض، وفي مجال علم الفيروسات لتوصيف الفيروسات الجديدة وارتباطها بالأمراض. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تنفيذ جميع خطوات مقايسة المصفوفة الدقيقة للرقاقة الفيروسية، وهي اختبار مراقبة واسع النطاق للكشف عن المسببات المرضية الفيروسية في العينات السريرية، بدءاً من استخلاص الحمض النووي من العينات السريرية وصولاً إلى تهجين المصفوفة الدقيقة وتحليلها.

لا تنسَ أن العمل مع العينات السريرية يُعتبر خطراً بيولوجياً، لذا يجب إجراء استخلاص الأحماض النووية في مختبرات مصنفة ضمن المستوى الثاني من السلامة البيولوجية أو أعلى.