باستخدام الفحص ميكروأري عموم الفيروسي (Virochip) إلى الشاشة العينات السريرية لمسببات الأمراض الفيروسية

يستخدم هذا الإجراء شريحة Viro ، وهي مقايسة ميكروصفيف فيروسية لتحليل العينات السريرية لكل من الفيروسات المعروفة وغير المعروفة. أولا يتم استخراج الأحماض النووية من العينات السريرية. بعد ذلك ، يتم عكس الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام بادئات عشوائية.

يتم إجراء تخليق القرص المضغوط NA للخيط الثاني ويتم تضخيم مكتبة CD NA باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العشوائي. ثم يتم تمييز القرص المضغوط NA المضخم بأصباغ الفلورسنت ويتم تهجينها إلى مصفوفة دقيقة للرقاقة الفيروسية. الخطوة الأخيرة هي مسح المصفوفة الدقيقة وتحليلها.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر وجود أو عدم وجود فيروس أو عدة فيروسات من خلال تحليل المصفوفة الدقيقة للرقاقة. هناك حاجة إلى طرق الكشف واسعة الطيف مثل المصفوفة الدقيقة للرقاقة الفيروسية في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي لأن المتلازمات السريرية الشائعة مثل الالتهاب الرئوي ، ليست خاصة بأي مسببات الأمراض الفردية ، وبسبب التهديد المستمر الناشئ لمسببات الأمراض الفيروسية الجديدة مثل فيروس كورونا السارس وفيروس الإنفلونزا H one N واحد الجديد لعام 2009 ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة التشخيصي ، مثل النسبة المئوية للعدوى غير المشخصة في البيئة السريرية التي قد تكون ناجمة عن فيروسات جديدة لم يتم تحديدها بعد. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص أفضل للأمراض السريرية الحادة في المستشفى لأننا نختبر مئات إلى آلاف مسببات الأمراض المحتملة في وقت واحد.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة في عام 2002 عندما قررنا تطبيق التكنولوجيا المطورة حديثا للمصفوفات الدقيقة الرائدة في مختبر الدكتور جوزيف ديريسي في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو للكشف عن الفيروسات. كانت أول حالة اختبار في العالم الحقيقي لدينا هي استخدام الشريحة الفيروسية لتحديد فيروس كورونا الجديد المسؤول عن السارس في عام 2003 ، مما يدل على أن الإجراء من البداية إلى النهاية سيكون فني من مختبري سيوضح استخدام مقايسة الشريحة الفيروسية على عينة مسحة أنف من طفل لتشخيص سبب مرض الجهاز التنفسي الحاد. يتم جمع عينات مسحة البلعوم الأنفي في حاويات معقمة تحتوي على ناقل فيروسي ووسائط سائلة وتخزينها مجمدة في مجمد 80 درجة مئوية تحت الصفر.

في غطاء السلامة الحيوية ، اسمح للأنبوب الذي يحتوي على العينة بإذابة الجليد وتحريك المسحة لفترة وجيزة في الوسائط قبل التخلص من المسحة في صندوق الخصر الخطير بيولوجيا. ثم aliquot 200 ميكرولتر من العينة في أنبوب 1.5 ملليلتر. مرر العينة عبر مرشح دوران 0.22 ميكرون لتنقية الجزيئات الفيروسية وفي أنبوب جديد سعة 1.5 مل.

بعد ذلك ، استخدم مجموعة Turbo DNA من Ambien وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتحلل الحمض النووي الجيني للمضيف وتنقية الحمض النووي الفيروسي المغلف المحمي. اتبع ذلك مع استخراج الحمض النووي الريبي ، باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي XMO ZR أو مجموعة فيروسات الموجات فوق الصوتية Qiagen وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام مقياس الطيف الضوئي للحمض النووي NanoDrop.

يفضل أن يكون تركيز الحمض النووي الريبي 10 نانوجرام على الأقل لكل ميكرولتر ، ولكنه سيختلف من عينة إلى أخرى باستخدام أنبوب رقيق سعة 200 ميكرولتر. أضف ميكرولتر واحد من البرايمر A بتركيز 40 مول بيكا لكل ميكرولتر إلى أربعة ميكرولترات من الحمض النووي الريبي المستخرج. سخني العينة إلى 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق في مدورة حرارية ، ثم اترك الأنبوب يبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من مزيج رئيسي يحتوي على ميكرولترين خمسة أضعاف المخزن المؤقت RT ، وميكرولتر واحد 12.5 ملليمولي ، و DNTP ميكرولتر واحد من الماء 0.5 ميكرولتر ، و 0.1 مولي DTT و 0.5 ميكرولتر مرتفع ثلاثة ، نسخ عكسي في محلق حراري. احتضان الأنبوب عند 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ثم سخني العينة إلى 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين.

لإجهاض تفاعل النسخ العكسي ، اتصل ب 10 درجات مئوية لمدة دقيقتين وقم بنبض جهاز الطرد المركزي لمدة خمس ثوان. بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من مزيج quease الذي يتكون من ميكرولتر واحد خمس مرات المخزن المؤقت ، و 3.8 ميكرولتر من الماء و 0.15 ميكرولتر من تخليق الخيط الثاني. قم بتكثيف جهاز التدوير الحراري من 10 درجات مئوية إلى 37 درجة مئوية على مدار ثماني دقائق.

استمر في 37 درجة مئوية لمدة ثماني دقائق. ثم سخني إلى 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين لتعطيل الكمية واستدعاء 10 درجات مئوية في هذه المرحلة. إذا رغبت في ذلك ، قم بتخزين العينة التي تحتوي على 15 ميكرولتر من CDNA عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

أولا ، أضف خمسة ميكرولترات من عينة CD NA إلى 45 ميكرولترا من مزيج رئيسي يتكون من خمسة ميكرولتر 10 مرات عازلة PCR ، وميكرولتر واحد 12.5 ملليمولية ، و DNTP ميكرولتر واحد 100 بوم لكل ميكرولتر برايمر ، و B ميكرولتر واحد من التكنولوجيا النظيفة LA و 37 ميكرولتر من الماء. ثم قم بتشغيل بروتوكول PCR على النحو التالي ، 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 25 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.

ثم خطوة راكعة 72 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، تليها ثبات عند 10 درجات مئوية بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تحقق من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل وجل الرحلان الكهربائي 1.5٪ AOSE. يجب تصور مسحة من حوالي 200 إلى 1000 زوج أساسي.

لدمج AAD DNTP ، أضف خمسة ميكرولتر من منتج PCR الفيروسي إلى 45 ميكرولتر من مزيج رئيسي يتكون من خمسة ميكرولتر 10 مرات عازلة PCR ، وميكرولتر واحد 12.5 ملليمولر ، و A-A-D-N-T-P ميكرولتر واحد 100 بكسل من برايمر ميكرولتر متعدد ، و B ميكرولتر واحد ClinTech LA و 37 ميكرولتر ماء. قم بتشغيل بروتوكول PCR على النحو التالي ، 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، 15 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية.

72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة وخطوة الركوع 72 درجة مئوية لمدة خمس دقائق وتستمر عند 10 درجات مئوية. ثم قم بتنظيف منتج PCR الجديد باستخدام مجموعة ثلاثية من أدوات تنظيف ومركز الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بتسخينها في 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت للشطف. أضف ميكرولتر واحد من بيكربونات المولار وميكرولتر واحد si ثلاثة إلى 10 ميكرولتر من منتج PCR واحتضنه لمدة ساعة واحدة في الظلام.

بعد ذلك ، مرة أخرى ، قم بتنظيف العينة التي تحمل علامة S باستخدام مجموعة نظيفة من الحمض النووي ومكثف خمسة وقم بإزالتها في 12 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف. استخدم 1.5 ميكرولتر من العينة للتحقق من تركيز CDNA وكمية الصبغة المدمجة في مقياس الطيف الضوئي NanoDrop في أنبوب شريط PCR عند ميكرولتر واحد 25 مرة مخزن مؤقت للتجزئة خمسة ميكرولتر خمس مرات مانع 9.5 ميكرولتر أو الكمية اللازمة للتركيز النهائي الطبيعي البالغ 10 ذروة أو مولات لكل ميكرولتر من SI ثلاثة عينة مصنفة والماء إلى حجم إجمالي يبلغ 25 ميكرولترا. ثم أضف 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتهجين GX مرتين ، ثم قم بالتدوير لفترة وجيزة لإزالة الفقاعات.

ضع شريحة حشية جديدة في غرفة التهجين. قم بتحميل 40 ميكرولترا من العينة على شريحة الحشية. بعد ذلك ، ضع المصفوفة الفيروسية المطبوعة Agilent مع الجانب الذي يحمل علامة Agilent لأسفل أعلى شريحة الحشية وقم بربط المسمار بإحكام.

ضع حجرة التهجين في فرن 65 درجة مئوية وقم بتهجينها طوال الليل باستخدام دوران بطيء يبلغ 10 دورات في الدقيقة لغسل المصفوفات. قم أولا بالتسخين المسبق من درجتين إلى 37 درجة مئوية أثناء التسخين. املأ حاوية بلاستيكية سعة 500 مل بحوالي 250 مل من العازلة. واحد.

قم بإزالة المصفوفة من غرفة التهجين ، واغمر المصفوفة وافصلها عن شريحة الحشية. انقل المصفوفة إلى الحاوية النظيفة واغسلها في المخزن المؤقت لمدة دقيقة واحدة. ثم باستخدام حاوية بلاستيكية منفصلة سعة 500 مل.

اغسل المصفوفة في مخزن مؤقت مسخن مسبقا لمدة دقيقة واحدة. بعد الغسيل ، قم بإزالة المصفوفة ببطء من المخزن المؤقت. ثانيا ، الحرص على تجنب الفقاعات.

استخدم مناديل كيم لامتصاص الرطوبة الزائدة مع توخي الحذر لتجنب لمس الجانب النشط مباشرة من المصفوفة. أخيرا ، ضع الشريحة في حامل الشريحة Agilent لأعلى وأدخلها في الماسح الضوئي للمصفوف. في هذا الإجراء ، نستخدم ماسح ضوئي Agilent ثنائي الميكرون للحمض النووي.

امسح المصفوفة ذات العلامات الثلاثة SI بخمسة ميكرون أو ميكرونين وفقا لبروتوكول المسح القياسي للجهاز. تحليل المصفوفات الدقيقة للرقاقة الفيروسية عن طريق تحليل الكتلة أو برنامج تحليل رقاقة RO الآلي e غير مسبوق. باستخدام Viro Chipp microarray 2009 الجديد ، يتم اكتشاف فيروس H واحد N واحد بسهولة في عينة مسحة الأنف التي تم الحصول عليها من طفل مصاب بمرض شبيه بالإنفلونزا.

بالإضافة إلى ذلك ، أظهرنا أن الرقاقة الفيروسية قادرة ليس فقط على تحديد فيروسات الجهاز التنفسي ، ولكن أيضا مجموعة واسعة من الفيروسات من مجموعة متنوعة من الأنسجة وسوائل الجسم المختلفة. بعض الأمثلة على اكتشاف الفيروسات في الدم الكامل والمصل باستخدام فيتشي كما هو موضح هنا. هذه هي المكالمات المقابلة للأشعة المجهرية لشريحة الفيروس من عينات الدم ، إما دم كامل أو مصل مأخوذ من أربعة مرضى لكل عينة ، يتم عرض أعلى تنبؤين للفيروس مع أعلى تنبؤ بالفيروس له أدنى قيمة P.

على سبيل المثال، في العينة المميزة باللون الأزرق الفاتح، يكون التنبؤ الأعلى لتلك العينة هو فيروس حمى الضنك من النوع الأول. في حين أن التنبؤ الثاني هو فيروس حمى الضنك من النوع الثاني ، فقد تم تأكيد الفيروس الفعلي في عينة الدم الكاملة هذه بالفعل على أنه فيروس حمى الضنك من النوع الأول بالاتفاق مع نتائج الإملاء. تطبيق آخر لشريحة الفيروس هو اكتشاف مسببات الأمراض الجديدة.

تشمل بعض الأمثلة اكتشافات فيروس كورونا السارس X-M-R-V-A ، OME القهقرية الفيروس المرتبط بسرطان البروستاتا ومتلازمة التعب المزمن في البشر و HTCV ، وهو فيروس قلب بشري جديد مرتبط بالتهابات الجهاز التنفسي والإسهال عند الأطفال بمجرد إتقانه. يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 12 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التأكد من توافر جميع المعدات والكواشف اللازمة بعد هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الفيروسي المحدد والتسلسل العميق من أجل تأكيد ومتابعة أنماط تهجين الرقائق الفيروسية غير العادية أو نتائج الرقائق الفيروسية التي تشير إلى وجود فيروس جديد بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأورام لاستكشاف ارتباط الفيروسات الجديدة بالسرطان في مجالات الدفاع البيولوجي وعلم الأحياء الدقيقة السريري لتطوير فحوصات دقيقة مكثفة للتشخيص السريع لمسببات الأمراض ، وفي مجال علم الفيروسات لتوصيف الفيروسات الجديدة وارتباطها بالأمراض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ جميع خطوات مقايسة الأشعة الدقيقة للرقاقة الفيروسية ، وهو اختبار مراقبة واسع الطيف للكشف عن مسببات الأمراض الفيروسية في العينات السريرية ، وصولا إلى استخراج الحمض النووي ، من العينات السريرية إلى تهجين الأشعة الدقيقة وتحليلها.

لا تنس أن العمل مع العينات السريرية يعتبر خطيرا بيولوجيا ويجب إجراء استخراج الحمض النووي في مختبرات مصنفة بمستوى السلامة الحيوية الثاني أو أعلى.