تشريح وتلون ذبابة الفاكهة اليرقات المبايض

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور المبايض المعزولة من يرقات ذبابة الفاكهة في أواخر الطور الثالث بواسطة المجهر متحد البؤر. يتم تحقيق ذلك عن طريق اختيار اليرقات الأنثوية أولا من مجموعة متزامنة. الخطوة الثانية من الإجراء هي تشريح جسم دهني سليم ، وفصله عن الأمعاء والبشرة ، ووضعه على الجليد.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي إصلاح وصمة عار وغسل الجسم الدهني باستخدام المبايض المضمنة. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي فصل المبايض عن الجسم الدهني أثناء التركيب. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تلطيخا خاصا بالخلية من خلال الفحص المجهري المناعي الفلوري.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن التشريح الدقيق والتركيب يتطلبان قدرا كبيرا من الممارسة. قبل خمسة أيام من التشريح ، أضف الخميرة إلى قارورة طازجة مقاس 25 ملم من طعام الذباب. ضع من سبعة إلى 16 ذبابة فاكهة متزاوجة في القارورة.

اسمح للإناث بوضع البيض لمدة ساعتين إلى أربع ساعات أو حتى يكون هناك حوالي 30 بيضة لكل قارورة. احتضان البيضة التي تحتوي على قوارير عند 25 درجة مئوية برطوبة 70٪ كحد أدنى. بعد خمسة أيام ، وصلت اليرقات إلى أواخر الطور الثالث.

املأ طبق تشريح من تسعة أكواب بوسط الرنين. بعد ذلك ، قم بإعداد قوالب مصنوعة خصيصا مزودة بشبكة من النايلون في طبق بتري الذي يحتوي على جرس. متوسط. ضع الطبق على الثلج باستخدام ملقط ناعم.

اختر 10 إلى 15 يرقة من جدران القارورة وضعها في طبق التشريح. ضع طبق التشريح تحت المجهر لاختيار الإناث وتشريحها. يمكن تمييز اليرقات الأنثوية عن الذكور من خلال حوافها.

يمكن التعرف على خصيتين الذكور بسهولة على أنهما بيضاويتان كبيرتان وواضحتان مدمجتان في الثلث الخلفي من الجسم الدهني. يمكن تحديد المبايض الأنثوية الموجودة في نفس الجزء من الجسم الدهني على أنها كرات مستديرة أصغر وواضحة. إذا لم يكن المبايض مرئية ، يتم التعرف على اليرقات الأنثوية من خلال عدم وجود الخصيتين.

نقل يرقات أنثى إلى بئر نظيف لبدء التشريح ، استخدم الملقط لتثبيت اليرقات خلف الدماغ مباشرة. قم بإزالة الرأس بزوج ثان من الملقط. ضع الجزء الخلفي المتبقي من اليرقات على الجانب الظهري بحيث تكون القصبة الهوائية متجهة لأسفل.

امسك اليرقات بواسطة الكروية الخلفية بزوج واحد من الملقط. ثم ادفع الملقط إلى الداخل ببطء في نفس الوقت ، واستخدم الزوج الآخر من الملقط لتحريك البشرة للخلف حتى يظهر حوالي نصف جسم دهون اليرقات بقوة. أمسك الطرف الخلفي للبشرة بزوج واحد من الملقط وامسك بقية البشرة بشكل غير محكم مع الزوج الآخر برفق وسحب الطرف الخلفي ببطء حتى تنزلق البشرة والأمعاء المرفقة عبر الفجوة.

في نهاية هذه العملية ، افصل الأمعاء والبشرة عن الجزء الأمامي من الجسم الدهني. بلل ماصة المراعي جيدا باستخدام حلقات متوسطة من بئر تحتوي على يرقات مشرحة. استخدم ماصة المراعي لنقل الجسم الدهني إلى وسط الرنين المثلج البارد في مصفاة الخلية.

الخطوة التالية هي إصلاح المستحضر وصخمه عند 5٪ فورمالديهايد في وسط الرنجر واحتضان الجسم الدهني لمدة 20 دقيقة مع تحريك لطيف على شاكر مداري. ما لم يتم تحديد جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة. اغسل الجسم الدهني ثلاث مرات باستخدام 1٪ PBT في المرة الأولى لمدة خمس دقائق ، والمرة الثانية لمدة 10 دقائق ، والمرة الثالثة لمدة 45 دقيقة.

كتلة مع 0.3٪ PBTB لمدة ساعة واحدة مع تحريك لطيف. بعد التحريض. انقل الجسم الدهني إلى أنبوب 0.2 ملليلتر.

قم بإزالة السائل الزائد وأضف الجسم المضاد الأول المطلوب المخفف في 0.3٪ PBTB واحتضانه طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع تحريك لطيف على الأسطوانة. في اليوم التالي ، انقل الجسم الدهني مرة أخرى إلى القالب. بعد ذلك ، اغسل الجسم الدهني ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منها بنسبة 0.3٪ PBTB مع تحريك لطيف.

ثم الحظر ب 0.3٪ PBTB مكمل ب 5٪ مصل حمار عادي لمدة ساعة واحدة. مع التحريك اللطيف ، انقل الجسم الدهني إلى أنبوب 0.2 مليلتر وأضف جسما مضادا فلوريا ثانويا مناسبا مخففا في محلول الحظر. ضع الأنبوب في رف وضع الرف على بكرة احتضان لمدة ساعتين مع تحريك لطيف.

إذا كان الجسم المضاد فلوريا ، فقم باحتضانه في الظلام من هذه النقطة فصاعدا. بعد ساعتين ، انقل الجسم الدهني مرة أخرى إلى القالب واغسله ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة مع 0.3٪ PBT مع تحريك لطيف لتشريح المبايض وتركيبها. انقل الجسم الدهني إلى أنبوب أينور نظيف بعناية فائقة.

قم بإزالة جميع السوائل باستخدام ماصة المراعي وقم بتغطيتها على الفور بدرع ناقل وسائط التركيب. قم بقص نهاية طرف الماصة وشفط الجسم الدهني بعناية بأقل حجم من وسائط التثبيت. انقل الجسم الدهني إلى شريحة مجهرية.

تتمثل الخطوة التالية في استخدام حاملي دبابيس مطلية بالنيكل يحملان دبابيس قطرها 0.1 ملم لنشر الجسم الدهني تحت مجهر استريو ، وتوطين المبايض من خلال النظر في الثلث الخلفي من الجسم الدهني. الجسم الدهني له شكل زهرة حيث يحيط بالمبايض. قم بتشريح الزهور من باقي الجسم الدهني وتخلص من السلم.

قم بإزالة الجسم الدهني المحيط بالغدد التناسلية عن طريق عبور الدبابيس حوله بعناية وإغاظته بعيدا عن المبيض. ضع الغدد التناسلية المعزولة على الشريحة بعيدا عن بقايا الجسم الدهنية وتخلص من بقايا الجسم الدهنية. قم بتغطية الشريحة بالغطاء.

انزلق وختم بطلاء الأظافر. تصور المبيض مباشرة باستخدام مجهر متحد البؤر. هذه الأرقام مأخوذة من اثنين من المبيضين الثلاثة الملطخين بمجموعات مختلفة من الأجسام المضادة.

في الصورة الأولى ، يحدد أحد الأجسام المضادة الخلايا الجسدية والبقع. الفوزو المشار إليه بالأسهم عبارة عن عضيات داخل الخلايا. داخل الخلايا الجرثومية البدائية ، الموضحة باللون الأخضر ، توجد خلايا الخيوط الطرفية والغطاء ، والتي تشكل معا الخلايا الجسدية للمكانة ، ويشير رأس السهم إلى خلايا الغطاء.

يوضح هذا الشكل الخلايا المختلطة في اللون الأرجواني ، والتي تتصل مباشرة بالخلايا الجرثومية الموضحة باللون الأزرق. يتم تحديد الخلايا الجسدية للمبيض باللون الأخضر بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية لاستكشاف التكوين المتخصص وإنشاء الخلايا الجذعية في مبيض تيزو.