تعديل العمليات العصبية والنقل الميتوكوندريا : تصوير مباشر في الخلايا العصبية الحصين خلال فترات طويلة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور انتقال الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المستنبتة على مدى فترات زمنية طويلة باستخدام مجهر الفلورة للخلايا الحية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق وسم الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المستنبتة ببروتين فلوري يستهدف عضيات الخلية. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في التقاط صور لانتقال الميتوكوندريا تحت ظروف ضابطة.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في الحصول على سلسلة من الصور بفاصل زمني لنقل الميتوكوندريا بعد الإعطاء الحاد لمعدلات عصبية مثل السيروتونين. والخطوة النهائية من الإجراء هي إجراء تحليل لسلسلة الصور التي تم الحصول عليها بفاصل زمني. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر أن النواقل العصبية تعدل عملية نقل الميتوكوندريا.

لا يتم تحقيق مثل هذه النتائج إلا من خلال تصوير الميتوكوندريا الموسومة فلوروسنتياً في الخلايا العصبية على مدى فترات زمنية طويلة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالتقنيات الحالية، مثل الوسم بالصبغات الحيوية أو عفن GFP العابر، في أنها تجعل من الممكن إجراء ملاحظات طويلة الأمد لنقل الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المستزرعة السليمة. وسيقوم تشين، وهو زميل مساعد من مختبري، بتوضيح هذا الإجراء، وذلك من أجل توفير بيئة مستقرة من حيث الحرارة والرطوبة.

يتم توصيل الحاضنة الموجودة أعلى المنصة بحاضنة قياسية لزراعة الأنسجة عبر دائرة مغلقة، ويسمح غطاء غشاء A-P-F-T-E لأطباق زراعة ذات قاعدة زجاجية بقطر 35 مليمتر بتبادل الغازات بين المزرعة العصبية والبيئة داخل الحاضنة. وتتيح هذه الميزات وغيرها من الخصائص الملاحظة طويلة المدى للخلايا العصبية المستزرعة تحت ظروف تجريبية متنوعة. انقل طبق المزرعة الذي يحتوي على الخلايا العصبية المستزرعة في الحصين، والتي تعبر عن بروتين mito turbo red، إلى غطاء زراعة الأنسجة.

استبدل الغطاء البلاستيكي بغطاء غشاء PFTE وانقل طبق الزرع إلى المجهر. ثبّت قاعدة الحاضنة بمنصة المجهر، ثم قم بتركيب طبق الزرع المغطى بالغشاء بعناية في موضعه. وفي الفتحة الغائرة، قم بمحاذاة غلاف الحاضنة مع القوائم الفولاذية الموجودة على قاعدة الحاضنة ثم أنزل الغلاف فوق القاعدة.

أحكم ربط براغي الإبهام حتى يتم تحقيق ختم جيد بين الغلاف والقاعدة. قم بتشغيل وحدة التحكم في عجلة مرشح المجهر، ومصدر الضوء، وكاميرا CCD قبل فتح برنامج التصوير. في هذا البروتوكول، تُستخدم الشريحة رقم خمسة لالتقاط الصور.

انتقل إلى عدسة شيئية غمر زيتية بقوة 63x ثم اخفض برج العدسات. ضع زيت الغمر بعناية على سطح العدسة الشيئية. انقر على أيقونة نافذة التركيز في شريط الأدوات، وقم بتشغيل مصباح الحقل المضيء عن طريق تحريك منزلق المصباح.

لتعديل شدة الضوء، قم بضبط التركيز على مجال من الخلايا باستخدام العدسات العينية وابحث عن الخلية المستهدفة. اختر مرشح XI three من علامة تبويب المجهر (scope)، ثم حدد مستوى التركيز للميتوكوندريا في الخلايا التي تم وسمها ببروتين mito turbo red، وبعد ذلك انتقل إلى كاميرا CCD. انقر على أيقونة التقاط الصور في شريط الأدوات، مع البدء بزمن تعريض أولي قدره 100 milliseconds.

حدد التعريض الضوئي الأمثل باستخدام خياري "test" و"find best" الموجودين في نافذة الالتقاط (capture window). ومن قائمة "capture type"، حدد خيار التصوير الزمني (time-lapse)، ثم اختر الفاصل الزمني للتصوير ومدة جلسة التصوير المطلوبة من خيارات التقاط التصوير الزمني (time-lapse capture options).

ابدأ عملية الحصول على الصور بنظام التصوير الزمني (time-lapse) من خلال النقر على زر البدء الموجود في الركن السفلي الأيمن من نافذة الالتقاط. بعد الانتهاء من جلسة تصوير ضابطة، قم بإعطاء النواقل العصبية أو الكواشف الأخرى عبر منافذ الحقن الموجودة في الجزء العلوي من الحاضنة المثبتة فوق المنصة. عند إضافة ناهض مستقبلات السيروتونين 8-OH-DPAT، تتحرك الميتوكوندريا التي كانت ثابتة سابقاً والمشار إليها برأس السهم على طول محور العصبون في الحصين.

تم تلخيص متوسط السرعة والاتجاه للميتوكوندريا الفردية قبل إضافة السيروتونين. كانت غالبية الميتوكوندريا ساكنة، ومع ذلك، بعد إضافة السيروتونين، أظهرت 42% من الميتوكوندريا حركة اتجاهية وقطعت مسافات أطول من تلك التي أظهرت حركة اتجاهية في غياب السيروتونين. وعلى العكس من ذلك، عند إضافة الدوبامين، كانت 92% من الميتوكوندريا ساكنة خلال الـ 15 دقيقة الأخيرة من جلسة التصوير التي تلت هذا الإجراء.

يمكن تنفيذ طرق أخرى لمراقبة أكثر من إشارة واحدة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية. على سبيل المثال، كيف ترتبط نشاطات الكالسيوم والنقل الميتوكوندري في الخلايا العصبية.