Name: تسجيل خلية كاملة من إعداد عضوي النمط شريحة من القشرة المخية الحديثة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: تعلم تسجيل الخلايا الكاملة من شرائح القشرة المخية النمطية باستخدام الفئران الصغيرة. تتيح هذه الطريقة دراسة الخصائص الكهربائية للخلايا الهرمية بعد التحوير الجيني.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أود أن أشكر ومايومي Sakuraba Foehring ريبيكا لتقديم المساعدة التقنية العالقة. بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نشكر الدكاترة. رودريغو اندرادي للمساعدة في تنفيذ عضوي النمط ثقافة شريحة والبروتوكولات ترنسفكأيشن biolistic والدكتور جين Nerbonne لتزويدنا يبني لترنسفكأيشن [كدنا]. وأيد هذا العمل عن طريق منح المعاهد الوطنية للصحة : من NS044163 NINDS (لإطار التعاون الإقليمي).

<ol><li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li>
<li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li>
<li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li>
<li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+Abstr%22%5BJournal%5D)">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
<li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

لقد تم دراسة الأدوار الوظيفية للتعبير والجهد بوابات قنوات البوتاسيوم في الخلايا العصبية المخية الحديثة هرمي من الفئران (4 ، 9-11). بسبب عدم وجود وكلاء الدوائية محددة لهذه القنوات ، ونحن نستخدم منهج التعبير الجيني لمعالجة القناة (1،14،15،17-19). نحن نستخدم استعدادا الثقافة عضوي النمط (2،3 ؛ 5-8 ؛ 12،13،15-22). معدلة من نهج Stoppini وآخرون (16) ، من أجل الحفاظ على التشكل الخلية ونمط الصفحي من القشرة. نحن عزل شرائح القشرة المخية الحديثة الحادة في الأيام التالية للول...

جراحة / ترنسفكأيشن / ثقافة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدماغ القطاعة : Campden Vibroslice # MA572 الآلات الدقيقة العالمي ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غون جين النظام : بيو راد هيليوس # 165-2431 (بيو راد مختبرات ، 1000 ألفريد نوبل محرك ، هرقل ، CA 94547) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويشمل : مدفع الجينات والهليوم مع التجمع خرطوم ، منظم أنابيب محطة الإعدادية (# 165-2418) ، طقم حقنة ، وأنابيب Tefzel ، قطع الأنابيب ، طقم التحسين (# 165-2424) ، قطع الأنابيب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوي راد الهليوم منظم (# 165-2413) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوازم المتاح لهيليوس من بيو راد : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.6 ميكرومتر Microcarriers الذهب : # 165-2264 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tefzel الأنابيب : # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحاضنة : فورما النموذج العلمي # 3110 (الحرارية العلمية : (866) 984-3766). </li></ol> وسائل الإعلام : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصان المصل : Hyclone المانحة الخيول # SH 30074. (HyClone ، 925 جنوب غرب 1800 ، لوغان ، UT 84321) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HMEM (وسائل الإعلام بالإضافة إلى الحد الأدنى الأساسي وHBSS HEPES ، لا الجلوتامين : Lonza BioWhittaker كتالوج # 12 - 137F) : GIBCO / INVITROGEN ، (800) 955-6288 ، الخيار 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (GIBCO هانكس مخزنة المالحة ، # 24020-117) : GIBCO / INVITROGEN ، (800) 955-6288 ، الخيار 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MEM (GIBCO الوسيلة الأساسية الدنيا ، # 12360-038) ، GIBCO / INVITROGEN ، (800) 955-6288 ، الخيار 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 مل ميليبور 0.2 ميكرون تصفية : # SC6PU02RE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصات تحويل البلاستيك : # 13-711-20 فيشر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 مل ميليبور steriflip 0.22 ميكرون تصفية (# SCGP00525) </li></ol> 6-8 العناصر التي تم الحصول عليها من : العلم فيشر ، 1241 الجادة السفير ، صندوق بريد 14989 ، سانت لويس ، MO 63132. تسجيل : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزجاج الماصة : هارفارد GC150TF - 10 : جهاز هارفارد ، 84 أكتوبر هيل الطريق ، Holliston ، ماساتشوستس 01746 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوتر P - 87 مجتذب الكهربائي الأفقي : سوتر شركة الصك ، واحد محرك الرقمية ، نوفاتو ، CA 94949 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محوار مكبر للصوت آلات Multiclamp 700B : الأجهزة الجزيئية ، وشركة محرك 1311 أورليانز ، سانيفيل ، CA 94089-1136 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PClamp 10 برنامج للحصول على البيانات : أجهزة الجزيئية ، وشركة ، 1311 اورليانز محرك ، سانيفيل ، CA 94089-1136 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التحكم موقف lectrode مع المتلاعبين ROE - 200 سوتر وPC - 200 تحكم : آلات شركة سوتر ، واحد محرك الرقمية ، نوفاتو ، CA 94949. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المجهر : أوليمبوس BX - 50WI المجهر تستقيم مع IR - DIC البصريات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IR - حساسة الكاميرا OLY - 150 (أوليمبوس) أو DAGE - MTI (MTI DAGE - ، 01 شارع شمال Roeske ، ميشيغان المدينة ، 46360). </li></ol>

تسجيل خلية كاملة من إعداد عضوي النمط شريحة من القشرة المخية الحديثة

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

لقد تم دراسة الأدوار الوظيفية للتعبير والجهد بوابات قنوات البوتاسيوم في الخلايا العصبية المخية الحديثة هرمي من الفئران. بسبب عدم وجود وكلاء الدوائية محددة لهذه القنوات ، اتخذنا نهجا وراثية لمعالجة التعبير القناة. نستخدم إعداد عضوي النمط الثقافة (16) من أجل الحفاظ على التشكل الخلية ونمط الصفحي من القشرة. نحن عادة عزل شرائح القشرة المخية الحديثة الحادة في 8-10 أيام بعد الولادة ، والحفاظ على شرائح في الثقافة لمدة 3-7 أيام. وهذا يسمح لنا لدراسة الخلايا العصبية في سن مماثلة لتلك التي في عملنا مع شرائح الحادة ، ويقلل من تطور مثير للاتصالات مندفعا في شريحة. نسجل من العصبونات الهرمية بصريا المحددة في طبقات الثاني / الثالث أو الخامس الإضاءة باستخدام الأشعة تحت الحمراء (IR) وعلى النقيض التدخل التفاضلية المجهري (DIC) مع كل خلية في المشبك التصحيح الحالي أو المشبك الجهد. نستخدم biolistic (بندقية الجينات) من نوع ترنسفكأيشن البرية أو متحولة قناة البوتاسيوم الحمض النووي لمعالجة التعبير عن قنوات للدراسة وظائفها. يتم التعرف عليها بسهولة بواسطة الخلايا transfected المجهري epifluorescence بعد ترنسفكأيشن بالتعاون مع [كدنا] لبروتين الفلورية الخضراء (GFP). قارنا تسجيلات من الخلايا إلى الخلايا العصبية transfected ، untransfected المجاورة في نفس الطبقة من شريحة واحدة.

هذا هو بروتوكول لإعداد والحفاظ على القشرة المخية الحديثة في إعداد شريحة الثقافة عضوي النمط لغرض صنع التسجيلات الكهربائية من العصبونات الهرمية.

لقد كنا ندرس تعبير الأدوار الوظيفية لقنوات البوتاسيوم المبوبة بالجهد في العصبونات الهرمية من القشرة الجديدة للجرذان. ونظراً لـ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على تسجيلات كهربائية من العصبونات المجاورة للمعدن (parametal neurons) في شرائح عضوية النمط من القشرة الجديدة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق قطع شرائح حادة من الجرذان في أعمار ما بعد الولادة من P 8 إلى P 10. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إجراء ترانسفكشن Bic لـ CD NA. أما الخطوة الثالثة من الإجراء فهي استزراع الشرائح لمدة تتراوح من ثلاثة إلى سبعة أيام.تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في الحصول على تسجيلات كهربائية من الخلايا المنقولة جينياً باستخدام تثبيت التيار أو تثبيت الجهد. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر أن الخلايا المجاورة للمعدن في الشرائح العضوية تمتلك خصائص مماثلة لتلك الموجودة في الشرائح الحادة من نفس العمر. ولا يؤدي نقل GFP جينياً إلى تغيير هذه الخصائص، مما يسمح بدراسة الخلايا العصبية بعد التلاعب الجيني بالقنوات الأيونية من خلال تسجيلات تثبيت التيار أو الجهد للخلية الكاملة.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية، مقارنةً بالشرائح الحادة مثلاً، في إمكانية الحفاظ على الخلايا في بيئة طبيعية لفترة كافية تسمح بالتعديل الجيني للقنوات الأيونية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال القنوات الأيونية، مثل الأدوار الوظيفية لأنواع محددة من القنوات الأيونية. قم بتجهيز غطاء التدفق الصفائحي، وغطاء تدفق الفراغ، والمستلزمات الجراحية والمحاليل كما هو محدد في المخطوطة المرفقة. ارتدِ القفازات في جميع الخطوات اللاحقة بعد ترشيح الجزء المجهز من محلول القطع بحجم 250 milliliters، ثم اسحب منه 40 milliliters في بيكر سعة 50 milliliter.ضع غرفة القطع، والحصة المقدارها 40 milliliter، والـ 210 milliliters المتبقية من محلول القطع في المجمد عند درجة حرارة minus 20 °C تحت غطاء التدفق الصفائحي. ضع 1.1 milliliters من وسط الزرع في ثلاث آبار قطرية من طبق سداسي الآبار. كرر هذه العملية لمرة ثانية.طبق سداسي الفجوات. ضع الأطباق سداسية الفجوات في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد ذلك، استخدم مقصاً معقماً لتقصير أربع ماصات نقل لاستخدامها في نقل الشرائح.يتم الاحتفاظ بثلاث ماصات أخرى دون تغيير عندما تتحول المحاليل إلى مخاليط شبه مجمدة. أخرج الحصة البالغة 40 milliliter من محلول التقطيع من المجمد وضعها تحت غطاء الشفط. قم بفقاعتها بـ 95% oxygen و 5% carbon dioxide.بعد ذلك، أخرج 210 milliliters من محلول القطع من المجمد وضعه تحت غطاء التدفق الصفائحي للفقاعات. يتم تشبيعه أيضاً بـ 95%oxygen و 5%carbon dioxide. بعد ذلك، أخرج وسط الغسيل من الثلاجة وقم بفقعه بـ 100%oxygen تحت غطاء التدفق الصفائحي.ضع 2 mL من وسط الزرع في طبق بتري. ضع ما تبقى من وسط الزرع في الثلاجة لاستخدامه في تغيير الوسط خلال الأسبوع تمهيداً لتقطيع الدماغ. صب حوالي 10 mL من محلول التقطيع البارد من الكأس سعة 50 mL إلى كأس سعة 25 mL تحت غطاء الشفط.بعد التخدير وفصل الرأس، استخرج دماغ جرذ يبلغ من العمر 8 إلى 10 أيام بعد الولادة. اغسل الدماغ في الكأس الذي يحتوي على 30 milliliters من محلول التقطيع البارد لمدة 30 ثانية تقريبًا. ثم انقل الدماغ بعناية إلى الكأس سعة 25 milliliter.قم بتغيير القفازات وتشبيعها بالإيثانول. ثم انقل الدماغ الموجود في محلول القطع البارد إلى غطاء التدفق الصفائحي. الخطوة التالية هي توجيه الدماغ وتثبيته عن طريق إزالة المخيخ والقطب الجبهي وإجراء قطع سهمي وسطي جزئي، ثم لصق الدماغ المثبت على المنصة بحيث تكون القشرة الجبهية للأعلى.أجرِ شقوقاً إضافية بالمشرط حسب الحاجة لتقليل حجم الشرائح. ثم ضع المنصة التي تحتوي على الدماغ داخل غرفة التقطيع المعدنية المعقمة، وثبّتها في جهاز تقطيع الأنسجة المهتز.املأ الحوض بمحلول القطع الفقاعي المبرد بالثلج. اسكب 30 milliliters من محلول القطع المتبقي في دورق سعة 50 milliliter وقم بضخ فقاعات من 95%oxygen و 5%carbon dioxide. سيُستخدم هذا الدورق لتجميع الشرائح.قم بقطع شرائح إكليلية بسمك 250 ميكرون من القشرة الجبهية الجدارية. ضع ست شرائح على الأقل في بيكر سعة 50 ملليلتر يحتوي على محلول القطع. بعد ذلك، ضع حوالي 2 ملليلتر من وسط الغسيل في طبق بتري بقطر 35 مليمتر.باستخدام ماصة مقطوعة، انقل الشرائح من محلول التقطيع إلى طبق بتري الذي يحتوي على وسط الغسيل. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام ماصات جديدة لإضافة الوسط ولسحب المحاليل العادمة بعد الغسيل، ثم انقل الشرائح إلى طبق بتري قياس 35 مليمتر الذي يحتوي على وسط الزرع. بعد ذلك، قم بإزالة الأغطية العلوية من عبوات الإدراجات الشبكية، مع ترك الإدراجات داخل العبوات.بعد ذلك، استخدم ملقطاً لرفع إدراج شبكي واحد من عبوته باستخدام ماصة نقل مقطوعة. انقل شريحة واحدة من وسط الزرع إلى الشبكة. أدخل الشريحة وثبّتها في منتصف الغشاء باستخدام ماصة نقل سليمة.أزل أي زيادة من وسط الزرع. الآن، ضع الغشاء الشبكي الذي يحتوي على الشريحة في أحد الآبار المملوءة بالسائل في طبق ذي ستة آبار. كن حذراً لمنع تكون فقاعات هوائية تحت الغشاء الشبكي بعد وضع شريحة واحدة في كل بئر من الآبار المملوءة بالسائل.أعد وضع كلا الطبقين ذوي الستة آبار في الحاضنة، واتركها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة تقريبًا. وفي هذه الأثناء، قم بتنظيف منطقة العمل أسفل غطاء التدفق الصفائحي استعدادًا لعملية التعداء. الخطوة التالية هي تحميل مسدس الجينات BioRad Helios، مع ترك الموضع الأول فارغًا.قم بتحميل خرطوشة تحتوي على حبيبات مغلفة بـ CD NA في كل موضع بديل من حامل الخراطيش في مسدس الجينات. ثم ضع حامل الخراطيش في مسدس الجينات. أولاً، قم بتطهير المسدس عن طريق إطلاق النار من ماسورة خالية من الحبيبات.بعد ذلك، قم بتحريك الأسطوانة إلى خرطوشة تحتوي على CDNA.Bullets. أخرج أطباق الستة آبار من الحاضنة وضعها تحت غطاء التدفق الصفائحي؛ مع إمساك المسدس بشكل عمودي فوق الجزء العلوي من طبق الستة آبار، قم بإطلاق شريحة عند ضغط 100 PSI، ثم حرك الأسطوانة وقم بتفريغها مرة أخرى عن طريق إطلاق طلقة فارغة. قم بإطلاق الشرائح المتبقية بمعدل طلقة واحدة لكل شريحة.بعد التصوير، أعد أطباق الستة آبار إلى الحاضنة وقم بتحضين الشرائح عند 37 درجة Celsius لمدة تتراوح من يومين إلى سبعة أيام مع 5% carbon dioxide خلال فترة التحضين. استبدل الوسط الغذائي كل يومين على النحو التالي: أثناء العمل تحت غطاء التدفق الصفائحي، أضف وسطاً غذائياً جديداً إلى الآبار الثلاثة غير الشاغرة. ثم ضع طبق الستة آبار في الحاضنة لمدة ساعة واحدة على الأقل؛ وبعد مرور ساعة، أعد طبق الستة آبار إلى غطاء التدفق الصفائحي واستخدم ملاقط منحنية منظفة بالإيثانول لنقل كل حشوة شبكية مع الشريحة الخاصة بها إلى بئر جديد، ثم اشفط الوسط الغذائي القديم وأعد الطبق إلى الحاضنة.بعد عدة أيام من الحضن، تصبح الشرائح الآن جاهزة لتسجيلات الخلية الكاملة. قم بإزالة طبق ذي ستة آبار من الحاضنة تحت غطاء التدفق الصفائحي. استخدم ملاقط منحنية منظفة بالإيثانول لإزالة إدراج شبكي واحد والشريحة الموجودة به.بعد ذلك، أعد لوحة الستة آبار إلى الحاضنة. بعد ذلك، انقل طبق بتري الذي يحتوي على الإدراج الشبكي والشريحة إلى منطقة التسجيل، مع تطبيق الشد باستخدام ملقط أو قطعة معدنية مرنة. استخدم مشرطاً من رقم 11 لقص الشبكة بعيداً عن محيط الشريحة إذا لزم الأمر، وأنهِ القصات النهائية باستخدام المقص.بعد ذلك، استخدم الملقط لنقل الشريحة والشبكة الملحقة بها إلى غرفة التسجيل. وعلى منصة مجهر رأسي، اغمر الشريحة في سائل نخاعي شوكي اصطناعي مشبع بالكربوجين تحت بصريات IR DIC. قم بتصوير العصبونات الجدارية الجانبية (parametal neurons) في الطبقتين الثانية أو الثالثة أو الخامسة تحت الفلورة فوق البؤرية (epi fluorescence) وباستخدام مرشح fitz.حدد موقع الخلايا المنقولة ذات اللون الأخضر باستخدام مجهر IR DIC. ابحث عن جزيئات CDNA، والتي تظهر كنقاط سوداء صغيرة داخل الخلايا. اختر خلية منقولة لإجراء تسجيل للخلية بأكملها.بعد ذلك، قم بتقريب قطب كهربائي دقيق من الخلية المختارة واستخدم شفطاً خفيفاً لتحقيق ختم بجيجا أوم. ثم طبق شفطاً إضافياً للاختراق إلى داخل الخلية من أجل تسجيل الخلية الكاملة. الخلية الآن جاهزة لتسجيلات تثبيت التيار أو تثبيت الجهد.يوضح هذا الشكل صورة فلورية لخلايا تم ترانسفكشنها بـ CDNA الخاص بـ GFP. التسجيلات التالية مأخوذة من خلايا تم ترانسفكشنها بـ CDNA الخاص بـ GFP. يظهر هنا جهد فعل في خلية parametal من الطبقة الثالثة استجابةً لحقن تيار لمدة 10 millisecond فوق العتبة.يوضح هذا الشكل إطلاقاً متكرراً من عصبون جنيب قشري (parametal neuron) في الطبقة الخامسة استجابةً لحقن تيار بقوة 400 pico amp لمدة ثانيتين. ويوضح هذا الشكل تسجيلاً باستخدام مثبت الجهد (voltage clamp) من عصبون جنيب قشري في الطبقة الخامسة. وقد استُخدم التترودوتوكسين (Tetrodotoxin) لحصر تيار الصوديوم المعتمد على الجهد.تمثل المسارات تيارات البوتاسيوم الخارجة الناتجة عن سلسلة من خطوات الجهد الكهربائي بمدة 500 millisecond من جهد تثبيت قدره -70 millivolts. وبمجرد إتقان العملية، يمكن إجراء التحضير والترانسفكشن البسيط في غضون ساعتين تقريباً، بما في ذلك وقت التحضير. عند محاولة تطبيق هذا الإجراء.من المهم الحفاظ على الظروف المعقمة والالتزام بسُمك وأبعاد الشريحة لمنع الجفاف. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجربتكم.شكراً لك.

whole-cell-recording-from-an-organotypic-slice-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يصف هذا البروتوكول مقايسة شريحة عضوي النمط الأمثل للدماغ بعد الولادة وعالية الدقة الوقت الفاصل بين التصوير الهجرة neuroblast في تيار الهجرة منقاري.

والفحص عن عضوي النمط شريحة الوقت الفاصل بين التصوير عالية الدقة للهجرة الخلايا العصبية في الدماغ بعد الولادة

يوضح هذا الفيديو وضع ماصة دقيقة مدببة بالقرب من شرائح الدماغ، لتشكيل ختم بخلية عصبية. يكسر الشفط غشاء الخلية ، وبالتالي يخلق مشبك رقعة للخلية بأكملها يتيح القياسات الحالية لتجارب الفيزيولوجيا الكهربية.

إنشاء تكوين مشبك جهد خلية كاملة للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية في شرائح الدماغ

يوضح هذا الفيديو طريقة لتصوير وتسجيل النشاط الكهربائي في وقت واحد من شرائح الدماغ المعدلة وراثيا التي تحتوي على بروتينات فلورية خاصة بالخلايا العصبية. يتضمن الإجراء الحفاظ على شريحة الدماغ في غرفة التروية باستخدام السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي الهوائي ، واستخدام مصدر ضوء لإثارة الخلايا المسماة بالفلورسنت ، وتسجيل الإشارات الكهربائية باستخدام مسبار متعدد القنوات ومشبك رقعة.

المراقبة البصرية والفيزيولوجية الكهربية المتزامنة للخلايا العصبية في شرائح الدماغ

التسجيلات الزوجية عبارة عن تسجيلات متزامنة لمشبك تصحيح الخلية بأكملها من خليتين خليتين عصبيتين متصلتين متشابكيا ، مما يتيح التوصيف الفيزيولوجي الكهربي والدوائي الدقيق للمشابك بين الخلايا العصبية الفردية. نصف هنا المنهجية التفصيلية والمتطلبات لإنشاء هذه التقنية في مزارع شرائح الحصين العضوية في أي مختبر مجهز للفيزيولوجيا الكهربية.

تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين

أصبحت بروتوكولات الحلقة المغلقة منتشرة بشكل متزايد في الفيزيولوجيا الكهربية الحديثة. نقدم طريقة بسيطة ومتعددة الاستخدامات وغير مكلفة لأداء بروتوكولات الفيزيولوجيا الكهربية المعقدة في الخلايا العصبية الهرمية القشرية في المختبر ، باستخدام جهاز كمبيوتر مكتبي ولوحة اقتناء رقمية.

في الوقت الحقيقي الكهربية: استخدام البروتوكولات ذات الحلقات المغلقة للتحقيق العصبية حيوية وما بعدها

هنا ، يتم تقديم إجراء لتنشيط بروتين عصبي بشكل انتقائي بنبضة قصيرة من الضوء عن طريق ترميز حمض أميني غير طبيعي تفاعلي ضوئي وراثيا في بروتين عصبي مستهدف يتم التعبير عنه في الخلايا العصبية في الثقافة أو في الجسم الحي.

مراقبة البصرية من البروتين العصبية باستخدام حمض أميني مصطنعة مشفرة وراثيا في الخلايا العصبية

يوضح هذا البروتوكول تنفيذ الأمثل N-الميثيل-د-أسلوب استرداد واقية جلوكاميني (نمدج) من إعداد شريحة الدماغ. يتم استخدام صيغة وسائط واحد موثوق بها الحصول على شرائح المخ السليمة من الحيوانات من أي سن وتطبيقات تجريبية متنوعة.

إعداد شرائح الدماغ الحادة باستخدام محسن N-الميثيل-د-أسلوب استرداد واقية جلوكاميني

في هذه الورقة، ونحن مناقشة الاستعدادات المخ الثلاثة المستخدمة لتسجيل المشبك التصحيح خلية كله للدراسة على حلبة ريتينوتيكتال من الضفادع الصغيرة ليفيس النمو . ويساهم كل إعداد، بمزاياه الخاصة، المقاييس التجريبية من شرغوف النمو كنموذج لدراسة وظيفة الدوائر العصبية.

الأعمال التحضيرية وبروتوكولات "كل خلية التصحيح المشبك تسجيل" ليفيس النمو تيكتال الخلايا العصبية

هنا، نحن تصف الخطوات الأساسية لتسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية من الخلايا العصبية في الدماغ جيلاتينوسا (سان جرمان) في شريحة الحبل الشوكي في المختبر . يسمح هذا الأسلوب خصائص الغشاء الجوهرية وانتقال متشابك وتوصيف الخصائص المورفولوجية سان جرمان الخلايا العصبية دراستها.

إعداد شرائح الحبل الشوكي الحاد لتسجيل كامل الخلية التصحيح-المشبك في الخلايا العصبية جيلاتينوسا الدماغ

هنا، نقدم بروتوكولات لإعداد شرائح الدماغ الحادة التي تحتوي على النواة الجينوسيلات الجانبية والتحقيق الكهرولوجيولوجي لوظيفة نقاط الاشتباك العصبي وcortinogeniculate. يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لدراسة نقاط الاشتباك العصبي مع احتمال الإفراج العالي والإفراج المنخفض في نفس شرائح الدماغ الحادة.

التحقيقات الكهرولوجية من وظائف المشبك وCorticogeniculate

نقدم هنا بروتوكولا يصف النقل الفيروسي لمناطق الدماغ المنفصلة ذات التركيبات البصرية الجينية للسماح بالتوصيف الكهروفسيولوجي الخاص بالمشابك العصبية في شرائح دماغ القوارض الحادة.

السابقين فيفو الاستجواب البصري الجيني للانتقال المتشابك بعيد المدى واللدونة من القشرة الجبهية الإنسية إلى القشرة التورية الجانبية

تعلم تسجيل الخلايا الكاملة من شرائح القشرة المخية النمطية باستخدام الفئران الصغيرة. تتيح هذه الطريقة دراسة الخصائص الكهربائية للخلايا الهرمية بعد التحوير الجيني.

تسجيل خلية كاملة من إعداد عضوي النمط شريحة من القشرة المخية الحديثة

استكشف المزيد من الفيديوهات