كشف اشارة المستجيب - مجمعات التكرير والتسويق لاستخدام BMP4 في الموقع جيش التحرير الشعبى الصينى ، وربط الفحص القرب
March 3rd, 2011
هنا نبين كيفية استخدام القرب ربط الفحص (PLA) ، مع مجموعة من الأجسام المضادة لبروتين العظام تصور التخلق (BMP) يشير في خلايا محددة. سمحت لنا هذه التقنية لمتابعة تراكم النووية الذاتية BMP - المستجيب تنشيط المجمعات وتحديد مستوياتها على مر الزمن تحت BMP4 التحفيز.
الهدف العام من التجربة التالية هو تصور وقياس إشارات BMP في خلايا زراعة الأنسجة. ترتبط BMPs بالمستقبلات الموجودة على سطح الخلية و PHOSPHOLATE ثلاثة ، ومؤثرات smad ، و smad one ، و smad five ، و SMAD ثمانية. تشكل هذه المجمعات مع أربعة smad وتنتقل إلى النواة حيث تنسق النسخ.
هنا نستخدم PLA لتصور المجمعات التي تتشكل بين مؤثرات SMA الذاتية و smad four في خلايا زراعة الأنسجة مع أو بدون تحفيز BMP. يبدأ هذا بالاستخدام الموازي لجسمين مضادين أساسيين ، أحدهما يتعرف على جميع المؤثرات الثلاثة الفسفرية ، SMMA ، والآخر يتعرف على أربعة أجسام مضادة ثانوية تسمى مجسات PLA لكل منها خيط DNA قصير فريد متصل به ، يرتبط بالأجسام المضادة الأولية حيث تكون مجسات PLA على مقربة. تتفاعل خيوط الحمض النووي من خلال إضافة لاحقة لدائرتين تشكلان قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي.
يتم ربطها ببعضها البعض عن طريق الربط الأنزيمي وتشكل دائرة يتم تضخيمها عن طريق تكرار الدائرة المتدحرجة بعد تفاعل التضخيم. يسلط تهجين مجسات قليل النوكليوتيدات التكميلية المسماة الضوء على البقع الفلورية للمنتج المرتبطة بتضخيم كل دائرية. منتج الحمض النووي مرئي بسهولة.
عند النظر إليها تحت المجهر الفلوري ، تتوافق البقع مع المجمعات بين المستجيب و seds و smad four ، مما يدل على إشارات BMP النشطة في الخلية. تتمثل المزايا الرئيسية لجيش التحرير الشعبى الصينى على الطرق الحالية في أنها سهلة الاستخدام وحساسة للغاية وبدون خلفية ، ويمكن استخدامها لتحديد إشارات BMP النشطة في الموقع. يعد مسار BMP ضروريا لتطوير العديد من الأعضاء والأنسجة وللعمليات بما في ذلك تكاثر الخلايا الجذعية وتمايزها.
يمكن استخدام PLA لمعالجة الأسئلة الرئيسية المتعلقة بديناميكيات إشارات BMP ومستوياتها وتوطين الخلايا الفرعية ، ولكن يمكن استخدامه أيضا للتشخيص. نظرا لأن هذا المسار يكمن وراء العديد من الأمراض ، يمكن استخدام BLA لدراسة مكونات معاملات الإشارة الأخرى ل BMP أو المسارات الأخرى ويمكن تكييفها للعمل على أقسام الأنسجة أو الأجنة الكاملة. لبدء مقايسة ربط القرب في الموقع ، قم بإعداد مزارع الخلايا العصبية ، يتم استزراع الخلايا العصبية في GMEM ، مكملة بنسبة 10٪ FBS ، أحماض أمينية غير أساسية ، مرة واحدة من البيروفات ، ومرة واحدة من الجلوتامين L.
قم بتقسيم الخلايا باستخدام التربسين واللوحة 15 ، 000 إلى 20 ، 000 خلية لكل بئر. في شريحة غرفة 16 بئرا ، احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة بنسبة 5٪ لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة.
استبدل وسط المزرعة ب GMEM مكمل خال من المصل واحتضانه لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات أخرى لعناصر التحكم. احتفظ بثلاثة آبار مع الخلايا في ظل الثقافة والظروف الطبيعية بعد الحضانة الثانية. تثبيط مسار BMP عن طريق معالجة الخلايا بمورفين ظهري ميكرومولار أو تحفيز الإشارات عن طريق معالجة الخلايا باستخدام BMP أربعة لمدة 10 إلى 60 دقيقة.
بعد تحفيز الخلية ، قم بشفط الوسط من الآبار وغسل الخلايا برفق باستخدام PBS لتجنب انفصال الخلايا. لا تقم بسحب PBS مباشرة على الخلايا. ثم استنشق PBS وإزالة الغرف ، لكن اترك السيليكون حول الآبار.
أضف 50 ميكرولترا من 4٪ من الفورمالديهايد الطازج والمفلتر إلى الآبار واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تحريك. بعد التثبيت ، اغسل الخلايا باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التحريض في جرة copin. كرر الغسيل مرتين لثلاث غسلات.
بعد ذلك ، قم باختراق الخلايا بنسبة 0.5٪ Triton X 100 في PBS في جرة copin واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تحريض. ثم اغسل الخلايا بنسبة 0.05٪ من التين 20 و TB S3 مرات لمدة خمس دقائق لكل غسلة مع التحريض في جرة اقتران. ابدأ إجراء الحظر عن طريق النقر على الشريحة لإزالة محلول الغسيل النهائي.
الحرص على عدم ترك الخلايا تجف. أضف قطرة واحدة من رابط DUO إلى حل الحظر لكل منها. احتضان الخلايا جيدا في محلول مانع لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة مسخنة مسبقا تتكون من صندوق طرف ماصة فارغ بالماء المقطر.
لتحضير محاليل الأجسام المضادة الأولية ، قم بتخفيف مضاد الفوسفو smad 1 و 5 و 8 ومضاد SMAD أربعة واحد إلى 100 في الربط الثنائي اثنين من مخفف الجسم المضاد. استخدم كل جسم مضاد بمفرده ومجتمعة. الآن اضغط على الشريحة لإزالة محلول الحظر من الشريحة وإضافة 40 ميكرولترا من محاليل الأجسام المضادة إلى الآبار المناسبة والتحكم السلبي مع المخفف فقط يمكن تضمينها.
قم بهذه الخطوة بسرعة حتى لا تجف الخلايا. الآن احتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة مسخنة مسبقا لمدة ساعة واحدة. أثناء الحضانة ، قم بتخفيف مجسات جيش التحرير الشعبى الصينى في مخفف.
لكل تفاعل ، امزج ثمانية ميكرولترات من كل مسبار و 24 ميكرولترا من المخفف بحيث يتم تخفيف المجسات من واحد إلى خمسة في المحلول. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، اضغط على محلول الأجسام المضادة الأولية واغسل الشرائح مرتين باستخدام رابط Duo إلى Wash Buffer لمدة خمس دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة مع التحريك في وعاء اقتران. عند اكتمال عمليات الغسيل ، اضغط على المخزن المؤقت المتبقي للغسيل A من الشرائح وأضف 40 ميكرولترا من محلول مسبار PLA إلى كل منها.
حسنا ، احتضن الآن الشرائح عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة مسخنة مسبقا. لمدة ساعة واحدة ، يرتبط الثنائي بمخزون الربط وقم بإعداد حجم لمزيج الربط. عن طريق دوامة الرابط الثنائي أولا بمخزون الربط وتخفيفه مرة واحدة في ماء عالي النقاء.
ضع في اعتبارك أن إنزيم Ligase يضاف واحدا إلى 40 في هذا المحلول وهناك حاجة إلى 40 ميكرولترا من المزيج لكل بئر. بعد الحضانة ، اضغط على محلول مسبار PLA من الشرائح واغسلها مرتين باستخدام Wash Buffer. أ لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التحريك في وعاء اقتران أثناء الغسيل الأخير ، خذ مخارج Ligase المزدوجة في كتلة تجميد ثم أضفها إلى محلول الربط إلى التخفيف النهائي من واحد إلى 40 و Vortex.
الآن اضغط على الحجم النهائي ل Wash Buffer A من الشرائح وأضف 40 ميكرولترا من الربط. تخلط مع الإنزيم لكل منهما بينما ل. احتضان الشرائح في غرفة رطوبة مسخنة مسبقا لمدة 30 دقيقة.
عند 37 درجة مئوية ، قم بإذابة مخزون تضخيم وصلة DUO واستعد لخطوة التضخيم أثناء الحضانة عن طريق تخفيف مخزون تضخيم DUO Link في ماء عالي النقاء إلى مرة واحدة ، واحتفظ الكواشف بعيدا عن الضوء لأنها حساسة للضوء. عند اكتمال خطوة الربط ، اضغط على المحلول واغسل الشرائح مرتين باستخدام Wash Buffer A لمدة دقيقتين لكل منهما في درجة حرارة الغرفة مع التحريك في وعاء اقتران أثناء الغسيل الأخير ، أضف بوليميراز الارتباط الثنائي إلى محلول التضخيم إلى التخفيف النهائي 1 2 80 والدوامة. بعد النقر على مخزن الغسيل المؤقت ، أضف 40 ميكرولترا من التضخيم الممزوج إلى كل بئر واحتضان الشرائح في غرفة رطوبة مظلمة مسخنة مسبقا لمدة 100 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
بمجرد اكتمال حضانة التضخيم ، اضغط على محلول البوليميراز من الشرائح واغسلها في المخزن المؤقت B مرتين لمدة 10 دقائق لكل غسلة مع الغطاء النباتي في وعاء اقتران ، واحتفظ بالشرائح بعيدا عن الضوء أثناء هذه الخطوة لأن الكواشف حساسة للضوء. اتبع الغسلتين مع غمس 0.1 مرة المخزن المؤقت للغسيل B.Now قم بإزالة السيليكون تماما من 16. حسنا ، انزلق بعد ذلك عند حوالي 40 ميكرولتر من الثنائي.
قم بالربط بوسط التثبيت مع انزلاق الغطاء وضعه برفق فوق العينات ، واضغط عليه قليلا حتى لا تكون هناك فقاعات هواء أسفل زلة الغطاء ، وقم بتثبيت زلة الغطاء وإغلاقها على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر ، مما يسمح ب 15 دقيقة على الأقل قبل التصوير. هذه صور متحدة البؤر للخلايا التي عولجت باثنين من المورفين الظهري الميكرومولار ، وهو مثبط لمسار BMP أو معالجته ب 25 نانوغرام لكل مليلتر. BMP أربعة لمدة 60 دقيقة.
تم استخدام الأجسام المضادة ضد Phospho Smad 1 و 58 و Smad four للكشف عن مجمعات smad النشطة وينظر إليها على أنها بقع حمراء. حافظت الخلية النووية باللون الأزرق بواسطة نقطة في البوصة. تم حساب إشارات PLA باستخدام برنامج أداة صورة ارتباط DUO ويتم عرض متوسط عدد البقع في النواة لكل خلية في الرسم البياني.
لا يظهر أي تلطيخ عند استخدام أي من الأجسام المضادة الأولية بمفرده مما يشير إلى عدم وجود نتيجة خلفية لمجسات PLA والربط اللاحق لقليل النوكليوتيدات. وبالمثل ، لا يتم الكشف عن أي بقع في عنصر تحكم سلبي آخر ينبعث منه كلا الأجسام المضادة الأولية. في الخلايا العصبية اثنين من الخلايا A ، يكشف النشاف المناعي لصفحة SDS عن SMAD المرتبط بالفوسفو 1 5 8 في الخلايا غير المعالجة والمعالجة ب BMP.
ومع ذلك ، تنخفض مستويات الفوسفو سمد بشكل ملحوظ في الخلايا المعالجة بالمورفين الظهري. يوفر الجسم المضاد ضد PCNA تحكما في التحميل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اتباع الخطوات والإعداد الذي نقترحه للحصول على النتائج في أقل من ست ساعات بعد تثبيت الخلايا.
باختصار ، تمنع الخطوات حضانة الأجسام المضادة الأولية ، وحضانة مسببات جيش التحرير الشعبى الصينى ، وتضخيم الربط ، وتركيب التصوير.
نظرة عامة
توضح هذه الدراسة استخدام فحص الربط القريب (PLA) لتصور إشارات البروتين المورفولوجيني العظمي (BMP) في الخلايا الثابتة. تتيح التقنية تحديد كمية مجمعات المفعّل الفعّال المنشطة بواسطة BMP مع مرور الوقت تحت تحفيز BMP4.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- نقل الإشارة
الخلفية
- البروتينات المورفولوجينية العظمية ضرورية لنمو الأعضاء والأنسجة.
- تنظم عمليات مثل تكاثر الخلايا الجذعية وتمايزها.
- فهم ديناميكيات إشارات BMP ضروري لمعالجة الأمراض ذات الصلة.
- يوفر PLA طريقة حساسة لدراسة مسارات الإشارة هذه.
هدف الدراسة
- لتصور إشارات BMP في خلايا زراعة الأنسجة.
- لتحديد كمية تكوين مجمعات المفعّل استجابة لتحفيز BMP.
- لتقييم مزايا PLA على الطرق التقليدية.
الطرق المستخدمة
- زراعة خلايا Neuro 2A في ظل ظروف محددة.
- استخدام الأجسام المضادة الأولية للكشف عن المفعّلات المنشطة بفسفرة SMAD و SMAD4.
- تطبيق مسبار PLA للربط القريب.
- مجهر الفلورة لتصور المجمعات المتكونة أثناء إشارات BMP.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لمجمعات إشارات BMP في الخلايا.
- تحديد كمية مستويات إشارات BMP النشطة مع مرور الوقت.
- تبيان حساسية PLA وسهولة استخدامه.
- تطبيقات محتملة لتشخيص الأمراض المتعلقة بإشارات BMP.
الخلاصات
- PLA هي طريقة فعالة لدراسة ديناميكيات إشارات BMP.
- يمكن تكييف التقنية لمختلف الظروف التجريبية.
- يمكن أن تساهم الرؤى المكتسبة في فهم الأمراض المرتبطة بـ BMP.
الأسئلة المتكررة
Executive Industry Relevance
Detection of endogenous BMP signaling effector complexes using in situ PLA provides a sensitive, quantitative readout of pathway activation in fixed cells. This enables mechanistic de-risking of BMP-targeted therapeutic hypotheses by distinguishing between phosphorylation and functional complex formation. The assay supports target validation and assay development in early discovery by delivering spatially resolved, background-free quantification of signal transduction events.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of BMP signaling hypothesis by measuring endogenous phospho-Smad1/5/8–Smad4 complex formation as a functional readout of pathway activation.
- Operational Value: Provides high-sensitivity, low-background quantification of effector complexes, reducing false positives from phosphorylation-only detection methods.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing between Smad phosphorylation and nuclear translocation into transcriptionally active complexes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates discrete, countable fluorescent spots amenable to automated imaging and quantitative analysis for hit confirmation in screening campaigns.
- Reproducibility: Delivers standardized, amplification-based signal output that minimizes variability across operators and experimental runs.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and adaptable to high-content imaging platforms for longitudinal pathway modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links BMP signaling dynamics to pathophysiological processes in development, stem cell regulation, and tissue homeostasis relevant to degenerative and oncological indications.
- Translational Continuity: Enables comparison of pathway activity across in vitro models and primary tissues, supporting biomarker alignment in preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed Smad phosphorylation translates into functional effector complex formation, reducing attrition due to incomplete pathway engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing a quantitative, spatially resolved readout of BMP signal transduction competence.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring the formation of endogenous Smad effector complexes as a direct readout of BMP4-induced signaling.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, amplification-dependent spot formation that allows compound-induced pathway modulation to be quantified with high sensitivity.
- Analytics: Delivers quantitative nuclear spot counts per cell that facilitate comparison of signaling dynamics across time points, doses, and genetic or pharmacological perturbations.
- Translational Research: Connects in vitro BMP signaling measurements to pathophysiological relevance through subcellular localization and complex-specific detection, supporting biomarker-aligned preclinical models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable proximity detection platform adaptable to other signaling pathways (e.g., TGF-β, Wnt) via antibody pair substitution, maximizing reagent and workflow investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in BMP target validation by resolving active signaling complexes from inert phosphorylation events.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through enzymatic amplification and defined oligonucleotide ligation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing mechanistic ambiguity in early-stage BMP pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of BMP-modulating compounds based on functional complex formation rather than surrogate phosphorylation markers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, antibody validation, and fluorescence microscopy for spot detection and quantification.
- Dependent on access to Duolink PLA kit components, including PLA probes, ligation, and amplification enzymes, and a fluorescence microscope with appropriate filter sets.
- Necessitates standardization of fixation, permeabilization, and blocking conditions across laboratories to ensure consistent probe accessibility and signal-to-noise ratios.
- Adaptation to primary tissues or whole embryos requires optimization of permeabilization and antibody penetration while preserving subcellular localization of signaling complexes.
- Practical limitations include dependency on high-quality, validated antibody pairs and potential steric hindrance in densely packed subcellular compartments affecting probe proximity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
2:56
Plating of Cells and Treatment with BMP
4:12
Fixation and Permeabilization
10:56
In Situ Proximity Ligation Assay Results from Neuro2a Cells Treated with BMP4
6:49
The Proximity Ligation Assay (PLA)
5:26
Blocking and Primary Antibodies Application
9:54
Preparation for Imaging
12:18
Conclusion
