كشف اشارة المستجيب - مجمعات التكرير والتسويق لاستخدام BMP4 في الموقع جيش التحرير الشعبى الصينى ، وربط الفحص القرب

الهدف العام من التجربة التالية هو تصور وقياس إشارات BMP في خلايا الزرع النسيجي. ترتبط بروتينات BMP بمستقبلات على سطح الخلية وتعمل على فسفرة ثلاثة من مؤثرات smad، وهي smad one وsmad five وSMAD eight. تشكل هذه البروتينات معقدات مع smad four وتنتقل إلى النواة حيث تنظم عملية النسخ.

نستخدم هنا تقنية PLA لتصوير المعقدات التي تتشكل بين مؤثرات SMA الداخلية وsmad four في خلايا المزارع النسيجية مع أو بدون تحفيز BMP. يبدأ ذلك باستخدام متوازٍ لجسمين مضادين أوليين، أحدهما يتعرف على جميع مؤثرات smma المفسفرة الثلاثة، والآخر يتعرف على smad four. ترتبط أجسام مضادة ثانوية تسمى مسابير PLA، وكل منها متصل بسلسلة قصيرة وفريدة من DNA، بالأجسام المضية الأولية حيث تكون مسابير PLA في تقارب وثيق. تتفاعل سلاسل DNA من خلال إضافة لاحقة لاثنين من قليلات النيوكليوتيد من DNA المكونة لحلقات.

يتم ربط هذه القطع معاً عن طريق الربط الإنزيمي لتشكل دائرة يتم تضخيمها عبر تضاعف الدائرة المتدحرجة بعد تفاعل التضخيم. ويؤدي تهجين مجسات قليلة النيوكليوتيد المكملة والموسومة إلى إبراز البقع الفلورية للمنتج المرتبطة بتضخيم كل منتج DNA حلقي، مما يجعلها مرئية بسهولة.

عند فحصها تحت مجهر الفلورسنت، تشير البقع إلى معقدات بين البروتين المؤثر و seds و smad four، مما يدل على وجود إشارات BMP نشطة في الخلية. تكمن المزايا الرئيسية لتقنية PLA مقارنة بالطرق الحالية في سهولة استخدامها، وحساسيتها العالية، وخلوها من الخلفية، وإمكانية استخدامها لتحديد كمية إشارات BMP النشطة في الموقع. يُعد مسار BMP ضرورياً لتطور العديد من الأعضاء والأنسجة ولعمليات تشمل تكاثر الخلايا الجذعية وتمايزها.

يمكن استخدام تقنية PLA للإجابة على أسئلة جوهرية تتعلق بديناميكيات إشارات BMP، ومستوياتها، وتمركزها داخل الخلايا، كما يمكن استخدامها في التشخيص. وبما أن هذا المسار يكمن وراء العديد من الأمراض، يمكن استخدام BLA لدراسة مكونات نقل الإشارة الأخرى في مسارات BMP أو مسارات أخرى، ويمكن تطويعها للعمل على مقاطع نسيجية أو أجنة كاملة. لبدء مقايسة الربط التقاربي في الموقع، قم بتجهيز المزارع الخلوية؛ حيث تُزرع خلايا Neuro two A في وسط GMEM مدعم بنسبة 10% FBS و1× من الأحماض الأمينية غير الأساسية، و1× من البيروفات، و1× من L glutamine.

قم بفصل الخلايا باستخدام trypsin وزع 15,000 إلى 20,000 خلية لكل بئر. في شريحة حجرات مكونة من 16 بئراً، حضن الخلايا عند 37 درجة Celsius في حاضنة رطبة تحتوي على 5% carbon dioxide لمدة 24 ساعة. بعد مرور 24 ساعة.

استبدل أوساط الزراعة بوسط GMEM الخالي من المصل والمُدعم، ثم قم بالتحضين لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات إضافية لمجموعات الضبط. احتفظ بثلاث آبار تحتوي على خلايا تحت ظروف وزراعة طبيعية بعد التحضين الثاني. قم بتثبيط مسار BMP عن طريق معالجة الخلايا بـ 2 µM من dorsa morphine أو حفز التأشير عن طريق معالجة الخلايا بـ BMP four لمدة تتراوح من 10 إلى 60 دقيقة.

بعد تحفيز الخلايا، اسحب الوسط من الآبار واغسل الخلايا برفق باستخدام PBS لتجنب انفصال الخلايا. لا تقم بنقل PBS بواسطة الماصة مباشرة فوق الخلايا. ثم اسحب PBS وأزل الحجرات، مع ترك السيليكون حول الآبار.

أضف 50 µL من مادة para formaldehyde بتركيز 4% المحضرة حديثاً والمفلترة إلى الآبار، ثم حضنها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تقليب. بعد التثبيت، اغسل الخلايا باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التقليب في وعاء كوبين (copin jar). كرر عملية الغسل مرتين، ليكون المجموع ثلاث غسلات.

بعد ذلك، يتم جعل الخلايا نفوذة باستخدام 0.5%Triton X 100 في PBS داخل وعاء كوبين، وتُحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تحريك. ثم تُغسل الخلايا بـ 0.05%tween 20 وTBS ثلاث مرات، لمدة خمس دقائق لكل غسلة مع التحريك في وعاء اقتران. تبدأ إجراءات الحجب بالنقر على الشريحة لإزالة محلول الغسيل النهائي.

مع الحرص على عدم السماح بجفاف الخلايا، أضف قطرة واحدة من DUO link إلى محلول الحجب في كل بئر. حضّن الخلايا في محلول الحجب لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب مسبقة التسخين تتكون من صندوق رؤوس ماصات فارغ يحتوي على ماء مقطر.

لتحضير محاليل الأجسام المضادة الأولية، يتم تخفيف anti phospho smad 1 5 8 و anti SMAD four one بنسبة 1:100 في duo link two antibody diluent. يُستخدم كل جسم مضاد بمفرده وبدمجه مع الآخر. الآن، يتم النقر على الشريحة لإزالة محلول الحجب من عليها، ثم إضافة 40 µL من محاليل الأجسام المضادة إلى الآبار المناسبة، ويمكن تضمين ضابط سلبي باستخدام المخفف فقط.

نفذ هذه الخطوة بسرعة لمنع جفاف الخلايا. الآن، قم بحضن الشرائح عند 37 °C في غرفة رطبة مسخنة مسبقاً لمدة ساعة واحدة. وأثناء فترة الحضن، قم بتخفيف مسباري PLA في المحلول المخفف.

لكل خليط تفاعل، امزج 8 µL من كل مسبار و 24 µL من المذيب بحيث يتم تخفيف المسبارات بنسبة 1 إلى 5 في المحلول. بعد فترة تحضين لمدة ساعة واحدة، قم بتفريغ محلول الجسم المضاد الأولي واغسل الشرائح مرتين باستخدام Duo link to Wash Buffer a لمدة خمس دقائق في كل مرة في درجة حرارة الغرفة مع الرج في وعاء ربط. عند اكتمال عمليات الغسل، قم بتفريغ ما تبقى من Wash Buffer A من الشرائح وأضف 40 µL من محلول PLA probe إلى كل منها.

الآن، قم بحضن الشرائح عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة مسخنة مسبقاً. ولمدة ساعة واحدة، قم بتحضير حجم من خليط الربط باستخدام مخزون DuoLink ligation stock، وذلك عن طريق رج مخزون DuoLink ligation stock أولاً باستخدام جهاز vortex ثم تخفيفه بنسبة 1x في ماء عالي النقاء.

ضع في الاعتبار أن إنزيم Ligase يُضاف بنسبة 1 إلى 40 في هذا المحلول، وأن كل بئر يحتاج إلى 40 µL من الخليط. بعد التحضين، قم بإزالة محلول مسبار PLA من الشرائح عن طريق النقر عليها، ثم اغسلها مرتين باستخدام Wash Buffer. قم بذلك لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج في وعاء ربط خلال الغسلة الأخيرة، ثم أخرج Duo link Ligase وضعها في قالب تجميد، وأضفها بعد ذلك إلى محلول الربط للوصول إلى تخفيف نهائي بنسبة 1 إلى 40 ثم استخدم جهاز Vortex.

الآن، قم بتصريف الحجم النهائي من Wash Buffer A من الشرائح وأضف 40 µL من خليط الربط (ligation). اخلط الإنزيم مع كل شريحة برفق. ثم قم بتحضين الشرائح في غرفة رطوبة مسخنة مسبقاً لمدة 30 دقيقة.

قم بإذابة مخزون تضخيم DUO link عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، وقم بالتحضير لخطوة التضخيم أثناء فترة الحضن عن طريق تخفيف مخزون تضخيم DUO Link في ماء عالي النقاء بنسبة 1x. حافظ على الكواشف بعيداً عن الضوء نظراً لحساسيتها له. عند اكتمال خطوة الربط، تخلص من المحلول واغسل الشرائح مرتين باستخدام Wash Buffer A لمدة دقيقتين في كل مرة في درجة حرارة الغرفة مع الرج في وعاء اقتران؛ وأثناء الغسلة الأخيرة، أضف duo link polymerase إلى محلول التضخيم ليصل التخفيف النهائي إلى 1:280 ثم استخدم جهاز دوامة (vortex). بعد التخلص من محلول الغسيل، أضف 40 µL من خليط التضخيم إلى كل بئر، واحضر الشرائح في غرفة رطوبة مسخنة مسبقاً ومظلمة لمدة 100 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

بمجرد اكتمال فترة تحضين التضخيم، قم بتفريغ محلول البوليميراز من الشرائح واغسلها في محلول الغسيل Wash buffer B مرتين لمدة 10 دقائق لكل غسلة مع الرج في وعاء اقتران، مع الحفاظ على الشرائح بعيداً عن الضوء خلال هذه الخطوة لأن الكواشف حساسة للضوء. اتبع الغسلتين بغمر الشرائح في محلول Wash buffer B بتركيز 0.1. الآن قم بإزالة السيليكون تماماً من شريحة الـ 16 بئراً، ثم أضف ما يقرب من 40 µL من الثنائي.

ضع وسط التثبيت باستخدام dappy على غطاء شريحة، ثم ضعه برفق فوق العينات مع الضغط قليلاً لضمان عدم وجود فقاعات هواء تحت غطاء الشريحة، ثم ثبت وأحكم إغلاق غطاء الشريحة على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر، مع الانتظار لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل التصوير. هذه صور مجهرية كونفوكالية لخلايا عولجت بـ 2 µM من dorsa morphine، وهو مثبط لمسار BMP، أو عولجت بـ 25 ng/mL من BMP 4 لمدة 60 دقيقة.

استُخدمت أجسام مضادة ضد Phospho Smad 1 58 وSmad four للكشف عن معقدات smad النشطة، وتظهر على شكل نقاط حمراء. كما تم صبغ نواة الخلية باللون الأزرق باستخدام dpi. حُسبت إشارات PLA باستخدام برنامج DUO link image tool، وموضح في الرسم البياني متوسط عدد النقاط في النواة لكل خلية.

لا يظهر أي تصبغ عند استخدام أي من الأجسام المضادة الأولية بمفردها، مما يشير إلى عدم وجود نتائج خلفية لمجسات PLA والربط اللاحق للأوليغونوكليوتيدات. وبالمثل، لم يتم اكتشاف أي بقع في ضابط سلبي آخر تم فيه حذف كلا الجسمين المضادين الأوليين. وفي خلايا neuro two A، يكشف تحليل SDS page immuno blotting عن وجود phospho related SMAD 1 5 8 في الخلايا غير المعالجة والخلايا المعالجة بـ BMP.

ومع ذلك، تنخفض مستويات phospho smad بشكل ملحوظ في الخلايا المعالجة بالمورفين الظهري. ويُستخدم الجسم المضاد لـ PCNA كعنصر تحكم في تحميل العينات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اتباع الخطوات والإعداد الذي نقترحه للحصول على النتائج في أقل من ست ساعات بعد تثبيت الخلايا.

باختصار، تشمل الخطوات عملية حجب حضانة الأجسام المضادة الأولية، وحضانة مجسات PLA، والتضخيم بالربط، والتثبيت والتصوير.