Name: جيل من النباتات في المركب Medicago truncatula تستخدم لفحوصات Nodulation (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: تعلم إنتاج نباتات مركبة ذات جذور شعرية في Medicago truncatula لدراسة التعايش الجذري والتعقد. توفر هذه التقنية طريقة سريعة للحصول على أنسجة معدلة وراثياً خلال أسابيع قليلة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور كريس تايلور (جامعة ولاية أوهايو) لإدخال التكنولوجيا شعر الجذر إلى مختبرنا والدكاترة. Senthil سوبرامانيان (جنوب داكوتا جامعة ولاية) ، وخوان تشانغ (Ludong جامعة شاندونغ الصين) لتحسين البروتوكول. كما نشكر الدكتور تشنغ هاو (الزراعة جامعة نانجينغ) ليساعد في صنع هذا الفيديو. ويدعم هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من وزارة الطاقة (DE - SC0001295) ، جبهة الخلاص الوطني (MCB - 0923779) وزارة الزراعة (2010-65116-20514) لOY

وقد استخدم البروتوكول التالي لإنشاء محطات الجذر شعر مركب في أنواع البقول طراز M. truncatula. وقد تم تكييف بروتوكولات مماثلة لأنواع النباتات لا يقل عن ثمانية 1-4. استخدمنا M. truncatula النباتات الجذرية شعر مركب لدراسة وظائف الجينات في جذر والتنمية العقيدات. تم فصل البروتوكول إلى أربعة أقسام : 1) إعداد المواد النباتية ؛ 2) محطات توليد جذر شعر مركب ، 3) التكافلية العدوى الوزن الرطب ؛ و 4) المعدلة وراثيا تحديد الجذر. استخدمنا ناقلات الثنائية التي تحتوي على بروتين الفلورية الخضراء (GFP) الجين كمراسلة لفحص جذور النباتات المعدلة وراثيا في مركب 3. مقارنة مع المضادات الحيوية القائمة على الاختيار ، القائم على الفحص GFP سريعة ، سهلة ، وغير مكلفة. في بناء لدينا ، هو الدافع وراء ER - التعبير الأمثل عن طريق الجينات GFP مروج للاليوبيكويتين السوبر ، الذي إشارات قوية في الجذور التأسيسية GFP المعدلة وراثيا ، مما يسمح للجذور التمييز بسهولة بين المعدلة وراثيا وغير المعدلة وراثيا. 1. إعداد مواد نباتية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم حصاد البذور M. truncautla من النباتات التي تزرع في الدفيئة (الرطوبة النسبية 50 ٪ ، 16 / 8 ح الضوء / الظلام ، 22/18 درجة مئوية اليوم / الليلة درجة الحرارة). ويمكن تخزين البذور الناضجة في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومشطوب البذور في حوالي 100 مل من حامض الكبريتيك 10 المركزة (95-98 ٪ ، سيغما الدريخ ، MO) لمدة 10 دقيقة مع اهتزاز الدورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم شطف البذور 5-7 مرات بالماء المعقم مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم نقع البذور في الماء في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعات والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية لمدة 36-48 ساعة لمزامنة الإنبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتنتشر حوالي 20-30 البذور على أوراق الترشيح رطبة توضع في طبق بتري. يتم الاحتفاظ بها عند 22 درجة مئوية ، مع 16 / 8 ح الضوء / الظلام دورة ، و 40 μmol.m -2. ق شدة الضوء -1 ، لمدة 5-6 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل الشتلات نبتت في التربة ، ووضعها في الاحتباس الحراري لمدة شهر. </li></ol> 2. محطات توليد جذر مركب مشعر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحولت يبني ثنائي تحمل جينات من الاهتمام إلى A. rhizogenes باستخدام البروتوكولات القياسية. وهندستها لدينا مجموعة من ناقلات ثنائية تحتوي على الجين GFP كعلامة التي تسهل فحص الأنسجة وراثيا. تحتوي هذه النواقل المختلفة والمروجين لها جميع مواقع الاستنساخ عبارة (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) للتعبير عن مدى أو إسكات الجينات المستهدفة 3،5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو مثقف rhizogenes ألف رطل في المتوسط ​​50ml مع اختيار المضادات الحيوية المناسبة عند 28 درجة مئوية لمدة 16-24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع البكتيريا وإعادة تعليق على التركيز النهائي للOD 600 = 0.3 في النيتروجين خالية من المغذيات النباتية حل (الجدول رقم 1 و 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شعر لدعم التجديد الجذري ، ومصفوفة دعم معقمة ("الصوف الصخري" ، Hummert الدولية ، والأرض ، مدينة MO) ويقتطع من المقابس من حوالي 3 سم 3. نضع 4 شمعات في طبق بتري واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وشوهدت حفرة على رأس كل المكونات باستخدام ماصة الحافة لتسهيل إدخال explants ألف. يضاف rhizogenes (5 مل) إلى كل المكونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستأصل قسم تبادل لاطلاق النار مع البراعم الإبطية 2-3 قبل قطع مائلة. ثم يتم إدراج يزدرع في المكونات ، ونمت عند 22 درجة مئوية لمدة نحو ثلاثة أسابيع. علينا أن نحافظ على explants Medicago دون سقي في الأيام ال 10 الأولى ، ثم ، والمياه لهم حل النيتروجين 5 مل خالية عند الضرورة. وجدنا ان ازالة النسيج الإنشائي القمي قد تقلل من تشكيل جذور العرضي. </li></ol> 3. التكافلية الوزن الرطب (Sinorhizobium Meliloti) العدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة أسابيع ، فإن بعض جذور عرضية تخرج من الصوف الصخري. يتم نقل النباتات الجذرية شعر مركب إلى الرمل أو الفيرميكوليت (معقمة) ، مع أو من دون الصوف الصخري. أنها نمت في الاحتباس الحراري الى 22 درجة مئوية ، 16 / 8 ح الضوء / الظلام دورة ، و 300 μmol.m -2. ق -1 شدة الضوء لمدة أكثر من أسبوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوزن الرطب قبل الإصابة ، S. هو مثقف meliloti 1201 في 50 - استخراج مانيتول الخميرة مل متوسطة لمدة 7 أيام عند 30 درجة مئوية (الجدول رقم 2 ، و6،7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخففة إعادة علقت خلايا الوزن الرطب إلى تركيز النهائي من OD 600 = 0.08 باستخدام النيتروجين حل التغذية الحرة. وتعليق 10 مل جديدة من S. تم تطبيق meliloti لكل مصنع المركبة للحث على تشكيل العقيدات. </li></ol> 4. تحديد الجذر المعدلة وراثيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اسبوعين من التلقيح الوزن الرطب ، والنباتات مركب تصل الجذور عن طريق الغسيل في الماء. يمكن فصلها بسهولة الجذور من رمال أو البيرلايت في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضع جذور شعر تحت المجهر الأشعة فوق البنفسجية (نيكون SMZ1500 ، الإثارة 460 500nm ، 505nm مزدوج اللون ، الحاجز أكثر من 510nm). جذور المعدلة وراثيا هي GFP إيجابية والجذور هي العارض GFP سلبية. ثم نجمعها accordin الجذورز إشارة GFP ، وتحصي أعداد العقيدات ، وقياس طول الجذر ، وحساب الجذر الوحشي الكثافة. وتستخدم جذور GFP السلبية السيطرة. </li></ol> 5. ممثل النتيجة في تجربتنا ، وإعادة إحياء جذور الشعر الجديد من explants في 2-3 أسابيع بعد A. rhizogenes innoculation. تحت المجهر الأشعة فوق البنفسجية ، والجذور وراثيا تحمل جينات GFP تظهر قوية مخضر (الشكل 1). وكان 25 ٪ من جذور أنتجت كمية من الجذور وإعادة إحياء جزء من جذور GFP إيجابية تعتمد على ظروف وبيئة explants نمو متوسط ​​plants.On المركب وجذور شعر المعدلة وراثيا 3 لزيادة كفاءة التحول ، 1) عذاب غطاء من البلاستيك ، كما هو موضح في شريط الفيديو ، ويكفي للحفاظ على الرطوبة في علبة النمو خلال الأيام القليلة الأولى ، والنباتات لا تتطلب سوى القليل من الماء في الأيام القليلة الأولى. الري المفرط يضر تشكيل جذور شعر ؛ 2) تركيز innoculant الأجرعية مهم للتحول. كمية زائدة من الخلايا ليست مفيدة لتشكيل جذور شعر أو تشكيل العقيدات. لتكوين العقيدات ، والحل يحتاج إلى سقي النيتروجين خالية ، وإلا فإن العقيدات القليلة النموذج. يمكن أن تتولد جذور النباتات شعر مركب باستخدام النبتات أو الشتلات entact كمادة انطلاق. تعديلات طفيفة على البروتوكول أعلاه هي ncessary لتوليد جذور شعر من الأنسجة الأخرى 8. الأهم من ذلك ، شعر كل جذر هو حدث التحول مستقلة. ولذلك ، فإن الظواهر التي لوحظت في مصنع واحد مركب من مجموع الأحداث transforamtion عديدة تحتاج إلى تأكيد من التكرار في محطات متعددة مركب <img src="/files/ftp_upload/2633/2633fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. يمكن فرز ألف جذور المعدلة وراثيا في الفترة من جذور شعر. وتم تشكيل العقيدات باء في جذور النباتات شعر مركب ، ونحن وضعت لمدة 4 أسابيع من العمر م. النباتات يمكن truncatula الجذر شعر تحت المجهر الأشعة فوق البنفسجية وجذور GFP إيجابية التعرف عليها بسهولة. (السهم الأحمر : GFP الجذرية ؛ السهم الأصفر : عدم GFP الجذر) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الأوراق المالية </td><td> g/200ml </td><td> الأسهم مل / لتر </td></tr><tr><td> MgSO 4 0.7 H 2 O </td><td> 12.3 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> CaCl 2 0.2 H 2 O </td><td> 14.7 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> K 2 4 هبو 0.3 H 2 O </td><td> 6.8 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> K 2 SO 4 </td><td> 11 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 3 الحديد الكلورين 0.6 H 2 O </td><td> 0.49 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> المغذيات الدقيقة </td><td> انظر أدناه </td><td> 1 </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المغذيات الدقيقة </td><td> ز للتر الواحد </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> 0،142 </td></tr><tr><td> MnSO 4. H 2 O </td><td> 0،077 </td></tr><tr><td> 4 ZnSO 0.7 H 2 O </td><td> 0.1725 </td></tr><tr><td> كبريتات النحاس 0.5 4 H 2 O </td><td> 0،037 </td></tr><tr><td> NaMoO 4. H 2 O </td><td> 0،024 </td></tr><tr><td> كوكلي 2. H 2 O </td><td> 0.0025 </td></tr><tr><td> NISO 4 </td><td> 0،001 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الحل التغذية Nitogen خالية <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> K 2 HPO4 </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 0.1g </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> 0.2g </td></tr><tr><td> مستخلصات الخميرة </td><td> 0.4g </td></tr><tr><td> مانيتول </td><td> 10G </td></tr><tr><td> الرقم الهيدروجيني = 6.8 </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 2. خلاصة الخميرة المتوسطة مانيتول (لتر)

<ol><li>Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).</li>
<li>Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vitro+composite+plants%3A+an+inexpensive%2C+rapid+method+for+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology.</a> Plant J. 43, 449-457 (2005).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavones+and+flavonols+play+distinct+critical+roles+during+nodulation+of+Medicago+truncatula+by+Sinorhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti.</a> Plant J. 57, 171-183 (2009).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-rhizogenes-transformed+roots+of+Medicago+truncatula+for+the+study+of+nitrogen-fixing+and+endomycorrhizal+symbiotic+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).</li>
<li>Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavone+synthases+from+Medicago+truncatula+are+flavanone-2-hydroxylases+and+are+important+for+nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation.</a> Plant Physiol. 144, 741-751 Forthcoming.</li>
<li>Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoters+of+two+isoflavone+synthase+genes+respond+differentially+to+nodulation+and+defense+signals+in+transgenic+soybean+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots.</a> Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).</li>
<li>Vincent, J. A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , Blackwell Science Ltd. Oxford. 1-13 (1970).</li>
<li>Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+of+Soybean+Isoflavone+Synthase+Genes+Leads+to+Silencing+in+Tissues+Distal+to+the+Transformation+Site+and+to+Enhanced+Susceptibility+to+Phytophthora+sojae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

محطة توليد شعر جذر مركب هو وسيلة سريعة وسهلة للحصول على كميات كبيرة من المواد المعدلة وراثيا عن الأنواع dicot كثيرة. على الرغم من أن هذه الطريقة لا يمكن ان تنتج البذور المعدلة وراثيا ، يمكن أن تنتج المواد المعدلة وراثيا في غضون بضعة أسابيع. الأسلوب هو مناسبة خاصة بالنسبة للنباتات التي تجد صعوبة إقامة مزارع الأنسجة أو توليد transformants مستقرة. على مر السنين ، وقد استخدمنا هذه التقنية لدراسة وظائف الجينات ووظائفها المروج ، microRNAs ، الجذر الوحشي والتنمية الجذرية ، والدفاع ، واستجابات التوتر اللاأحيائية ، nodulation والعمليات التكافلية الأخرى ، والاستجابات هرمون التنميط الأيضية ، والتنميط الجيني ، وتحليل البروتين ، و غيرها من العمليات البيولوجية. البروتوكول هو قوية وقابلة للتكرار.

جيل من النباتات في المركب medicago truncatula تستخدم لفحوصات nodulation

Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays

مشابهة لtumerfaciens الأجرعية ، يمكن rhizogenes الأجرعية نقل السلطات الوطنية المعينة الاجانب الى خلايا النبات على أساس الحكم الذاتي الذي يحفز الجذر (ري) البلازميد ألف. يمكن أن يسبب شعر rhizogenes تشكيل الجذر على الأنسجة النباتية والنباتات شكل مركب بعد التحول. مركب على هذه النباتات ، وبعض من الجذور وإعادة إحياء المعدلة وراثيا ، التي تحمل نوع T - DNA البرية وناقلات ثنائية هندسيا ، بينما يطلق النار لا تزال غير المعدلة وراثيا ، ويعملون على توفير الطاقة ودعم النمو. وهذه النباتات جذر شعر مركب لا تنتج البذور المعدلة وراثيا ، ولكن هناك عددا من الميزات الهامة التي تجعل من هذه النباتات المركبة مفيدة جدا في مجال البحوث النباتية. أولا ، مع طائفة واسعة المضيف ، A. ويمكن تحويل rhizogenes الأنواع النباتية كثيرة ، ولا سيما dicots ، مما يسمح للهندسة الوراثية في مجموعة متنوعة من الأنواع. الثانية ، A. rhizogenes يصيب الأنسجة وexplants مباشرة ، ولا الثقافات الأنسجة قبل التحول من الضروري الحصول على النباتات المركبة ، مما يجعلها مثالية لتحويل الأنواع النباتية المتمردة. وعلاوة على ذلك ، يمكن توليد أنسجة الجذر المعدلة وراثيا في غضون أسابيع. لtruncatula Medicago ، يمكننا الحصول على الجذور كما المعدلة وراثيا في فترة قصيرة تبلغ ثلاثة أسابيع ، وأسرع من الانخفاض الطبيعي التحول الأزهار Arabidopsis. عموما ، وشعر تكنولوجيا جذور النباتات المركب هو أداة مرنة ومفيدة لدراسة وظائف الجينات والجذر الظواهر ذات الصلة. هنا علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام جذور النباتات شعر مركب لدراسة النباتات الريزوبيم التفاعلات وnodulation في M. يصعب تحويل الأنواع truncatula.

نظهر كيف يمكن استخدام جذور النباتات شعر مركب لدراسة النباتات الريزوبيم التفاعلات وnodulation في الأنواع يصعب تحويل -<em&gt; Medicago truncatula</em&gt;.

جيل من النباتات في المركب Medicago truncatula تستخدم لفحوصات Nodulation

على غرار بكتيريا Agrobacterium tumefaciens، تستطيع بكتيريا Agrobacterium rhizogenes نقل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) الغريب إلى الخلايا النباتية بناءً على البلازميد المستقل المحفز للجذور (Ri)...

مرحباً، اسمي أوليفر يو من مركز دان لعلوم النبات. سنقوم اليوم بتوضيح كيفية إنتاج نباتات Ute Compote بواسطة Agrobacterium Ogn. وقد جلب الدكتور كريس تايلور، الذي يعمل حالياً في جامعة ولاية أوهايو، هذه التقنية إلى مركز دان.قام العديد من أعضاء مجموعتي السابقين بتحسين هذه التقنيات على مر السنين، واليوم قام عضوا مجموعتي الحاليان، الدكتور Stone وMao، بإعداد هذا الفيديو لتوضيح كيفية إنتاج خطط الجذور المركبة (Harry Root Composite Plans). وتتشابه بكتيريا Agrobacterium ZOS إلى حد كبير مع agrobacterium tumor fis في قدرتها على إدخال DNA غريب إلى النباتات، إلا أن ZOS يمكنها تحفيز تكوين جذور أعلى في الأنسجة من النوع البري (wild type)، مما يؤدي إلى تكوين نباتات مركبة مثل هذه. لذا، في هذه النباتات، تكون بعض الجذور معدلة وراثياً بينما تظل المجموعات الخضرية من النوع البري.وبناءً على ذلك، لن تنتج هذه التقنية بذوراً معدلة وراثياً. ومع ذلك، هناك ثلاث مزايا رئيسية للنباتات ذات التجدد الجذري العالي تجعل هذه التقنية مفيدة للغاية. أولاً، يمكن تحويل العديد من الأنواع النباتية، وخاصة الأنواع ثنائية الفلقة، بواسطة agro bacterial ous.ثانياً، لا نحتاج إلى إنشاء مزرعة أنسجة قبل عملية التحول؛ حيث يمكننا أخذ أجزاء متعددة من النباتات مثل الشتلات والنموات الخضرية والجذور لتوليد نباتات متحولة مباشرةً. وأخيراً، يمكننا الحصول على أنسجة جذرية معدلة وراثياً في غضون أسابيع قليلة.بالنسبة لتحويل فول الصويا والـ medic، يمكننا الحصول على جذور معدلة وراثياً في غضون ثلاثة أسابيع، وهو وقت أقصر من التحويل باستخدام OPIS. وبشكل عام، تعد تقنية زراعة الخلايا الجذرية أداة مفيدة جداً لدراسة وظائف الجينات والأنماط الظاهرية المرتبطة بالجذور. مرحباً، اسمي Ong.مرحباً، اسمي هو، وهذا المصور الخاص بي بيل. سنقوم اليوم بتقديم بروتوكول زراعة النباتات المركبة في هلام هاري (Harry root Composite Plant protocol). نعم، نحن نستخدم هذا البروتوكول في العديد من مشاريعنا.لقد بدأنا بالفعل. سنستخدم "meta cargo Tula" كمثال في عرضنا التوضيحي. هذه عبارة عن قرون "meta cargo" ناضجة.ضع القرون على صندوق طحن، ثم اطحن القرون بحركة طويلة وقوية. افصل البذور عن قرون البذور عن طريق الرج بلطف، وضع البذور في أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter. بعد ذلك، أضف 5 milliliters من حمض الكبريتيك المركز.يتم إجراء الندب بحذر شديد. تستغرق هذه العملية حوالي 10 دقائق. يتم عمل دوامة (Vortex) للأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات.خلال المعالجة بالحمض، سيتغير لون غلاف البذرة إلى اللون الأصفر. قم بإزالة حمض الكبريتيك من الأنبوب واغسل البذور بالماء المعقم خمس مرات على الأقل. انقع البذور في ماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة لمدة ست ساعات، ثم احفظها في درجة حرارة 4 °C لمدة يومين.لمزامنة عملية الإنبات، يتم توزيع 20 إلى 30 بذرة على ورق ترشيح رطب في طبق بتري. وبعد مرور خمسة إلى ستة أيام، تُنقل البادرات إلى التربة ثم تُزرع في الدفيئة الزراعية لمدة أربعة أسابيع.لتحويل النباتات المركبة، نستخدم عادةً سلالة agrobacterium Zony K 5 99. يمكن تحويل الناقل المكوكى أو الناقل الثنائي إلى K 5 99 باتباع بروتوكول تحويل agrobacterium tumor facit القياسي. يتم تلقيح agrobacterium، وتنميتها عند 30 °C لمدة تتراوح من 16 إلى 24 ساعة. بعد فترة النمو، يتم جمع الخلايا بوضع محلول المزرعة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 mL.قم بطرد العينة في جهاز الطرد المركزي عند 5,000 G لمدة 30 دقيقة. أعد تعليق الراسب باستخدام محلول مغذي خالٍ من النيتروجين. تأكد من تخفيف خلايا agrobacterium لتصل إلى 0.3 عند OD 600.يُعد هذا التركيز مهماً لتحقيق أقصى قدر من التحول. ونستخدم جدار الصخر كمصفوفة داعمة، حيث تكمن أهمية استخدام هذه المادة في تحقيق تردد تحول مرتفع.قم بقص الجدار الصخري إلى الحجم المناسب. سدادة. اصنع ثقباً في الأعلى بقطر يتراوح بين سنتيمتر ونصف إلى سنتيمترين. باستخدام رأس ماصة، أضف 5 mL من محلول Resuspended Agrobacterium Zony إلى كل سدادة.اختر مقطعاً من الساق يحتوي على برعمين إلى ثلاثة براعم إبطية وقم بإجراء قطع مائل. أدخل مقاطع النبات في الفتحة الموجودة في الجدار الصخري. ضع النباتات المقطوعة في غرفة نمو أو على طاولة مختبر لمدة ثلاثة أسابيع.أضف خمسة milliliters من المحلول المغذي إلى كل سدادة كل 10 أيام. وبعد ثلاثة أسابيع، تتجدد الجذور من الجانب المقطوع. انقع النبتة في الماء.قم بإزالة جدار الصخر الذي تم تليينه بعناية مع تجنب إتلاف الجذور. تأكد من إزالة جدار الصخر بالكامل. يمكنك نقل النباتات المركبة ذات الجذور الشعيرية إلى الرمل أو البيرلايت. بالنسبة لتجارب التكافل، قم بزراعة الريزوبيوم في وسط مانيتو بمستخلص الخميرة لمدة سبعة أيام عند 30 °C.اجمع خلايا zoia Resus. قم بتعليق الراسب باستخدام المحلول المغذي الخالي من النيتروجين. خفف المحلول ليصل إلى 0.08 عند OD 600.أضف 10 milliliters من محلول ZOA إلى كل مزرعة نباتية مركبة، واترك النبات لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع إضافية للسماح بتكون العقد الجزرية. قم بإزالة الرمل من النباتات المركبة عن طريق اقتلاعها وغسلها. استخدم تعبير البروتين الفلوري الأخضر لفحص الجذر المعدل وراثياً.ستستخدم مجهراً فلورياً للقيام بذلك. تحتوي جميع تركيبات الجذور الشعرية لدينا على كاسيت GFP تأسيسي لفحص السلالات المعدلة وراثياً. تُظهر هذه الصورة النباتات المركبة ذات الجذور الشعرية المعدلة وراثياً بـ GFP كما شوهدت تحت المجهر الفلوري.يسهل تمييز الجذور المعدلة وراثياً ذات الفلورة الخضراء الأكثر سطوعاً عن الجذور غير المعدلة وراثياً. تتكون العقد في الجذور الشعرية للنباتات المركبة. إليكم البروتوكول الكامل.مرة أخرى، يُعد توليد نباتات مركبة ذات جذور شعرية طريقة سريعة وسهلة للحصول على كميات كبيرة من الأنسجة المعدلة وراثياً، خاصة بالنسبة للأنواع ثنائية الموطن. ورغم أن هذه الطريقة لا تمكنك من الحصول على بذور معدلة وراثياً، إلا أنها يمكن أن تنتج مادة معدلة وراثياً في غضون أسابيع قليلة. وهي مناسبة بشكل خاص للنباتات التي تواجه صعوبة في إنشاء زراعة الأنسجة والتحول الوراثي.على مر السنين، استخدمنا هذه التقنية لدراسة وظائف الجينات، ووظائف المحفزات، والجزيئات microRNAs، وتطورات الجذور والجذور الجانبية، والاستجابة للإجهاد الدفاعي والمضادات الحيوية، والتنود والعمليات التكافلية الأخرى. كما درسنا الاستجابة الهرمونية، والتوصيف الأيضي، والتوصيف الجيني، والتحليل البروتومي باستخدام النباتات المركبة ذات الجذور العلوية. ونأمل أن يساعدكم هذا الفيديو في تطويع هذا النظام لاستخدامه مع أنواعكم النباتية المفضلة.نرحب بتواصلكم معنا لأي استفسارات تتعلق بهذه التقنية، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق.

generation-composite-plants-medicago-truncatula-used-for-nodulation

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ووصف موت الخلايا المستندة للمقايسة الوكالة في محطات benthamiana نيكوتيانا.

مقايسة لمسببات الأمراض ، المرتبطين نمط الجزيئية (PAMP) - الحفز الحصانة (كونا) في النباتات

وصفت طريقتين متميزة للنباتات شاشة مع الجذر عقدة الديدان الخيطية. النهج صفها تشمل عالية الإنتاجية شاشات مع الديدان الخيطية بطريقة غير تدميري وتسهيل استخدام هذه النباتات في برامج التربية.

شاشات الإنتاجية العالية والمنخفضة مع الجذر عقدة نيماتودا Meloidogyne النيابة.</em

نمو النباتات truncatula Medicago في التعايش مع البكتيريا المثبتة للنيتروجين meliloti Sinorhizobium في الفردية، عوالم مصغرة معقمة مصنوعة من لوحات المختبر القياسية يسمح الفحص المتكرر للأنظمة الجذر والعقيدات دون المساس العقم. يمكن الحفاظ على النباتات في هذه الغرف النمو لمدة تصل إلى 9 أسابيع.

واحد النبات، عوالم مصغرة العقيمة لNodulation ونمو النبات البقول<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; مع بالريزوبيا المتكافل<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

الهدف هو توضيح أن نموذج البقوليات Medicago truncatula يمكن استخدامه بسهولة للتحقيق في تنظيم التطور الجنيني المبكر للنبات لاستكمال نموذج نبات الأرابيدوبسيس غير البقولي. يرتبط مورفولوجيا القرون بمراحل التطور الجنيني الزيجوت ويتم أيضا توفير بروتوكول لجمع الأجنة باستخدام زراعة الأنسجة.

بروتوكولات الحصول اقحي والجسدية الأجنة لدراسة تنظيم تطور الجنين في وقت مبكر من البقول نموذج<em&gt; Medicago truncatula</em

مروج تعبير تحاليل ضرورية لتحسين فهم تنظيم الجينات والتعبير الزمانية المكانية للجينات المستهدفة. وهنا نقدم بروتوكول لتحديد وعزل واستنساخ مروج نبات. علاوة على ذلك، يصف لنا وصف المروج العقيدات على حدة في جذور شعر الحبة المشتركة.

نبات مروج التحليل: تحديد وتوصيف للعقيدات الجذرية المروج محددة في الفول المشتركة

يوفر هذا البروتوكول خطوات تجريبية ومعلومات حول الكواشف ومعدات وأدوات التحليل للباحثين الذين يرغبون في القيام بتحليل الجينوم كله التهجين الجينومي المقارن القائم على صفيف (CGH) لنسخ عدد الاختلافات في النباتات.

المستندة إلى صفيف "مقارنة الجينوم التهجين منصة" "الكشف عن كفاءة من نسخ عدد الاختلافات" في طفرات "سريعة النيوترون" المستحثة فصة برميلية

يمكن تحويل تعبير مغايرة عابر للإنزيمات السكروز في أوراق بينثاميانا نيكوتيانا الإمدادات المحلية من 2، 3-أوكسيدوسكواليني نحو إنتاج منتجات عالية القيمة ترتيربين جديدة. وهنا يتم وصف بروتوكول مفصلة لإنتاج إعداد مقياس السريع (5 أيام) triterpenes والنظير استخدام هذه المنصة القوية المستندة إلى النباتات.

تعبير عابر في نيكوتيانا بينثاميانا يترك لإنتاج ترتيربين في نطاق التحضير

تصف هذه الورقة طريقتين لتحديد الاستجابات الدفاعية في أرابيدوبسي ثاليانا بعد التعرض للمناضد المناعية: انفجار الأكسدة العابرة، وتثبيط نمو الشتلات.

نمط الزناد الاندفاع التأكسدي والشتلات تسرب النمو تثبيط الاختبارات في تاليانا العربيدوبسي

Parasponia andersonii هي شجرة استوائية سريعة النمو تنتمي إلى عائلة القنب (Cannabaceae) ويمكن أن تشكل العقيدات الجذرية المثبتة للنيتروجين بالاشتراك مع الريزوبيوم. هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل للتحليلات الوراثية العكسية في P. أندرسوني على أساس Agrobacterium tumefaciens- بوساطة التحول مستقرة وتحرير الجينوم القائم على كريسبر / Cas9.

تحويل، تحرير الجينوم والفينولات في نتروجين تحديد شجرة كاناباسيا الاستوائية Parasponia أندرسوني

هنا ، نقدم البروتوكول التفصيلي لطريقة تحويل من خطوة واحدة بوساطة Agrobacterium tumefaciens لإنتاج نباتات مركبة.

طريقة فعالة وقابلة للتكرار لإنتاج النباتات المركبة عن طريق تحويل جذور الشعر القائمة على جذور البكتيريا الزراعية

تعلم إنتاج نباتات مركبة ذات جذور شعرية في Medicago truncatula لدراسة التعايش الجذري والتعقد. توفر هذه التقنية طريقة سريعة للحصول على أنسجة معدلة وراثياً خلال أسابيع قليلة.

جيل من النباتات في المركب Medicago truncatula تستخدم لفحوصات Nodulation

استكشف المزيد من الفيديوهات