جيل من النباتات في المركب Medicago truncatula تستخدم لفحوصات Nodulation

مرحباً، اسمي أوليفر يو من مركز دان لعلوم النبات. سنقوم اليوم بتوضيح كيفية إنتاج نباتات Ute Compote بواسطة Agrobacterium Ogn. وقد جلب الدكتور كريس تايلور، الذي يعمل حالياً في جامعة ولاية أوهايو، هذه التقنية إلى مركز دان.

قام العديد من أعضاء مجموعتي السابقين بتحسين هذه التقنيات على مر السنين، واليوم قام عضوا مجموعتي الحاليان، الدكتور Stone وMao، بإعداد هذا الفيديو لتوضيح كيفية إنتاج خطط الجذور المركبة (Harry Root Composite Plans). وتتشابه بكتيريا Agrobacterium ZOS إلى حد كبير مع agrobacterium tumor fis في قدرتها على إدخال DNA غريب إلى النباتات، إلا أن ZOS يمكنها تحفيز تكوين جذور أعلى في الأنسجة من النوع البري (wild type)، مما يؤدي إلى تكوين نباتات مركبة مثل هذه. لذا، في هذه النباتات، تكون بعض الجذور معدلة وراثياً بينما تظل المجموعات الخضرية من النوع البري.

وبناءً على ذلك، لن تنتج هذه التقنية بذوراً معدلة وراثياً. ومع ذلك، هناك ثلاث مزايا رئيسية للنباتات ذات التجدد الجذري العالي تجعل هذه التقنية مفيدة للغاية. أولاً، يمكن تحويل العديد من الأنواع النباتية، وخاصة الأنواع ثنائية الفلقة، بواسطة agro bacterial ous.

ثانياً، لا نحتاج إلى إنشاء مزرعة أنسجة قبل عملية التحول؛ حيث يمكننا أخذ أجزاء متعددة من النباتات مثل الشتلات والنموات الخضرية والجذور لتوليد نباتات متحولة مباشرةً. وأخيراً، يمكننا الحصول على أنسجة جذرية معدلة وراثياً في غضون أسابيع قليلة.

بالنسبة لتحويل فول الصويا والـ medic، يمكننا الحصول على جذور معدلة وراثياً في غضون ثلاثة أسابيع، وهو وقت أقصر من التحويل باستخدام OPIS. وبشكل عام، تعد تقنية زراعة الخلايا الجذرية أداة مفيدة جداً لدراسة وظائف الجينات والأنماط الظاهرية المرتبطة بالجذور. مرحباً، اسمي Ong.

مرحباً، اسمي هو، وهذا المصور الخاص بي بيل. سنقوم اليوم بتقديم بروتوكول زراعة النباتات المركبة في هلام هاري (Harry root Composite Plant protocol). نعم، نحن نستخدم هذا البروتوكول في العديد من مشاريعنا.

لقد بدأنا بالفعل. سنستخدم "meta cargo Tula" كمثال في عرضنا التوضيحي. هذه عبارة عن قرون "meta cargo" ناضجة.

ضع القرون على صندوق طحن، ثم اطحن القرون بحركة طويلة وقوية. افصل البذور عن قرون البذور عن طريق الرج بلطف، وضع البذور في أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter. بعد ذلك، أضف 5 milliliters من حمض الكبريتيك المركز.

يتم إجراء الندب بحذر شديد. تستغرق هذه العملية حوالي 10 دقائق. يتم عمل دوامة (Vortex) للأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات.

خلال المعالجة بالحمض، سيتغير لون غلاف البذرة إلى اللون الأصفر. قم بإزالة حمض الكبريتيك من الأنبوب واغسل البذور بالماء المعقم خمس مرات على الأقل. انقع البذور في ماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة لمدة ست ساعات، ثم احفظها في درجة حرارة 4 °C لمدة يومين.

لمزامنة عملية الإنبات، يتم توزيع 20 إلى 30 بذرة على ورق ترشيح رطب في طبق بتري. وبعد مرور خمسة إلى ستة أيام، تُنقل البادرات إلى التربة ثم تُزرع في الدفيئة الزراعية لمدة أربعة أسابيع.

لتحويل النباتات المركبة، نستخدم عادةً سلالة agrobacterium Zony K 5 99. يمكن تحويل الناقل المكوكى أو الناقل الثنائي إلى K 5 99 باتباع بروتوكول تحويل agrobacterium tumor facit القياسي. يتم تلقيح agrobacterium، وتنميتها عند 30 °C لمدة تتراوح من 16 إلى 24 ساعة. بعد فترة النمو، يتم جمع الخلايا بوضع محلول المزرعة في أنبوب طرد مركزي سعة 50 mL.

قم بطرد العينة في جهاز الطرد المركزي عند 5,000 G لمدة 30 دقيقة. أعد تعليق الراسب باستخدام محلول مغذي خالٍ من النيتروجين. تأكد من تخفيف خلايا agrobacterium لتصل إلى 0.3 عند OD 600.

يُعد هذا التركيز مهماً لتحقيق أقصى قدر من التحول. ونستخدم جدار الصخر كمصفوفة داعمة، حيث تكمن أهمية استخدام هذه المادة في تحقيق تردد تحول مرتفع.

قم بقص الجدار الصخري إلى الحجم المناسب. سدادة. اصنع ثقباً في الأعلى بقطر يتراوح بين سنتيمتر ونصف إلى سنتيمترين. باستخدام رأس ماصة، أضف 5 mL من محلول Resuspended Agrobacterium Zony إلى كل سدادة.

اختر مقطعاً من الساق يحتوي على برعمين إلى ثلاثة براعم إبطية وقم بإجراء قطع مائل. أدخل مقاطع النبات في الفتحة الموجودة في الجدار الصخري. ضع النباتات المقطوعة في غرفة نمو أو على طاولة مختبر لمدة ثلاثة أسابيع.

أضف خمسة milliliters من المحلول المغذي إلى كل سدادة كل 10 أيام. وبعد ثلاثة أسابيع، تتجدد الجذور من الجانب المقطوع. انقع النبتة في الماء.

قم بإزالة جدار الصخر الذي تم تليينه بعناية مع تجنب إتلاف الجذور. تأكد من إزالة جدار الصخر بالكامل. يمكنك نقل النباتات المركبة ذات الجذور الشعيرية إلى الرمل أو البيرلايت. بالنسبة لتجارب التكافل، قم بزراعة الريزوبيوم في وسط مانيتو بمستخلص الخميرة لمدة سبعة أيام عند 30 °C.

اجمع خلايا zoia Resus. قم بتعليق الراسب باستخدام المحلول المغذي الخالي من النيتروجين. خفف المحلول ليصل إلى 0.08 عند OD 600.

أضف 10 milliliters من محلول ZOA إلى كل مزرعة نباتية مركبة، واترك النبات لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع إضافية للسماح بتكون العقد الجزرية. قم بإزالة الرمل من النباتات المركبة عن طريق اقتلاعها وغسلها. استخدم تعبير البروتين الفلوري الأخضر لفحص الجذر المعدل وراثياً.

ستستخدم مجهراً فلورياً للقيام بذلك. تحتوي جميع تركيبات الجذور الشعرية لدينا على كاسيت GFP تأسيسي لفحص السلالات المعدلة وراثياً. تُظهر هذه الصورة النباتات المركبة ذات الجذور الشعرية المعدلة وراثياً بـ GFP كما شوهدت تحت المجهر الفلوري.

يسهل تمييز الجذور المعدلة وراثياً ذات الفلورة الخضراء الأكثر سطوعاً عن الجذور غير المعدلة وراثياً. تتكون العقد في الجذور الشعرية للنباتات المركبة. إليكم البروتوكول الكامل.

مرة أخرى، يُعد توليد نباتات مركبة ذات جذور شعرية طريقة سريعة وسهلة للحصول على كميات كبيرة من الأنسجة المعدلة وراثياً، خاصة بالنسبة للأنواع ثنائية الموطن. ورغم أن هذه الطريقة لا تمكنك من الحصول على بذور معدلة وراثياً، إلا أنها يمكن أن تنتج مادة معدلة وراثياً في غضون أسابيع قليلة. وهي مناسبة بشكل خاص للنباتات التي تواجه صعوبة في إنشاء زراعة الأنسجة والتحول الوراثي.

على مر السنين، استخدمنا هذه التقنية لدراسة وظائف الجينات، ووظائف المحفزات، والجزيئات microRNAs، وتطورات الجذور والجذور الجانبية، والاستجابة للإجهاد الدفاعي والمضادات الحيوية، والتنود والعمليات التكافلية الأخرى. كما درسنا الاستجابة الهرمونية، والتوصيف الأيضي، والتوصيف الجيني، والتحليل البروتومي باستخدام النباتات المركبة ذات الجذور العلوية. ونأمل أن يساعدكم هذا الفيديو في تطويع هذا النظام لاستخدامه مع أنواعكم النباتية المفضلة.

نرحب بتواصلكم معنا لأي استفسارات تتعلق بهذه التقنية، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق.