Transcriptome تحليل خلايا مفردة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير عينات من خلايا مفردة لتحليل النسخ المتماثل (transcriptome). ويتم تحقيق ذلك من خلال العثور أولاً على خلية مناسبة للعزل، ثم توضع الماصة الدقيقة بجانب الخلية المراد عزلها.

بعد ذلك، يتم تطبيق الشفط على المحقنة حتى يتم سحب الخلية إلى طرف الماصة الدقيقة. وتتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في كسر طرف الماصة الدقيقة داخل أنبوب التجميع وتفريغ المحتويات المتبقية من الماصة الدقيقة في الأنبوب. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر الاختلافات في مجموعات mRNA بين الخلايا من خلال تحليل المصفوفات الدقيقة للمواد التي تم تضخيمها باستخدام طريقة تضخيم arna، الموصوفة أيضاً في البروتوكول، أو لتطبيقات أخرى مثل PCR أو تسلسل الجيل التالي.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن تقدم رؤى حول الاختلافات بين الخلايا المفردة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على المقصورات تحت الخلوية مثل التغصنات أو فئات التغصنات، وتوفير معلومات هامة حول وظيفة التغصنات. ستقوم جينيفر سينغ، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبري، باستعراض هذا الإجراء. قبل البدء في هذا البروتوكول، تم زرع عصبونات أولية من حصن الجرذان في اليوم الجنيني 18 على شرائح غطاء مقاس 12 مليمتر في طبق مقاس 35 مليمتر، وتم الحفاظ عليها كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ولتحضير الماصات اللازمة للحصاد، استخدم جهاز سحب الماصات الدقيقة لسحب الماصات الزجاجية المعقمة بالأتوكلاف إلى قطر مناسب لفيزيولوجيا الكهرباء.

باستخدام البرنامج المسبق الضبط من الشركة المصنعة، لا يعد حجم الفوهة أمراً حاسماً حيث سيتم كسر الطرف قبل جمع الخلايا. احفظ الماصات بعناية في بيئة خالية من الغبار، مثل وعاء تخزين الماصات الدقيقة، لضمان بقاء الأطراف سليمة عند الاستعداد لحصاد الخلايا. جهز العدد المطلوب من أنابيب einor سعة 1.7 milliliter عن طريق إضافة 2 µL من PBS لتخزين المواد التي تم حصادها.

أخرج طبقاً بقطر 35 مليمتر يحتوي على شرائح غطاء من الحاضنة داخل غطاء استنبات الأنسجة. انقل بسرعة شريحة غطاء واحدة من هذا الطبق إلى غطاء طبق جديد بقطر 35 مليمتر يحتوي على HBSS. من الضروري إعادة شرائح الغطاء التي لا يتم التعامل معها إلى الحاضنة لأن الخلايا قد تتدهور حالتها الصحية.

في حال تركها لفترات زمنية طويلة. يلزم استخدام مجهر ضوئي مقلوب مزود بعدسة شيئية 40x ومجهزة بمتحكم دقيق (micro manipulator) لجمع الخلايا. استخدم حامل ماصة مزوداً بأنبوب مرن يمتد بعيداً عن الحامل، وقم بتثبيت الأنبوب على سطح مستقر لمنع الحركة غير المرغوب فيها للماصة أثناء عملية الجمع.

عند نهاية الأنبوب، أدخل إبرة بحيث يمكن توصيل وتغيير سرنجة سعة 1 milliliter ذات وصلة قفل لور (lure lock) بين المستخدمين. قم بتجهيز الماصة الدقيقة (micro pipette) عن طريق كسر الطرف بطريقة محكومة، وذلك من خلال شد منديل Kim wipe بين أصابع إحدى اليدين وتمرير طرف الماصة بلطف شديد عبر الورقة مرة أو مرتين. يجب أن تكون الفتحة حوالي 75 إلى 100% من حجم الخلية المستهدفة.

ثبّت الماصة الدقيقة في حامل الماصة الدقيقة، ثم قم بتثبيت حامل الماصة الدقيقة في القطعة الملحقة بالمناورات الدقيقة. وأخيرًا، اضبط العدسة الشيئية بقوة تكبير 40x. ضع الطبق على منصة المجهر وحدد منطقة من الخلايا مناسبة للجمع.

في حالة المزارع العصبونية الأولية، يجب أن تكون الخلية معزولة نسبياً عن الخلايا المجاورة لها. ولمنع جمع الخلايا المحيطة و/أو استطالاتها، ضع الخلية المراد جمعها في مركز مجال الرؤية. استخدم الميكرو-مانيبوليتور (المتحكم الدقيق) لتحريك الميكرو-ببييت (الماصة الدقيقة) نحو المحلول الموجود في الطبق وصولاً إلى مسار الضوء.

اخفض طرف الماصة داخل المحلول. عند النظر عبر العدسة العينية، يجب أن تظهر الماصة كظل في مجال الرؤية. قم بتطبيق ضغط إيجابي بدءاً من هذه النقطة عن طريق النفخ بخفة عبر المحقنة فوق مستوى الخلايا بكثير.

اضبط موضع طرف الماصة حتى يصبح ضمن مجال الرؤية، ثم قم بضبط التركيز على طرف الماصة باستخدام مقابض التركيز الخشن. وفي هذه المرحلة، تحقق مما إذا كان قطر تجويف الماصة كبيراً جداً أو صغيراً جداً. إذا كان قطر التجويف غير مناسب، استبدلها بماصة دقيقة أخرى حتى يتم العثور على القطر الصحيح، وذلك لمنع كسر الماصة في منطقة التجميع.

استخدم مقبض الضبط الخشن لتقديم المستوى البؤري قبل تقديم طرف الماصة نحو الخلايا باستخدام أدوات التحكم الدقيقة. ومع اقتراب الخلايا، استخدم الضبط الدقيق حتى تصبح كل من الخلايا وطرف الماصة في بؤرة التركيز. توقف عن تطبيق الضغط الإيجابي قبل الوصول إلى الخلايا المستهدفة لتجنب دفعها بعيداً عن غطاء الشريحة.

قم بوضع طرف الماصة باستخدام أدوات التحكم الدقيقة بحيث يلامس جسم الخلية المراد جمعها. وباستخدام السرنجة، قم بتطبيق شفط خفيف عن طريق الفم حتى تدخل الخلية في طرف الماصة. إذا لم تدخل الخلية في الماصة، حرك الطرف بلطف ليكون أقرب إلى الخلية وإلى الأسفل حتى ترتفع عن شريحة التغطية.

استخدم جهاز التحكم الدقيق (micro manipulator) لتحريك الماصة فوراً للأعلى وإخراجها من المحلول. أخرج الماصة من الحامل. أمسك أنبوب إبندورف (eppendorf tube) سعة 1.7 milliliter المُجهز في يد واحدة، واكسر طرف الماصة برفق على جانب الأنبوب باتجاه القاع.

مع توجيه الطرف المكسور ليكون في مركز الأنبوب ومستهدفاً علامة 0.1 milliliter، أدخل إبرة متصلة بمحقنة سعة one milliliter في الفتحة العلوية للماصة. اضغط بسرعة على المكبس، مما يؤدي إلى دفع المحلول الموجود في الماصة ليرش داخل الأنبوب. احرص على عدم ملامسة الطرف لأي سائل على جدران الأنبوب.

بما أن الخاصية الشعرية ستعيد السائل إلى الماصة، فإن الخلية يجب أن تظل في طرف الماصة تماماً، ويكون ذلك كافياً لطرد الخلية بشكل صحيح. قم بتدوير محتويات الأنبوب بسرعة باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق مكتبي، ثم قم بتجميدها على الجليد الجاف أو وضعها على الثلج لمزيد من المعالجة أو لتطبيقات أخرى مثل PCR أو تسلسل الجيل التالي. يظهر هنا مثال على عملية حصاد ناجحة لعصبون معزول.

للبدء، تم اختيار منطقة ذات كثافة خلوية منخفضة نسبيًا. ثم تم تحريك طرف الماصة نحو الخلية المطلوبة. يظهر هنا مجال الرؤية بعد حصاد الخلية.

لاحظ أن العمليات المحيطة تظل على غطاء الشريحة. وبالعكس، يوضح هذا الشكل صورتين لرؤوس ماصات ذات حجم غير مناسب لعملية الحصاد الفعالة. سيؤدي هذا الرأس إلى حصاد غير مكتمل، بينما سيؤدي الرأس الموضح هنا إلى حصاد الوسط المحيط.

بعد عملية الحصاد، يُوصى بإجراء تحليل تضخيم الـ RNA باستخدام جهاز bioanalyzer لفحص توزيع وكمية الـ RNA المضخم. سينتج عن التضخيم الناجح من مادة خلية واحدة كميات إجمالية في حدود ميكروغرامات منخفضة، وسيكون لها توزيع سلس وعريض. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون دقائق إذا نُفذت بشكل صحيح، ومن المهم استخدام تقنية خالية من الـ RNA أثناء تنفيذ هذا الإجراء.