Name: Transcriptome تحليل خلايا مفردة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: تعلم عزل خلايا عصبية مفردة من ثقافات فئران أولية لتحليل النسخة الجينية باستخدام تقنية تضخيم aRNA. تُتيح هذه الطريقة دراسة التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

أشكر لك Miyashiro كيفن لطلاء والحفاظ على الثقافات الخلية ، للدكتور تيري Schochet لتوفير الثقافات خلية للصور المدرجة في هذه الوثيقة. بالإضافة إلى ذلك ، أشكر لك Miyashiro كيفن ، والدكتور بيتر باكلي ، وPertiz تينا للحصول على مدخلات بشأن الإجراء آرنا. تم تمويل هذا العمل من المعهد الوطني للشيخوخة ، والمعهد الوطني للصحة النفسية والباحث عن الحقيقة الأموال الموارد البشرية من رابطة ولاية بنسلفانيا.

<ol><li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li>
<li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li>
<li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1%3A+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li>
<li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li>
<li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+gene+expression+analysis%3A+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neeurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li>
<li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+DNA+synthesis+in+situ%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enxymol%22%5BJournal%5D)">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li>
<li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li>
<li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Aging+Knowledge+Eviron%22%5BJournal%5D)">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22P-1000+%26+P-97+Pipette+Cookbook%22">P-1000 & P-97 Pipette Cookbook</a>. , rev. F, Sutter Instrument. (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MinElute+Handbook+For+MinElute+Reaction+Cleanup+Kit%22">MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit</a>. , Qiagen. 28-29 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Megascript+kit%22">Megascript kit</a>. , Ambion. 7-8 Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MEGAclear+kit%22">MEGAclear kit</a>. , Applied Biosystems. 4-5 Forthcoming.</li>
<li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li>
<li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis%3A+Implications+for+neuronal+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li>
<li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li>
<li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis%3A+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+%28PREXCEL-Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li>
<li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+forensic+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li>
<li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li>
</ol>

الدكتور Eberwine هو المخترع على براءة اختراع آرنا التي قد تم الترخيص لتكنولوجيات LBS التي الدكتور Eberwine هو صاحب حصة.

ملاحظات وأخطاء <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد ترغب في اتخاذها قبل وبعد عرض الصور التي تم عزل الخلايا المستهدفة والتي تم يمسها في غبش المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان حل الكثير من يدخل ماصة كما كنت الحصاد ، يمكنك استخدام طريقة 3 Luer لوك التجهيزات والمكبس للحقنة لاجراء الضغط الايجابي في الأنابيب. فإن حجم المطلوب تختلف مع نوع من المعالجة ولكن ما يصل إلى 5 ميكرولتر ينبغي أن يكون على ما يرام بالنسبة لمعظم التطبيقات. </li></ul> نصائح عامة حول التقنيات البيولوجية الجزيئية <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة جميع أنابيب الأسهم وتدور عليهم قبل إضافة إلى رد الفعل. NEVER الانزيمات الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ردود الفعل مزيج دقيق قبل إضافة انزيم لضمان أن المخزن هو في التركيز السليم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانزيم في الحفاظ على مخزون -20 درجة مئوية إذا كان ذلك ممكنا باستخدام stratacooler. خلاف ذلك ، وإزالة الحق قبل الاستخدام ، والحفاظ على الجليد ، والعودة فورا إلى -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمزج دائما الرئيسي عند إعداد أكثر من رد فعل للحد من الأخطاء pipetting. حساب حجم المطلوبة استنادا إلى عدد من العينات وتضيف 10-20 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية إلى تأخير التدهور. الحمض النووي الريبي هو الأكثر استقرارا المخزنة في المخزن المؤقت لapurination تؤخر من الحمض النووي الريبي الذي يحدث في الظروف الحمضية. </li></ul> عام الخطوط العريضة للإجراءات آرنا ويوضح الشكل 4A الجولة الأولى من الإجراء آرنا. في رد فعل حبلا الأول ، الجزء بولي - T من التمهيدي (DT) T7 - ​​بنسبة ضئيلة لتحديد الأنواع مرنا (مستطيل أبيض طويل) ملزمة لذيول polyA. ومذيل بعديد الأدينيلات أيضا بعض microRNAs وسوف يتم القبض على هذا الإجراء. الأهم من ذلك ، ومع ذلك ، فإن الرناوات الأكثر وفرة في الخلية ، الرنا الريباسي ، لا. هذه جزئية بمثابة التمهيدي للالناسخ العكسي لتجميع حبلا التكميلية لل[كدنا] (الطويل المستطيل الرمادي) باستخدام مرنا كقالب. الجزء التمهيدي من T7 (DT) T7 - ​​جزئية تتضمن بوليميريز RNA T7 المروج في الإطار مع العقاقير تسلسل مرنا للانطلاق. ويستخدم هذا لاحقا في رد فعل في المختبر النسخ. المقبل ، ومرنا في مرنا الهجين / الحمض النووي التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة محملئا جزئيا H ريبونوكلياز خلق الحمض النووي الريبي &quot;الاشعال&quot; (مستطيلات صغيرة بيضاء) مشابهة إلى شظايا أوكازاكي إنشاؤها في متخلفة حبلا توليف الحمض النووي. البلمرة DNA الأول يستخدم لتجميع شظايا الحمض النووي الريبي DNA الوزراء باستخدام الحمض النووي مكملة لمرنا كقالب. عندما تصل إلى تفتيت الحمض النووي الريبي المقبل ، في 5 &#39;إلى 3&#39; nuclease النشاط يزيل ribonucleotides واستبدالها deoxyribonucleotides. يضاف إلى الحمض النووي يغاز ligate أي فروع فيها استبدال حبلا الرائدة ليست كاملة. يضاف T4 البلمرة DNA لملء في المناطق التي كانت بمثابة شظايا الحمض النووي الريبي الاشعال الأولية لالبلمرة DNA أنا خلق كليلة العضوية المزدوجة [كدنا] الذين تقطعت بهم السبل التي تتم تنقيته ثم قبل تنفيذ رد فعل IVT. في رد فعل IVT ، T7 بوليميريز RNA بربط المروج T7 دمجها المزدوج تقطعت بهم السبل [كدنا] ويجمع جزيئات الحمض النووي الريبي العقاقير (مستطيلات سوداء طويلة) باستخدام حبلا الشعور كقالب. هذا بمثابة خطوة التضخيم التي تنتج الآلاف من جزيئات الحمض النووي الريبي العقاقير من كل جزيء الذين تقطعت بهم السبل المزدوج [كدنا] (الشكل 4A). الجولة الثانية ، كما هو مبين في الشكل 4B ، ويبدأ مع رد فعل عكس النسخ التي تختلف قليلا عن تلك الجولة الاولى منذ البداية هي العقاقير RNA (مستطيل أسود خالص) ، ويفتقر إلى ذيل مذيل بعديد الأدينيلات أنه كان مستهدفا من قبل T7 - ​​بنسبة ضئيلة (DT) التمهيدي في الجولة الاولى. لذلك ، وتستعد هذا التفاعل مع الاشعال العشوائي (مستطيلات صغيرة رمادية) والحمض النووي الريبي التشويه والتحريف لاحقا. وتستعد ثم رد فعل من جانب الشق الثاني التمهيدي (DT) T7 - ​​بنسبة ضئيلة ، والذي يربط تسلسل بولي في نهاية A - 3 &#39;من الحمض النووي الريبي الشعور إنشاؤها في رد فعل عكس النسخ السابقة. يتم تنفيذ رد فعل آخر IVT بنفس الطريقة كما في الجولة الاولى. وعادة ما يتم تكرار هذه الجولة الثانية على الأقل مرة واحدة لتحقيق ثلاثة جولات من التضخيم من خلية واحدة. تطبيقات يمكن ترجمتها التقنيات التي قدمناها في هذه المقالة إلى عدد كبير من التطبيقات. يمكن تعديل بروتوكول العزلة خلية واحدة لاستخدامها في شرائح حادة. 14 على الرغم من أن أكثر تحديا من الناحية التقنية ، وتطبق المبادئ نفسها في إعداد هذا البديل. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم تعديلها بشكل طفيف في حجم ماصة ، يمكن إجراء تسجيلات لعلم وظائف الأعضاء من الخلايا قبل الحصاد السماح بإجراء تحقيق جيدا للسيطرة الآليات الجزيئية وراء مخرجات الفسيولوجية. آخر تعديل طفيف هو عزل العمليات سوما من الخلية. 15 لهذا التطبيق ، وجمع الهيئات خلية واحدة ماصة ثم نعود مع ماصة الطازجة وجمع 100-300 dendrit المحددةوفاق أو المحاور في أنبوب جمع (16). بمجرد أن يتم حصاد الخلايا ، ويمكن إجراء مقارنات بين تركيزات مرنا وبين مختلف مكونات وحتى داخل نفس الخلية السكان. دمج biotinylated - UTP آرنا في الجولة الثالثة يسمح للتحليل [ميكروأري لتحديد هذه الكميات المتوفرة مرنا نسبيا. يمكن أيضا أن التركيبة السكانية الأصلية مرنا يتحدد بعد العملية آرنا باستخدام التسلسل التالي جيل. يمكن أيضا أن تستخدم آرنا تضخيم لتأكيد دراسات الخلايا تحويل النمط الظاهري الذي يتم transfected مجموعة كاملة من mRNAs من نوع خلية واحدة إلى نوع من الخلايا المختلفة من أجل إحداث الانتقال من النمط الظاهري من النوع الأخير إلى أن الخلية من السابق ، الإجراء الذي وضعه مختبر والمعروف TIPeR (17). هذه الدراسات مفيدة بشكل خاص لدراسة الحالات المرضية والظواهر الخلية ومثل هذه الدراسات ما زالت جارية في الوقت الراهن في المختبر. لا يمكن أن يؤديها RT - PCR أو qPCR على المواد تضخيم لتأكيد تعبير عن خلية محددة الجينات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء تقييمات لكفاءة ترنسفكأيشن أو تنبيغ على مستوى خلية واحدة. المزايا والقصور كما جاء في الملخص ، والعزلة واحدة من الخلايا لتحليل يلغي الآثار المشاهدة في المتوسط ​​مع تحليل للسكان الخلية غير المتجانسة. هذه الآثار متوسط ​​تركيزات تحريف مرنا داخل خلية واحدة أكثر من النصوص التي تمثل في المتوسط ​​وفيرة والخروج ومنع الكشف عن محاضر منخفضة وفرة كثيرة. يمكن أن تستخدم التدفق الخلوي لفرز الخلايا الفردية ، ولكن هذا الأسلوب يتطلب معرفة علامات معينة الخلايا ومعدات باهظة الثمن. microdissection التقاط 18 ليزر الأشعة فوق البنفسجية سواء مع أو الأشعة تحت الحمراء نظم الليزر microdissection التقاط تسمح للخلية واحدة ، وحتى التقاط التحت خلوية ولكنها تتطلب الخلايا التي تهم أن يكون موجودا على سطح المقاطع رقيقة جدا (19). مماثلة لالتدفق الخلوي ، ليزر microdissection التقاط كما يتطلب معدات باهظة الثمن. واحدة من الفوائد الرئيسية لتقنية جمع الكهربائي القائمة المذكورة أعلاه هو أنه يمكن الحصول على بيانات قيمة الكهربية من خلية من الفائدة قبل الحصاد ، مما يسمح للتحليل وظيفي وtranscriptome التي يتعين القيام بها في الخلية نفسها. 20 A السلبي للتقنية لدينا أنها لا تتطلب خبرة في استخدام micromanipulators. سوف المحققون على دراية micromanipulators تجد هذه التقنية بديهية جدا ، ولكن مع عدم وجود أفراد هذه التجربة سوف تحتاج لتصبح مريحة مع الحركات الدقيقة المطلوبة. المتأصلة في أي أسلوب التضخيم هو تضخيم التفضيلية لبعض النصوص على أساس حجم وتكوين النوكليوتيدات. 4،6،7 تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) التقنيات التي تعتمد مثل عكس النسخ بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (RT - PCR) والتضخيم السريع ل[كدنا] تاريخ (العرق) نتيجة التضخيم في الأسي النصوص ، في حين أن تضخيم النتائج آرنا الإجراء في تضخيم الخطية. وهكذا ، واحدة من أهم مزايا هذا الإجراء آرنا يكمن في قدرتها على الحفاظ على أفضل وفرة نسبية من النصوص التي كتبها مرنا فقط تضخيم خطيا أي أخطاء أو التحيزات التي تحدث في عملية التضخيم في مقابل تضخيم الأخطاء بشكل كبير وقال والتحيز. الإجراء آرنا مقرونا تحليل ميكروأري يسمح للمقارنة بين تركيزات مرنا بين الخلايا واحد من التشكل مماثلة أو مختلفة ، معالجة أو غير معالجة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقديم مواد تضخيم لتسلسل الجيل القادم. 5،8 ومع ذلك ، ينبغي توخي الحذر في مثل هذه التحليلات لأنه ، في المقابل الى استخدام بادئات عشوائية لإجراء العملية ، الإجراء بنسبة ضئيلة من DT معبي المذكورة أعلاه التضخيم من التحيزات &quot;3 نهايات مرنا والنتائج عموما في تقصير طفيف في المواد اللاحقة تتضخم مع كل جولة. وينبغي توخي الحذر في تحليل النتائج ميكروأري مع الأساليب القياسية كما تغيب بعض المكالمات كاذبة يمكن أن تنشأ عن تقصير بعض الشيء المادي تضخيمها. بالإضافة إلى ذلك ، في حين تتابع نتائج ستوفر بالفعل 5 كامل قد &#39;تسلسل معظم مرنا الأصلي ، 5&#39; ينبغي تفويتها تسلسل بعض مرنا. لهذه الأسباب ، ينبغي أن يقتصر عدد جولات من التكبير.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>أغطية شرائح Spiegelgas</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>أطباق زراعة Nunc مقاس 35x10 مم</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>المياه المستخدمة في المزارع الخلوية</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>لتحضير المحاليل المستخدمة في زراعة الخلايا وشطف الشرائح الزجاجية الغطائية</td></tr><tr><td>بولي-دي-لايسين بوزن جزيئي 70-150 كيلودالتون</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>لامينين، عالي النقاء</td><td>BD Biosciences</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>حمض البوريك</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>وسط MEM مع محلول إيرل (Earle)&amp;rsquo;الأملاح وGlutamax</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>لزراعة الخلايا</td></tr><tr><td>د-جلوكوز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>بنسلين-ستربتومايسين</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>مصل الحصان</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>سيتوزين بيتا-دي-أرابينوفورانوسيد</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>وسط MEM مع محلول إيرل (Earle)&amp;rsquo;أملاح وL-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>لإنماء الخلايا</td></tr><tr><td>بيروفات الصوديوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>مكمل B27 الخالي من المصل</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب شعرية من زجاج البوروسيليكات (القطر الخارجي 1.5 ملم، والطول 100 ملم)</td><td>كيمبل تشيس</td><td>34500 99</td><td>يمكن استخدام أي ماصة من زجاج البوروسيليكات طالما تم تحقيق قطر التجويف المناسب. </td></tr><tr><td>محلول منظم متوازن للأملاح هانكس (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>سيعمل أي محلول طالما أن المكونات لن&amp;rsquo;لكي لا يتداخل مع أي عمليات معالجة مستقبلية (أي عدم وجود Ca)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; أو Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>محقنة سعة 1 مل</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>إبرة</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>يعتمد المقياس على قطر الماصّات</td></tr><tr><td>مزيج dNTP</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>قليل النيوكليوتيد dt-T7</td><td>مخصص</td><td>معتمدة من ميدلاند (Midland Certified)</td><td></td></tr><tr><td>محلول منظم للسلسلة الثانية (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>مرفق مع محلول منظم للشريط الثاني</td></tr><tr><td>إنزيم DNA Ligase من بكتيريا E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>إنزيم DNA polymerase I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>رناز H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>طقم Megascript T7</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>البادئات العشوائية</td><td>البيولوجيا الجزيئية والخلوية</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>إنزيم النسخ العكسي Superscript III</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>تأتي المجموعة (18080-044) مزودة بمحلول منظم للشريط الأول (Y02321) وDTT.</td></tr><tr><td>طقم MEGAclear</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>طقم تنقية تفاعل MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>إنزيم بوليميراز الحمض النووي T4</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>رناسين (Rnasin)</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>طقم Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>جهاز سحب الماصات الدقيقة بالصهر/بني (Flaming/Brown micropipette puller)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>تمتلك شركة Sutter العديد من الطرازات الأخرى، وقد تمت مناقشة الكثير منها في دليل الإرشادات (cookbook).</td></tr><tr><td>المُتلاعب الدقيق</td><td>شركة أوليمبوس (Olympus Corporation)</td><td></td><td>ستعمل العديد من أجهزة التحكم الدقيق الأخرى، مثل موديلات Eppendorf الأحدث.</td></tr><tr><td>حامل الماصات</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>ستختلف وفقاً للملقط الدقيق والقطر الخارجي للماصة.</td></tr><tr><td>طقم Bioanalyzer RNA 6000 Nano</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptome تحليل خلايا مفردة

Transcriptome Analysis of Single Cells

كثير من تقنيات تحليل الجينات التعبير تعتمد على المواد المعزولة من السكان غير متجانسة من الخلايا من أنسجة أو خلايا الخليط في الثقافة. 1،2،3 في حالة من الدماغ ، مثل مناطق قرن آمون تحتوي على ترتيبات معقدة لأنواع مختلفة من الخلايا ، ولكل منها ملامح متميزة مرنا. القدرة على حصاد الخلايا واحد يسمح لمزيد من العمق في التحقيق في الخلافات بين الدول وداخلها الجزيئية السكان الخلية. نحن تصف طريقة بسيطة وسريعة لحصاد الخلايا لمزيد من المعالجة. وتستخدم ماصات غالبا ما تستخدم في عزل الكهربية (باستخدام الطموح) خلية من الاهتمام ودائع مريح هو داخل أنبوب إيبندورف لمزيد من المعالجة مع أي عدد من تقنيات البيولوجيا الجزيئية. يمكن تعديل البروتوكول لدينا محصول من التشعبات من الثقافة الخلية أو الخلايا الفردية حتى من شرائح حادة. نحن أيضا وصف أسلوب التضخيم آرنا كتطبيق في اتجاه مجرى النهر الرئيسي للالعزلة خلية واحدة. وقد تم تطوير هذا الأسلوب من قبل مختبرنا كبديل لغيرها من تقنيات تحليل الجينات التعبير مثل النسخ والخلف أو في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). 4،5،6،7،8 هذا الأسلوب يوفر لتضخيم خطية من مذيل بعديد الأدينيلات RNA مع بداية femtograms فقط من المواد ونتج عن ذلك مبالغ ميكروغرام من الحمض النووي الريبي العقاقير. المادة تضخيم خطي يقدم تقدير أكثر دقة من التضخيم PCR الأسي من الوفرة النسبية للعناصر transcriptome للخلية معزولة. الإجراء الأساسي يتكون من مجموعتين من التضخيم. لفترة وجيزة ، تأسست فيها بوليميريز RNA T7 موقع مروج [كدنا] الذين تقطعت بهم السبل في ضعف النصوص التي تم إنشاؤها من مرنا. تتم بعد ذلك بين عشية وضحاها في النسخ المختبر (IVT) التي تفاعل البلمرة T7 RNA تنتج العديد من النصوص العقاقير من [كدنا] مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل. الجولة الثانية تكرر هذه العملية ولكن مع بعض الاختلافات الفنية منذ البداية هي مادة الحمض النووي الريبي العقاقير. ذلك هو المعيار لتكرار الجولة الثانية ، مما أدى في ثلاث جولات من التضخيم. في كثير من الأحيان ، يتم تنفيذ الجولة الثالثة في رد فعل المختبر باستخدام النسخ triphosphates نوكليوزيد biotinylated بحيث يمكن تهجين الحمض النووي الريبي العقاقير المنتجة والكشف على ميكروأري. 7،8

نحن في هذه المقالة وصف طريقة بسيطة لحصاد واحد من الخلايا العصبية من ثقافات الجرذان الأولية واللاحقة تحليل transcriptome به آرنا التضخيم. هذا النهج هو تعميم إلى أي نوع من الخلايا.

Transcriptome تحليل خلايا مفردة

تعتمد العديد من تقنيات تحليل التعبير الجيني على مواد معزولة من مجموعات غير متجانسة من الخلايا المستمدة من متجانسات الأنسجة أو الخلايا في...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير عينات من خلايا مفردة لتحليل النسخ (transcriptome analysis). ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إيجاد خلية مناسبة للعزل، ثم توضع الماصة الدقيقة بجوار الخلية المراد عزلها.بعد ذلك، يتم تطبيق الشفط على المحقنة حتى يتم سحب الخلية إلى طرف الماصة الدقيقة. والخطوة النهائية من الإجراء هي كسر طرف الماصة الدقيقة داخل أنبوب الجمع وتفريغ المحتويات المتبقية من الماصة الدقيقة في الأنبوب. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر الاختلافات في مجموعات mRNA بين الخلايا من خلال تحليل المصفوفات الدقيقة للمواد التي تم تضخيمها باستخدام طريقة تضخيم arna، الموضحة أيضاً في البروتوكول، أو لتطبيقات أخرى مثل PCR أو تسلسل الجيل التالي.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية وفهمًا للاختلافات بين الخلايا المفردة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على المكونات دون الخلوية مثل الشجيرات العصبية أو فئات من الشجيرات العصبية، وتوفير معلومات مهمة حول وظيفة الشجيرات العصبية. ستقوم جينيفر سينغ، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. قبل البدء في هذا البروتوكول، تم استزراع عصبونات أولية من حصان البحر لجرذان في اليوم الجنيني 18 على شرائح غطاء قطرها 12 مليمتر في طبق قطر 35 مليمتر، وحُفظت كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ولتحضير الماصات لعملية الحصاد، استخدم ساحب الماصات الدقيقة لسحب ماصات زجاجية معقمة بجهاز الأوتوكلاف إلى قطر مناسب لعلم الفيزيولوجيا الكهربائية.باستخدام البرنامج المسبق الضبط من الشركة المصنعة، لا يكون حجم الفتحة حرجاً لأن الطرف سيتم كسرُه قبل جمع الخلايا. تُحفظ الماصات بعناية في بيئة خالية من الغبار، مثل جرة تخزين الماصات الدقيقة، حيث تظل الأطراف سليمة حتى يحين وقت حصاد الخلايا. يتم تحضير العدد المطلوب من أنابيب einor سعة 1.7 milliliter عن طريق إضافة 2 µL من PBS لتخزين المواد المحصودة.أخرج طبقاً واحداً بقطر 35 مليمتر يحتوي على شرائح غطاء من الحاضنة داخل غطاء تدفق هوائي لزراعة الأنسجة. انقل بسرعة شريحة غطاء واحدة من هذا الطبق إلى غطاء طبق جديد بقطر 35 مليمتر يحتوي على HBSS. من الضروري إعادة شرائح الغطاء التي لا يتم التعامل معها إلى الحاضنة لأن الخلايا تصبح غير صحية.في حال تركها لفترات زمنية طويلة. يلزم استخدام مجهر ضوئي مقلوب مزود بعدسة شيئية 40 x ومجهز بجهاز تلاعب دقيق (micro manipulator) لجمع الخلايا. استخدم حامل ماصة مع أنابيب مرنة تمتد بعيداً عن الحامل، وقم بتثبيت هذه الأنابيب على سطح مستقر لمنع أي حركة غير مرغوب فيها للماصة أثناء عملية الجمع.عند نهاية الأنبوب، أدخل إبرة بحيث يمكن توصيل وتبديل سرنجة سعة 1 mL ذات وصلة قفل لور (lure lock) بين المستخدمين. جهز الماصة الدقيقة (micro pipette) عن طريق كسر الطرف بطريقة محكومة، وذلك بشد منديل كيم (Kim wipe) بين أصابع يد واحدة، ثم تحريك طرف الماصة برفق شديد فوق الورقة من مرة إلى مرتين. يجب أن تكون الفتحة تقريبًا من 75 إلى 100% من حجم الخلية المستهدفة.قم بتثبيت الماصة الدقيقة في حامل الماصة الدقيقة، ثم ثبّت حامل الماصة الدقيقة في الجزء المخصص له في الملاعب الدقيقة. وأخيرًا، اضبط العدسة الشيئية 40x. ضع الطبق على منصة المجهر وحدد منطقة من الخلايا المناسبة للحصاد.في حالة المزارع العصبية الأولية، يجب أن تكون الخلية معزولة نسبيًا عن الخلايا المجاورة لها. ولمنع جمع الخلايا المحيطة أو استطالاتها، ضع الخلية المراد جمعها في مركز مجال الرؤية. استخدم الميكرومانيبولاتور (المُحرك الدقيق) لتقديم الماصة الدقيقة نحو المحلول الموجود في الطبق باتجاه مسار الضوء.أدخل طرف الماصة في المحلول. عند النظر عبر العدسة العينية، يجب أن تظهر الماصة كظل في مجال الرؤية. ابدأ من هذه النقطة بتطبيق ضغط إيجابي عن طريق النفخ بخفة عبر المحقنة فوق مستوى الخلايا بكثير.اضبط موضع طرف الماصة حتى يصبح ضمن مجال الرؤية، ثم ركز على طرف الماصة باستخدام مقابض الضبط الخشن. في هذه المرحلة، تحقق مما إذا كان قطر تجويف الماصة كبيراً جداً أو صغيراً جداً. إذا كان قطر التجويف غير صحيح، استبدلها بماصة دقيقة أخرى حتى يتم العثور على القطر الصحيح، وذلك لمنع كسر الماصة في منطقة التجميع.استخدم مقبض التركيز الخشن لتحريك المستوى البؤري قبل تقريب طرف الماصة نحو الخلايا باستخدام الميكرو-مناورات. ومع اقتراب الخلايا، استخدم التركيز الدقيق حتى يصبح كل من الخلايا وطرف الماصة في بؤرة التركيز. توقف عن تطبيق الضغط الإيجابي قبل الوصول إلى الخلايا المستهدفة لتجنب دفعها بعيداً عن شريحة التغطية.قم بتحديد موضع طرف الماصة باستخدام أدوات التحكم الدقيقة بحيث يلامس جسم الخلية المراد جمعها. وباستخدام السرنجة، قم بتطبيق شفط خفيف عن طريق الفم حتى تدخل الخلية في طرف الماصة. إذا لم تدخل الخلية في الماصة، حرك الطرف بلطف ليكون أقرب إلى الخلية وإلى الأسفل حتى ترفعها من شريحة التغطية.استخدم المجهر المناول لنقل الماصة فوراً إلى الأعلى وإخراجها من المحلول. قم بإزالة الماصة من الحامل. أمسك أنبوب "إينور" (einor) المُجهز بسعة 1.7 milliliter في يد واحدة، واكسر طرف الماصة برفق على جانب الأنبوب باتجاه القاع.مع توجيه الطرف المكسور ليكون في المركز داخل الأنبوب ومستهدفاً علامة 0.1 milliliter، أدخل إبرة متصلة بمحقنة سعة one milliliter في الفتحة العلوية للماصة. اضغط المكبس بسرعة، مما يؤدي إلى دفع المحلول الموجود في الماصة ليرش داخل الأنبوب. احرص على عدم ملامسة الطرف لأي سائل على جدران الأنبوب.بما أن الخاصية الشعرية ستعيد السائل إلى الماصة، يجب أن تظل الخلية في طرف الماصة تماماً، ويكون ذلك كافياً لطرد الخلية بشكل صحيح. قم بتدوير محتويات الأنبوب بسرعة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير مكتبي (micro fuge)، ثم قم بتجميدها على الثلج الجاف أو وضعها على الثلج لمزيد من المعالجة أو لتطبيقات أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو تسلسل الجيل القادم. يظهر هنا مثال لعملية حصاد ناجحة لعصبون معزول.للبدء، تم اختيار منطقة ذات كثافة خلوية منخفضة نسبيًا. ثم تم تحريك طرف الماصة نحو الخلية المطلوبة. يظهر هنا مجال الرؤية بعد حصاد الخلية.لاحظ أن العمليات المحيطة تظل على غطاء الشريحة. وعلى العكس من ذلك، يوضح هذا الشكل صورتين لرؤوس ماصات ذات حجم غير مناسب للحصاد الفعال. سيؤدي هذا الرأس إلى حصاد غير مكتمل، بينما سيؤدي الرأس الموضح هنا إلى حصاد الوسط المحيط.بعد الحصاد، يُوصى بإجراء تحليل تضخيم الـ RNA باستخدام جهاز bioanalyzer لفحص توزيع وكمية الـ RNA المضخم. سينتج عن التضخيم الناجح للمواد المستخلصة من خلية واحدة كميات إجمالية في نطاق الميكروغرامات المنخفضة، وسيكون لها توزيع سلس وواسع. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون دقائق إذا نُفذت بشكل صحيح؛ وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم استخدام تقنية خالية من الـ RNA.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

ويتم قياس الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني حركية النسخي على جينات معينة في الخلايا الحية. والموسومة fluorescently mRNAs مستنسخة من الجينات ذات الاهتمام به والانتعاش بعد الإسفار Photobleaching (FRAP) يتم الحصول على الحركية في الجسم الحي من استطالة النسخي.

قياس حركية النسخ مرنا في الخلايا الحية واحدة

نصف طريقة لفرز خلايا الثدييات المفردة وتحديد التعبير عن ما يصل إلى 96 جينا مستهدفا ذا أهمية في كل خلية. تتضمن هذه الطريقة استخدام معايير qPCR الداخلية لتمكين تقدير عدد النصوص المطلق.

وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

معظم الجينات التعبير القياسات سحابة خلية فردية الاختلافات في الخلية غير المتجانسة السكان. هنا، يمكننا وصف بروتوكول تحليل التعبير الجيني كيف خلية واحدة وفهرس الفرز بالتنوير تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) ويمكن الجمع بين تحديد عدم التجانس وإيمونوفينوتيبيكالي تميز سكان الخلية جزيئيا متميزة.

اتباع نهج خلية واحدة اندماجي لتوصيف الجزيئية والتغاير إيمونوفينوتيبيك الجذعية البشرية والسكان السلف

هذا البروتوكول يصف العمليات العامة ومراقبة الجودة الشيكات اللازمة لإعداد الخلايا المفردة الثدييات الكبار صحية التحضيرات تسلسل الحمض النووي الريبي في خلية مفردة المستندة إلى الحبرية، وارتفاع الإنتاجية. ترتيب المعلمات، محاذاة قراءة وتحليل المصب خلية واحدة bioinformatic تتوفر أيضا.

ترانسكريبتوميكس خلية واحدة على أساس المتوازية الحبرية من أنسجة الثدييات الكبار

يشرح هذا البروتوكول كيفية جمع الخلايا العصبية المفردة وmicroglia والخلايا الفلكية من النواة المركزية للأميغدالا بدقة عالية وخصوصية تشريحية باستخدام المجهر الالتقاط بالليزر. بالإضافة إلى ذلك، نشرح استخدامنا لـ RT-qPCR الميكروسيولية لقياس مجموعة فرعية من النسخ من هذه الخلايا.

الجمع بين الليزر التقاط Microdissection وMicrofluidic qPCR لتحليل الملامح النسخية للخلايا المفردة: نهج بيولوجيا النظم للاعتماد على المواد الأفيونية

هنا قدمنا مضاعفه خليه واحده mRNA أسلوب التسلسل إلى التعبير الجيني الشخصي في الانسجه الجنينية الماوس. الخلية المفردة القائمة علي القطرات mRNA التسلسل (scRNA-Seq) الأسلوب في تركيبه مع استراتيجيات تعدد الإرسال يمكن الملفات الشخصية خلايا واحده من عينات متعددة في وقت واحد ، مما يقلل بشكل كبير من تكاليف الكاشف ويقلل من اثار الدفعة التجريبية.

مولتيميد خليه واحده mRNA تحليل التسلسل من الخلايا الجنينية الماوس

يصف هذا المنشور بروتوكولًا لعزل النوى عن الخلايا الشحمية الناضجة ، والتنقية عن طريق الفرز المُفعّل بالفلور ، و نسخ مستوى الخلية الواحدة.

عزل النوى الأنسجة الدهنية لتطبيقات الجينوم وحيد الخلية

تعرض هذه الورقة طرقًا لنمو الخلايا القلبية ذات الأشكال المختلفة ، والتي تمثل أمراضًا مختلفة ، وفرز هذه الخلايا القلبية المؤمنة استنادًا إلى مورفولوجياها على مستوى خلية واحدة. توفر المنصة المقترحة نهجًا جديدًا في الإنتاجية العالية وفحص الأدوية لأنواع مختلفة من قصور القلب.

نهج لدراسة النسخ المعتمدة على الشكل على مستوى خلية واحدة

جزيء واحد RNA مضان في التهجين الموقعي (smFISH) هو وسيلة لتحديد مستويات بدقة وتوطين الحمض النووي الريبي محددة على مستوى الخلية الواحدة. هنا، نقوم بالإبلاغ عن بروتوكولات المختبر المعتمدة لدينا لمعالجة مقاعد البدلاء الرطبة والتصوير وتحليل الصور للقياس الكمي لخلايا واحدة من RNAs محددة.

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

يصف هذا البروتوكول طريقة الخلية الواحدة للتحليلات فوق الجينية التكرارية باستخدام خلية مفردة قابلة لإعادة الاستخدام. تسمح الخلية المفردة القابلة لإعادة الاستخدام بتحليل العلامات اللاجينية المتعددة في نفس الخلية المفردة والتحقق الإحصائي من النتائج.

خلية مفردة قابلة لإعادة الاستخدام للتحليلات الجينومية التكرارية

تقدم هذه المقالة بروتوكولا لإجراء تنميط نسخي مكاني شامل للحمض النووي الريبي المضيف والفيروسي والفطري والميكروبيوم من أقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين الثابت بالفورمالين باستخدام Stereo-seq ، والذي يتيح رسم خرائط عالية الدقة للنسخ المتنوعة مع الحفاظ على بنية الأنسجة.

التنميط المكاني الشامل للنسخ غير الحيادية للأنواع عبر Stereo-seq

تعلم عزل خلايا عصبية مفردة من ثقافات فئران أولية لتحليل النسخة الجينية باستخدام تقنية تضخيم aRNA. تُتيح هذه الطريقة دراسة التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة بدقة عالية.

Transcriptome تحليل خلايا مفردة

استكشف المزيد من الفيديوهات