Transcriptome تحليل خلايا مفردة
April 25th, 2011
نحن في هذه المقالة وصف طريقة بسيطة لحصاد واحد من الخلايا العصبية من ثقافات الجرذان الأولية واللاحقة تحليل transcriptome به آرنا التضخيم. هذا النهج هو تعميم إلى أي نوع من الخلايا.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد عينات من خلايا مفردة لتحليل النسخ. يتم تحقيق ذلك من خلال العثور أولا على خلية مناسبة للعزل. ثم يتم وضع الماصة الدقيقة بجوار الخلية المراد عزلها.
يتم تطبيق الشفط التالي على المحقنة حتى يتم سحب الخلية إلى طرف الماصة الدقيقة. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في كسر طرف الماصة الدقيقة في أنبوب التجميع وإخراج المحتويات المتبقية من الماصة الدقيقة في الأنبوب. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر الاختلافات في مجموعات الرنا المرسال بين الخلايا من خلال تحليل المصفوفات الدقيقة للمواد التي تم تضخيمها باستخدام طريقة تضخيم الأرنا ، الموضحة أيضا في البروتوكول أو لتطبيقات أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تسلسل الجيل التالي.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة والاختلافات بين الخلايا المفردة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على المقصورات تحت الخلوية مثل التشعبات أو فئات التشعبات ، وتوفر معلومات مهمة عن وظيفة التغصنات. توضح هذا الإجراء جينيفر سينغ ، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبري قبل بدء هذا البروتوكول ، تم طلاء الخلايا العصبية الأولية من اليوم الجنيني 18 ، فرس النهر الجرذ كامبي على زلات غطاء 12 ملم في طبق 35 ملم وتم الحفاظ عليها كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. لتحضير الماصات للحصاد، استخدم مجتذب ماصات صغيرة لسحب الماصات الزجاجية الأوتوكلاف إلى قطر مناسب للفيزيولوجيا الكهربية.
باستخدام برنامج الإعداد المسبق للشركة المصنعة ، فإن حجم التجويف ليس حرجا حيث سيتم كسر الطرف قبل تجميع الخلايا. قم بتخزين الماصات بعناية في بيئة خالية من الغبار، مثل وعاء تخزين الماصة الصغيرة، حيث ستظل الأطراف سليمة عندما تكون جاهزة لحصاد الخلايا. قم بإعداد العدد المطلوب من أنابيب einor سعة 1.7 ملليلتر عن طريق إضافة ميكرولترين من PBS لتخزين المواد المحصودة.
قم بإزالة 1 طبق 35 ملم من زلات الغطاء من الحاضنة في غطاء زراعة الأنسجة. انقل بسرعة زلة غطاء واحدة من هذا الطبق إلى غطاء طبق جديد مقاس 35 ملم يحتوي على HBSS. من الأهمية بمكان إعادة قسائم الغطاء التي لا يتم التلاعب بها إلى الحاضنة حيث تصبح الخلايا غير صحية.
إذا تركت لفترات طويلة من الزمن. يعد المجهر الضوئي المقلوب مع هدف 40 × مزود بمناور دقيق ضروريا لحصاد الخلايا. استخدم حامل ماصة مع أنبوب مرن يؤدي بعيدا عن الحامل، وقم بتثبيت الأنبوب على سطح ثابت لمنع الحركة غير المرغوب فيها للماصة أثناء التجميع.
في نهاية الأنبوب ، أدخل إبرة بحيث يمكن إرفاق حقنة سعة مليلتر واحد مع وصلة قفل إغراء وتغييرها بين المستخدمين. قم بإعداد الماصة الدقيقة عن طريق كسر الطرف بطريقة خاضعة للرقابة عن طريق إمساك منديل Kim المشدود بين أصابع إحدى يديك وتنظيف طرف الماصة برفق شديد عبر الورق مرة إلى مرتين. يجب أن تكون الفتحة حوالي 75 إلى 100٪ من حجم الخلية المستهدفة.
قم بتثبيت الماصة الدقيقة في حامل الماصة الصغيرة وقم بتثبيت حامل الماصة الدقيقة على الملحق الموجود على المعالجات الدقيقة. أخيرا ، قم بتعيين هدف 40 ×. ضع الطبق على مرحلة المجهر وابحث عن منطقة من الخلايا مناسبة للحصاد.
في حالة الثقافات العصبية الأولية ، يجب أن تكون الخلية معزولة نسبيا عن جيرانها. لمنع حصاد الخلايا المحيطة و / أو العمليات ، ضع الخلية المراد حصادها في وسط مجال الرؤية. استخدم المعالج الدقيق لدفع الماصة الدقيقة نحو المحلول الموجود في الطبق إلى مسار الضوء.
اخفض طرف الماصة في المحلول. بالنظر من خلال العدسة ، يجب أن تظهر الماصة كظل في مجال الرؤية. قم بالضغط الإيجابي من هذه النقطة فصاعدا عن طريق النفخ برفق من خلال المحقنة فوق مستوى الخلايا.
اضبط موضع طرف الماصة حتى تصبح ضمن مجال الرؤية وركز على طرف الماصة باستخدام مقابض التركيز البؤري للمسارة. في هذه المرحلة، قم بتقييم ما إذا كان حجم تجويف الماصة كبيرا جدا أو صغيرا جدا. إذا كان حجم التجويف غير صحيح، فاستبدلها بماصة دقيقة أخرى حتى يتم العثور على حجم التجويف الصحيح لمنع كسر الماصة في منطقة التجميع.
استخدم تركيز الدورة التدريبية لتقدم المستوى البؤري قبل دفع طرف الماصة نحو الخلايا باستخدام معالجات الميكرومتر. عندما تقترب الخلايا، استخدم التركيز الدقيق حتى يتم التركيز البؤري على كل من الخلايا وطرف الماصة. توقف عن الضغط الإيجابي قبل الوصول إلى خلايا المدعي لتجنب تفجيرها من زلة الغطاء.
ضع طرف الماصة مع المعالجات الدقيقة بحيث تلامس سوما الخلية المراد حصادها. باستخدام المحقنة ، ضع شفطا لطيفا عن طريق الفم حتى تدخل الخلية إلى طرف الماصة. إذا لم تدخل الخلية الماصة، فحرك الطرف برفق بالقرب من الخلية وإلى الأسفل حتى يرتفع من زلة الغطاء.
استخدم المعالج الدقيق لتحريك الماصة لأعلى وخارج المحلول على الفور. قم بإزالة الماصة من الحامل. أمسك أنبوب einor المحضر سعة 1.7 مليلتر بيد واحدة ، وكسر طرف الماصة برفق على جانب الأنبوب باتجاه الأسفل.
بهدف الحصول على علامة 0.1 مليلتر مع توسيط الطرف المكسور داخل الأنبوب، أدخل إبرة متصلة بحقنة سعة مليلتر واحد في الفتحة العلوية للماصة. اضغط على المكبس بسرعة ، مما يجبر المحلول الموجود في الماصة على الرش في الأنبوب. احرص على عدم لمس الطرف بأي سائل على جانبي الأنبوب.
نظرا لأن العمل الشعري سيعيد السائل إلى الماصة ، يجب أن تظل الخلية في طرف الماصة ، ويجب أن يكون هذا كافيا لطرد الخلية بشكل صحيح. قم بتدوير محتويات الأنبوب بسرعة باستخدام جهاز صغير لسطح المكتب وقم بتجميده على الثلج الجاف أو ضعه على الجليد لمزيد من المعالجة أو لتطبيقات أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تسلسل الجيل التالي. يظهر هنا مثال على حصاد ناجح لخلية عصبية معزولة.
للبدء ، تم اختيار منطقة منخفضة الكثافة نسبيا من الخلايا. ثم تم دفع طرف الماصة نحو الخلية المطلوبة. هنا يظهر مجال الرؤية بعد حصاد الخلية.
لاحظ أن العمليات المحيطة تظل على زلة الغطاء. على العكس من ذلك ، يوضح هذا الشكل صورتين لأطراف الماصة ، والتي بحجم غير مناسب للحصاد الفعال. ستؤدي هذه النصيحة إلى حصاد غير مكتمل بينما سيؤدي الطرف الموضح هنا إلى حصاد البيئة المحيطة.
بعد الحصاد ، يوصى باستخدام محلل حيوي لفحص توزيع وكمية الحمض النووي الريبي المضخم. سيؤدي التضخيم الناجح من مادة الخلية المفردة إلى إنتاج كميات إجمالية بالميكروغرام المنخفض وسيكون له توزيع سلس وواسع بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم استخدام تقنية خالية من الحمض النووي الريبي.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لحصاد الخلايا الفردية من ثقافات الخلايا العصبية الأولية للفئران لتحليل النسخ باستخدام تضخيم aRNA. تعتبر التقنية قابلة للتكيف مع أنواع مختلفة من الخلايا، مما يسمح بدراسة مفصلة للتعبير الجيني على مستوى الخلية الفردية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم النسخ
الخلفية
- توفر تحليل الخلية الواحدة رؤى حول التغاير الخلوي.
- فهم الاختلافات في التعبير الجيني أمر بالغ الأهمية لأبحاث علم الأعصاب.
- تعتبر ثقافات الخلايا العصبية الأولية ضرورية لدراسة وظيفة الخلايا العصبية.
- تقنيات الحصاد حيوية لتحليل النسخ الدقيق.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لعزل الخلايا العصبية الفردية.
- تسهيل تحليل النسخ للخلايا الفردية.
- تعزيز فهم تباين التعبير الجيني في الخلايا العصبية.
الطرق المستخدمة
- عزل الخلايا الفردية باستخدام تقنيات الماصات الدقيقة.
- تطبيق تضخيم aRNA لتحليل النسخ.
- استخدام المجهر الضوئي المعكوس لتصور الخلايا.
- المعالج الدقيق لتحديد موضع الماص بدقة.
النتائج الرئيسية
- عزل ناجح للخلايا العصبية الفردية من الثقافات الأولية.
- تبيان الاختلافات في تجمعات mRNA بين الخلايا المعزولة.
- تطبيقات محتملة في تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل الجيل التالي.
- رؤى حول وظيفة التغصنات من خلال الحصاد المستهدف.
الاستنتاجات
- تسمح الطريقة بتحليل النسخ المفصل على مستوى الخلية الفردية.
- يمكن تكييفها لأنواع مختلفة من الخلايا بخلاف الخلايا العصبية.
- يعزز هذا النهج فهمنا للتنوع الخلوي في الأنسجة العصبية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptome analysis enables biopharma teams to resolve cellular heterogeneity and uncover gene expression differences that are masked in bulk tissue assays. This capability is critical for target validation, mechanistic de-risking, and prioritizing disease-relevant cell populations in early discovery. Integrating robust single-cell workflows strengthens predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression at the resolution of individual cells, clarifying pathway activity and target engagement.
- Supports biological de-risking by distinguishing molecular signatures between cell types and subcellular compartments.
- Improves predictive confidence for target selection by revealing heterogeneity within disease-relevant tissues.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated single-cell samples for downstream transcriptomic assays.
- Enables reproducible isolation and amplification of RNA from individual cells, supporting quantitative assay development.
- Provides scalable input material for microarray, PCR, or next-generation sequencing platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant neuronal subtypes or compartments, supporting translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by enabling single-cell resolution analyses.
- Reduces risk of advancing non-representative targets by confirming expression in relevant cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
This single-cell isolation and aRNA amplification workflow bridges early discovery and preclinical research, providing high-resolution transcriptomic data for target validation and lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling gene expression analysis at the single-cell level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs suitable for downstream high-throughput assays.
- Analytics: Generates amplified RNA for microarray or sequencing, enabling robust comparison of gene expression across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant neuronal subtypes or compartments.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, adaptable workflow for diverse cell types and experimental models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell isolation and amplification, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated cellular relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell handling and RNA-free technique to prevent contamination.
- Needs access to micro-manipulation instrumentation and analytical platforms for RNA quantification and analysis.
- Demands cross-team standardization of isolation and amplification protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell types and subcellular compartments with protocol modifications.
- Sample integrity and RNA yield are sensitive to handling and timing, requiring careful workflow management.
