مناعي لونين الفحص الجينات الأنسجة الخاصة باستخدام أجنة فئران في مرحلة مبكرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل أجنة الفئران في اليوم 8.5 (E 8.5) لاستخدامها في مقايسات الكروماتين، أو الترسيب المناعي، أو مقايسات ChIP. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال عزل أجنة الفئران وتحضير معلقات من الخلايا المفردة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إجراء ربط متصالب كيميائي للبروتينات المرتبطة بالـ DNA مع الـ DNA الجينومي، يليه استخدام الموجات فوق الصوتية (sonication) لتجزئة الـ DNA.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في ترسيب المعقدات البروتينية الكروماتينية مناعياً وعزل الحمض النووي DNA المُنقى. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تحليل الحمض النووي DNA المُرسب مناعياً والمنقى عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التقليدي أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (quantitative real-time PCR). وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تُظهر تفاعلات البروتينات مع التسلسلات التنظيمية للجينات الخاصة بالتمايز أثناء بدء برنامج التمايز في الأنسجة والأعضاء النامية.

يمكن أن يساعد هذا الفصل في الإجابة على سؤال جوهري حول بدء برنامج التمايز أثناء التكوين الجنيني، وذلك من خلال تحديد العوامل التنظيمية التي تتفاعل مع التسلسلات التنظيمية للجينات الخاصة بالتمايز عندما تصبح مؤهلة نسخياً. لبدء هذا الإجراء، يتم استئصال القرون الرحمية من فأرة تم التضحية بها في اليوم الجنيني 8.5. ووفقاً لبروتوكول معتمد، توضع الأنسجة في طبق بتري يحتوي على وسط تقطيع طازج باستخدام مقص.

قم بقص كل موقع انغراس بشكل فردي وضعها في طبق بتري يحتوي على وسط تشريح طازج لتجنب الدم الزائد. وباستخدام الملقط، قم بإزالة طبقة الرحم من كل موقع انغراس للكشف عن الجنين، ثم اعزل الأجنة بشكل فردي باستخدام الملقط. في هذه المرحلة من التطور، تكون الأجنة محاطة بكيس المح الكيس الجداري، الذي يتصل بأنسجة الديسيدوا، وكيس المح الحشوي، والغشاء السلوي.

السلى هو غشاء شفاف يكون في اتصال مباشر مع الجنين. يقع كيس المح yolk sack الحشوي بين السلى وكيس المح الجداري، ويمكن تمييزه بسهولة في الأجنة التي يتراوح عمرها من 8.5 إلى 9.5 أيام من خلال وجود أوعية دموية بارزة تغذي الجنين. قم بإزالة كل جنين من الأغشية المحيطة به وانقله بشكل فردي إلى طبق جديد يحتوي على وسط تشريح لإزالة الدم الزائد.

بعد ذلك، انقل كل جنين إلى أنبوب إبيندورف سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 200 ميكرولتر من وسط التشريح. تبدأ عملية تجانس الجنين المعزول بإضافة 200 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز من النوع الثاني إلى كل أنبوب إبيندورف يحتوي على الأجنّة.

رج العينات برفق في جهاز رجاج عند درجة حرارة 37 °C وبسرعة 100 RPM لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، أعد تعليق العينات عن طريق النقر لتفكيك تجمعات الخلايا. ضع معلق الخلايا فوق مصفاة خلايا معقمة بفتحات قياسها 40 ميكرون موضوعة فوق أنبوب eend rph سعة 1.5 milliliter.

قم بإضافة 600 µL من محلول one X-D-P-B-S بدرجة حرارة الغرفة فوراً إلى الجزء العلوي من مصفاة الخلايا لإتمام عملية الفصل. وبمجرد تصفية المعلق، تخلص من مصفاة الخلايا ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 4,000 G لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من السوائل الطافية.

علّق كل راسب في 1 mL من محلول 1X DPBS بدرجة حرارة الغرفة. ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 4,000 G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من الطافي للمرة الثانية، أعد تعليق كل راسب في 200 µL من وسط التشريح بدرجة حرارة الغرفة، وقم بربط الكروماتين تشابكياً بإضافة 5.6 µL من الفورمالديهايد بتركيز 37% إلى عينات الـ 200 µL للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1% من الفورمالديهايد.

يتم تحضين العينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وبعد التحضين، تُطرد العينات مركزياً عند 4,000 G لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية ثم يُتخلص من السائل الطافي. تُعاد معلقة الخلايا باستخدام 1X DPBS بارد يحتوي على 80 µL/mL من مزيج مثبط البروتياز أو PIC. بعد ذلك، تُطرد العينات مركزياً عند 4,000 G لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

بعد التخلص من الطافي، يمكن تجميد العينات عند درجة حرارة -80 °C، وهي تظل مستقرة لعدة أشهر قبل عملية السونكة. يتم إذابة كريات الخلايا المجمدة على الثلج أو وضع الكريات الناتجة من الخطوة السابقة على الثلج. أعد تعليق كريات الخلايا في 100 µL من منظم تحلل SDS في درجة حرارة الغرفة. بعد إعادة التعليق، يتم إضافة 100 µL إضافية من منظم تحلل SDS في درجة حرارة الغرفة، ثم يُعاد تعليق العينة عن طريق السحب بالماصة والقلب.

يتم تحضين معلق الخلايا على الثلج لمدة 10 دقائق. بعد التحضين، يتم ضبط جهاز التقطيع لتجزئة الحمض النووي (DNA) المترابط عرضياً إلى طول يتراوح بين 200 و 500 زوج قاعدي. في هذا العرض التوضيحي، تم استخدام جهاز DIO geno bio rupture UCD 200.

قم بإجراء السونكة للعينة وهي محاطة بمزيج من الثلج المجروش. لا تسمح بارتفاع درجة حرارتها فوق 4 °C أو بتجمدها. قم بطرد العينة التي خضعت للسونكة مركزياً عند 14,000 G لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

انقل السائل الطافي إلى أنبوب DPH جديد مبرد مسبقاً على الثلج. قسّم العينة التي خضعت للموجات فوق الصوتية إلى خمس حصص كحد أقصى. خزن حصة واحدة عند درجة حرارة 20- درجة مئوية للاحتفاظ بها لاستخدامها في عملية عكس الارتباط التشابكي.

قم بتخفيف العينات الأخرى عشر مرات في محلول تخفيف الرقاقة الذي يحتوي على PIC مُضاف حديثاً بمعدل 1 µL لكل 800 µL من المحلول المنظم. أولاً، حدد سرعات الهواء التي ستُستخدم في عملية التصفية المسبقة بناءً على الأجسام المضادة التي ستُستخدم لبروتين مقايسة الرقاقة. تم استخدام الخرزات من النوع A هنا لأن الجسم المضاد المستخدم للرقاقة هو من نوع rabid.

قم بالتنقية المسبقة للمادة الطافية المخففة عن طريق إضافة 75 µL من حمض نووي DNA وبروتين سائل مني سلمون بتركيز 50%. يتم التحضين في جهاز هزاز عند درجة حرارة 4 °C مع الدوران لمدة ساعة واحدة، وبعد التحضين يتم طرد العينات مركزياً عند 2,500 G لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة 4 °C. انقل المادة الطافية إلى أنبوب eend DPH مبرد مسبقاً.

أضف 4 µg من الأجسام المضادة لكل عينة إلى Eloqua المُنقاة مسبقاً، وتحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C مع التدوير. ابدأ بإضافة 60 µL من معلق خرزات aeros المكون من بروتين DNA من نطف السلمون إلى كل عينة، وتحضنها عند درجة حرارة 4 °C مع التدوير لمدة ساعة واحدة. ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 1000 ×g لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة 4 °C.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي بعناية وتخلص منه مع الحفاظ على معقد الحمض النووي والبروتين والخرز على الثلج. أعد تعليق الرواسب واغسلها كما هو موضح في البروتوكول المكتوب باستخدام المحاليل المنظمة من واحد إلى أربعة.

تتكون كل عملية غسيل من فترة تحضين لمدة خمس دقائق مع التدوير، يليها طرد مركزي عند 1000 G لمدة دقيقة واحدة وإزالة السائل الطافي بعد الغسيل. يتم استخلاص معقد الجسم المضاد والكروماتين عن طريق إعادة تعليق معقد خرزات بروتين الكروماتين المغسولة في 250 µL من محلول الاستخلاص المُحضّر حديثاً؛ يتم رج كل عينة بقوة باستخدام جهاز الـ Vortex لمدة خمس ثوانٍ، ثم تُحضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع التدوير، يتبع ذلك طرد مركزي عند 2,500 G لمدة دقيقة واحدة. وفي درجة حرارة الغرفة، يتم نقل كل مستخلص إلى أنبوب eph جديد.

كرر عملية الاسترداد واجمع النواتج المستخلصة لكل عينة في أنبوب eph نفسه. لعكس الروابط التقاطعية، أضف 20 µL من كلوريد الصوديوم بتركيز five moer إلى كل 500 µL من النواتج المستخلصة. وبالنسبة لعينة التحكم المدخلة التي تم الاحتفاظ بها مسبقاً، أضف 40 µL من كلوريد الصوديوم بتركيز five moer لكل 1 mL.

سخن أنابيب الاستخلاص (EITs) في حمام مائي عند درجة حرارة 65 °C لمدة أربع ساعات. وللتشغيل طوال الليل، قم بتحميل 10 µL من كل عينة في تحكم الإدخال (input control) على هلام أغاروز بتركيز 2% بجانب مؤشر حجم يمتد من 0.1 إلى 1 kb للتحقق من حجم قطعة DNA. ستظهر الـ DNA على شكل لطخة (smear) وليس كحزمة حادة.

استخلص الحمض النووي DNA من كل عينة بحجم 500 µL باستخدام مجموعة استخلاص الهلام السريع من kaya. ابدأ بإضافة 600 µL من محلول qg buffer لتحسين امتصاص الـ DNA بواسطة غشاء السيليكا في عمود kaya quick spin، ثم أضف 200 µL من isopropanol قبل تحميل العمود. افحص الخليط لتحديد ما إذا كان هناك أي راسب من SDS.

في حال حدوث ترسيب لـ SDS، يجب تدفئة العينات في حمام مائي بدرجة حرارة 42 °C حتى يختفي الراسب. بعد ذلك، تُوضع العينات في الأعمدة ويتم استخلاص الـ DNA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. يمكن لـ SDS أن يتداخل مع نشاط بوليميراز PCRT، لذا يجب إزالته تماماً قبل إجراء PCR.

قم بتحضين كل عينة DNA على الثلج لترسيب أي SDS متبقٍ، ثم قم بالطرد المركزي عند 14,000 G لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. انقل SANE إلى أنابيب einor جديدة. يمكن الكشف عن DNA EITs إما عن طريق PCR التقليدي أو عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي أو QPCR باستخدام بادئات متخصصة لكل تسلسل سيتم تحليله؛ استخدم من 5 إلى 10 µL من إجمالي DNA IIT لكل تفاعل PCR أو QPCR واحد، علماً بأن ظروف PCR و QPCR ستختلف.

ومع ذلك، فإن الكمية المحدودة من المادة البادئة تتطلب دورات PCR إضافية للكشف عن طريق PCR التقليدي، ابدأ بـ 40 دورة وعدلها حسب الحاجة. وباستخدام هذا البروتوكول، تم إجراء عمليات استخلاص من أجنة في المرحلتين E 8.5 و E 9.5. وتم تحليل الحمض النووي DNA المُنقى من الرقاقات بواسطة PCR التقليدي وبواسطة PCR الكمي في الوقت الحقيقي.

تظهر النتائج أن العامل العضلي والتنظيمي موجود على المحفز العضلي في أجنة المرحلة E 8.5 وE 9.5. وفي المقابل، لم يكن هناك أي مؤشر على الارتباط العضلي بالمحفز العضلي في كيس البلوط حيث لا يتم التعبير عن العوامل العضلية. وقد استُخدم محفز إنترفيرون غاما، الذي يحتوي على تسلسلات تطابق موقع الارتباط العضلي، كضابط تسلسل سلبي، وكما كان متوقعاً، لم يرتبط العامل العضلي بمحفز إنترفيرون غاما في أي من عينات الأنسجة التي تم اختبارها.

تشير النتائج إلى أن Myogenic يرتبط بمحفز Myogenic في الجسيدات (somites) لأجنة في المراحل E 8.5 و E 9.5، حيث يتم التعبير عن myo Genin بشكل محدد في الجسيدات في هذه المراحل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية عزل وتحضير أجنة الفئران في المرحلة EA 0.5 من أجل إجراء تحليل الترسيب الكروماتيني (chromatin precipitation assay) الذي سيحدد العوامل التنظيمية الموجودة في الجينات النوعية للأنسجة في الأنسجة النامية.