ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation
April 17th, 2011
علينا إثبات وجود في الجسم الحي بروتوكول electroporation transfecting لمجموعات واحد أو عقدة صغيرة من الخلايا الشبكية (RGCs) وغيرها من أنواع الخلايا الشبكية في الفئران بعد الولادة أكثر من مجموعة واسعة من الأعمار. القدرة على التسمية والتلاعب وراثيا RGCs بعد الولادة في الجسم الحي هو أداة قوية للدراسات الإنمائية.
الهدف العام من التجربة التالية هو نقل مجموعات مفردة أو صغيرة من الخلايا العقدية الشبكية باستخدام التثقيب الكهربائي في الجسم الحي في فئران ما بعد الولادة لدراسة تطور الإسقاطات القاحلة في الشبكية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعريض مقلة العين جراحيا وحقن كمية صغيرة من محلول الحمض النووي للبلازما مباشرة في شبكية العين. كخطوة ثانية ، يتم وضع الأقطاب الكهربائية على مقلة العين مباشرة فوق موقع الحقن ، ويتم تطبيق النبضات الكهربائية ، مما يسمح بنقل الحمض النووي للبلازما إلى الخلايا العصبية في الشبكية.
بعد ذلك ، في العمر المطلوب ، يتم حصاد شبكية العين والأدمغة المثقلة بالكهرباء لتصور الخلايا العقدية الشبكية المنقولة ويتم الحصول على إسقاطاتها لنتائج الجهاز العصبي المركزي التي تظهر وضع العلامات الفلورية لكل من التشعبات و ARBs المحورية لخلايا العقدة الشبكية المسماة في هياكلها المستهدفة تحت القشرية المختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل التثقيب الكهربائي للشبكية داخل الرحم ، هي أن هذه التقنية أقل توغلا ولا تتداخل مع أحداث توجيه المحور العصبي المبكرة ، مثل العبور عند التصلب البصري. كما يسمح لنا بتسمية مجموعة صغيرة أو خلايا عقدية شبكية واحدة في فئران ما بعد الولادة بتحكم مكاني وزماني دقيق.
لعمل أقطاب كهربائية للتثقيب الكهربائي ، قم بكسر شق واحد من زوج من ملقط دومون رقم خمسة ، ثم قم بلحام سلك في قاعدة كل شق. لف القاعدة بأسلاك عازلة وشريط لاصق وقم بتركيب فاصل بلاستيكي بين الشوكات لتوفير عمل زنبركي. بمجرد تجميع الأقطاب الكهربائية معا ، قم بتوصيل السلك من شق واحد بدواسة القدم ، والتي يتم توصيلها في سلسلة بالمحفز الكهربائي.
عند الضغط على دواسة القدم ، يتدفق التيار عبر الأقطاب الكهربائية. بعد ذلك ، قم بتوصيل السلك من الشق الآخر بالمحفز الكهربائي. وأخيرا ، قم بتوصيل المحفز الكهربائي براسم الذبذبات وشاشة الصوت.
قم بتركيب نظام الحاقن على مناور صغير ثلاثي المحاور على المقعد باستخدام مجتذب الماصة. اصنع ماصات زجاجية مسحوبة بتفتق طويل وطرف صغير باستخدام إبرة مزودة بحقن النانو اثنين. قم بإعادة ملء الماصة المسحوبة بالزيت المعدني وثبتها في الحاقن الصغير.
باستخدام مقص التشريح المجهري الحاد. قم بقص طرف الماصة المثبتة لإنشاء فتحة من 2 إلى 3 ميكرومتر. املأ الماصة بمحلول الحقن عن طريق سحبها لأعلى من خلال الطرف المفتوح.
تخدير الملوثات العضوية الثابتة في H بعد أربعة إلى خمسة أيام من الولادة بسبب انخفاض حرارة الجسم. وتأكيد حالة التخدير باستخدام قرصة إصبع القدم. ضع الفأر المخدر تحت منظار تشريح وافتح الجفن جراحيا عن طريق القطع على طول الجفن المستقبلي فتح بمقص التشريح المجهري ، وقم بإبروز مقلة العين عن طريق الضغط برفق حول محجر العين باستخدام ملقط.
ضع الماصة بالقرب من مقلة العين عن طريق ضبط المعالج الدقيق. اضغط على دواسة القدم لنظام الحقن المجهري للتأكد من عدم انسداد طرف الماصة بيد واحدة. قم بتثبيت مقلة العين البارزة عن طريق الضغط على الجلد حول محجر العين بالملقط بالآخر.
حرك المعالج الدقيق بحيث تخترق الماصة صبغة الشبكية والظهارة وتدخل شبكية العين. قم بتوزيع الكمية المطلوبة من المحلول عن طريق الضغط على دواسة القدم ، وسحب الماصة وضع أطراف القطب مباشرة فوق موقع الحقن. على جانبي مقلة العين التي تلامس السطح للتو ، اضغط على دواسة القدم المتصلة بالمحفز لإكمال الدائرة والعرض الكهربائي لمقلة العين.
ادفع مقلة العين برفق إلى تجويفها وضع مرهم للعيون فوق الجرح. ضع الفئران على وسادة تدفئة يتم الحفاظ عليها عند 36 درجة مئوية حتى تستعيد وعيها وتعيدها إلى والدتها فقط RG CS المنقولة. مع كل من البلازميد والترميز ل Cree Recombinase و flock stop EGFP قادرة على التعبير.
يتم تحقيق وضع العلامات على الخلية المفردة EGFP بفضل التركيز المنخفض نسبيا لبلازميد Cree المستخدم EGFP المسمى عقدة شبكية واحدة ، ويمكن تصور تشعبات الخلايا والمحاور في شبكية العين المسطحة. يمكن أيضا تصنيف أنواع خلايا الشبكية الأخرى مثل خلايا أوميكرون النجمية بهذه التقنية. نرى هنا مثالا على مجموعة من الخلايا العصبية الشبكية المسماة EGFP ، بما في ذلك خلايا RG CS و omicron في شبكية العين المسطحة في اليوم 14 بعد الولادة.
باستخدام هذه التقنية ، يمكننا تحليل استهداف موضوع شبكية العين ل RG CS في عموم متفوق كامل من جميع إحداثيات الشبكية الرئيسية الأربعة في نفس الماوس بمجرد إتقانها. يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أربع إلى خمس دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الحقن البؤري لمحاليل مثل الحمض النووي للبلازما في شبكية العين بعد الولادة وفي الجسم الحي للخلايا العصبية في الشبكية باستخدام التثقيب الكهربائي.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا للكهربائي الحيوي لنقل جزيئات الحمض النووي إلى خلايا العقدة العقدية في الشبكية في الفئران بعد الولادة. تتيح هذه التقنية التلاعب الجيني وتمييز خلايا العقدة العقدية بدقة، مما يسهل الدراسات التنموية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الشبكية
- العلاج الجيني
الخلفية
- تلعب خلايا العقدة العقدية دورًا حاسمًا في معالجة الإشارات البصرية.
- فهم تطورها ضروري للحصول على رؤى حول اضطرابات النظام البصري.
- الطرق الحالية للنقل قد تكون تدخلية وتؤثر على التطور المبكر.
- تهدف هذه الدراسة إلى توفير بديل أقل تدخلاً.
غرض الدراسة
- تطوير بروتوكول لنقل جزيئات الحمض النووي إلى خلايا عقدية واحدة أو مجموعات صغيرة من خلايا العقدة العقدية.
- دراسة تطور الإسقاطات الشبكية في الفئران بعد الولادة.
- تحقيق تحكم مكاني وزماني دقيق في تمييز خلايا العقدة العقدية.
الطرق المستخدمة
- التعرض الجراحي للمقلة لإجراء حقن مباشر لمحلول الحمض النووي.
- تطبيق نبضات كهربائية لتسهيل نقل الحمض النووي إلى الخلايا العصبية في الشبكية.
- حصاد الشبكيات والأدمغة الكهربائية في الأعمار المطلوبة.
- تصور الخلايا العقدية العقدية المنقولة وإسقاطاتها باستخدام تمييز فلوريسنت.
النتائج الرئيسية
- نقل ناجح لخلايا العقدة العقدية مع تمييز فلوريسنت للمحاور ونتوءات الخلايا.
- تبيان التحكم الدقيق في تمييز مجموعات صغيرة من خلايا العقدة العقدية.
- أقل تدخلاً من الطرق التقليدية، مع الحفاظ على توجيه المحاور المبكر.
- تشير النتائج إلى تصور فعال لإسقاطات الخلايا العقدية العقدية إلى الهياكل المستهدفة في الجهاز العصبي المركزي.
الاستنتاجات
- تقنية الكهربائي الحيوي فعالة لنقل جزيئات الحمض النووي إلى خلايا العقدة العقدية.
- تعزز هذه الطريقة القدرة على دراسة تطور الشبكية.
- توفر أداة قيمة للأبحاث المستقبلية في بيولوجيا الشبكية.
