جيل من الخلايا الجذعية العصبية من الأنسجة الجنينية البشرية المهملة القشرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الجذعية العصبية البشرية من أنسجة القشرة الجبهية المستبعدة. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير المحاليل والمواد مسبقاً قبل تشريح الأدمغة الجنينية البشرية، يتبع ذلك الحفاظ على الخلايا الجذعية العصبية المعزولة، بما في ذلك المزيد من التوسيع والتوصيف وإجراء التجارب.

يعد التخزين طويل الأمد أمراً ممكناً، وكذلك إنشاء مزارع فرعية لتمايز الخلايا السليفة إلى أنواع من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. وفي نهاية المطاف، يمكن توصيف تمايز الخلايا المشتقة من الجهاز العصبي المركزي الطبيعي ومقارنتها بتمايز الخلايا المشتقة من جهاز عصبي مركزي مصاب باضطرابات عصبية معروفة. وتمتد آثار هذه التقنية نحو علاج أو تشخيص أي اضطراب في الجهاز العصبي المركزي البشري.

توفر هذه التقنية منصة بسيطة وموثوقة لتقييم الحالة المرضية لـ S ولتقييم الفعالية الدوائية للأدوية الجديدة لاضطراب معين. ونظراً للقيمة الاستثنائية للخلايا متعددة القدرات، يجب تجهيز جميع المواد مسبقاً قبل البدء في البروتوكول. ولتقليل مخاطر تضرر العينات، يتم تحضير أدوات التشريح المبردة، وحمام مائي لتدفئة وسط الزرع عند 37 درجة Celsius، ووسط الزرع، ووسط تجميد الخلايا المبرد للحفظ طويل الأمد.

من أجل الحفظ بالتجميد لعملية التشريح، يجب تحضير ملاقط وشفرات مشرط مع مقابضها معقمة بالمؤتومكليف لتفكيك الخلايا. قم بتوفير مسدس ماص، وماصات نقل سعة 10 milliliter، ومصفاة خلايا بقطر 40 micromolar. وأخيراً، قم بتجهيز عدة أطباق زراعة بقطر 10 centimeter للتشريح ووضعها جانباً.

أنابيب طرد مركزي سعة 50 milliliter لعملية الفصل. أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 milliliter لتخزين الأنسجة وقوارير تجميد لتجميد الخلايا. لضمان النجاح، يجب حصاد الأنسجة الحية التي يتراوح عمرها من 18 إلى 22 أسبوعاً في غضون ساعتين من توفرها.

من الناحية المثالية، يمكن الحصول على الأنسجة الجنينية في غضون دقائق من توفرها عن طريق الترتيب لجمعها بعد الإجراءات الاختيارية. وغالبًا ما تكون الأنسجة مجزأة، ومع ذلك، يظل جزء كبير من الدماغ سليمًا. اجمع الدماغ في طبق بتري سعة 10 milliliter مملوء بـ dissection Medium مبرد بالثلج.

حدد الأجزاء المختلفة من القشرة المخية من خلال المعالم التشريحية. يتم توجيه حدود القشور الجبهية والجدارية والقذالية عن طريق التقاطع المستقرأ للتلم المركزي والشق السيلفياني. قم بتشريح الأنسجة من القشرة الجبهية أمام التلم المركزي وعلى طول حدود الشق السيلفياني باستخدام شفرات جراحية.

تأكد من الحفاظ على البطين سليماً وغير تالف. الآن، قم بإزالة أي بقايا من الدم والسحايا من الكتلة المنفصلة من القشرة الجبهية. إذا كانت العينة غير مجزأة بشكل كبير وكبيرة بما يكفي، قم بتشريح الكتلة إلى عدة عينات أصغر لحفظ بعضها من أجل الدراسات النسيجية ومقايسات البروتين أو mRNA.

انقل الآن قطعة من الدماغ إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter وأضف ثلاثة أضعاف حجم النسيج من وسط التشريح المبرد بالثلج. وباستخدام الماصة، قم بتفكيك النسيج بلطف حتى تتجزأ جميع الأنسجة. ولتعليق الخلايا بالكامل، قم بترشيحها عبر مصفاة خلايا ذات مسام 40 micromolar.

قم الآن بطرد معلق الخلايا مركزياً، ثم أعد تعليق كتلة الخلايا الناتجة في 10 milliliters من وسط زراعي طازج ودافئ. وباستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer)، قم بعدد الخلايا وحساب الحجم اللازم للحصول على 2 million خلية. الآن، انقل الحجم الذي يحتوي على 2 million خلية إلى قارورة زراعة بمساحة 25 centimeter square.

تُحضّر باستخدام خمسة ملليلترات 5 mL من وسط استزراع دافئ. تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 °C مع 5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد. يتم استبدال نصف الوسط مرة واحدة أسبوعياً في حالات الاستزراع طويلة الأمد. وبعد مرور أسبوع إلى أسبوعين من الاستزراع، تتشكل عادةً كرات عصبية بقطر NSC يتراوح بين 200 و 400 ميكرون.

لتفكيك الكرات العصبية إلى خلايا مفردة، يتم تحضين الخلايا مع EDTA في وسط هانك لمدة 15 دقيقة. ولتجهيز الخلايا العالقة للاستنبات الفرعي، يتم ترسيبها عن طريق الطرد المركزي، ثم غسلها بوسط هانك وإعادة تعليق الخلايا في وسط استنبات دافئ.

لبدء عملية التمايز، يتم زرع الخلايا المفككة على شرائح غطاء مطلية بالـ poly de lysine والـ Laminin one بكثافة 100, 000 خلية لكل شريحة غطاء، ثم تُحضن لمدة 30 دقيقة. ويمكن تمايز هذه الخلايا بسهولة إلى خلايا قليلة التغصن أو عصبونات أو خلايا نجمية.

من أجل التمايز العصبي، يتم الحفاظ على الخلايا في وسط يحتوي على B 27 لمدة سبعة أيام. ولزراعة تمايز الخلايا النجمية، تُحفظ الخلايا في وسط يحتوي على FBS لمدة سبعة أيام. أما بالنسبة لتمايز الخلايا الدبقية قليلة التغصن، فيتم الحفاظ على الخلايا في وسط معدل يحتوي على عوامل النمو لمدة يومين، وبعد يومين يتم استخدام الوسط المعدل نفسه بدون عوامل النمو لمدة خمسة أيام أخرى لتخزين الخلايا الجذعية.

بعد طرد تعليقات الخلايا المفككة مركزياً، أعد تعليق الخلايا في وسط التجميد بتركيز 10 مليون خلية لكل أنبوبة. لكل ملليلتر، جمد الخلايا ببطء عند درجة حرارة -20 °C قبل تجميدها عند درجة حرارة -80 °C للتخزين طويل الأمد. ثم انقلها إلى النيتروجين السائل.

لاحقاً، يتم إذابة الخلايا بسرعة باستخدام حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C وإعادة تعليقها في وسط D-M-E-M-F 12 دافئ مضاف إليه 10% serum لغرض الغسل. ثم تُطرد الخلايا الدافئة مركزياً، وتُسحب السوائل، ثم تُعاد تعليقها في الوسط الزرعي الدافئ.

خلايا جذعية عصبية متوسطة من جنين طبيعي. في الأسبوع الثامن عشر من العمر الجنيني، تمت زراعتها لتكوين كرات عصبية، والتي تم تحويلها باستخدام GFP. تم تمايز الكرات العصبية لإنتاج عدة أنواع من الخلايا التي تم تثبيتها لاحقاً وصبغها باستخدام علامات خلوية وrumine.

يُلاحظ تعدد القدرات من خلال التعبير عن علامات تشير إلى الخلايا العصبية، والخلايا النجمية، والخلايا الدبقية قليلة التغصن. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وتوسيع ومعالجة الخلايا الجذعية العصبية البشرية من أنسجة القشرة الجبهية المهملة. توفر هذه المناطق فرصة فريدة لدراسة آليات أمراض البيئة القشرية البشرية، واختبار الفعالية المحتملة للعوامل العلاجية الدوائية.