ampliPHOX الكشف اللونية على ميكروأري الحمض النووي لمكافحة الأنفلونزا

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام طريقة جديدة وسريعة لتضخيم الإشارة لاكتشاف وتوصيف الأنواع الفرعية الفيروسية للأنفلونزا على رقاقة الإنفلونزا ، منصة المصفوفات الدقيقة منخفضة الكثافة. يتم تحقيق ذلك من خلال دمج DTPs البيوتينيل واستخدام بادئات ذات نهاية فوسفول خماسية لتضخيم الجزء الجيني المصفوفة ومقطع جيني غير هيكلي من مستخلصات الحمض النووي الريبي للأنفلونزا. يتبع تفاعل البوليميراز المتسلسل الهضم الأنزيمي والتجزئة لتوليد منتج فيروسي قصير أحادي الشريطة بيوتينيل وتضخيم ، والذي يتم تهجينه بعد ذلك إلى المصفوفة بعد التهجين.

يستخدم اكتشاف الثعلب البلمرة الضوئية لزراعة بقع بوليمر كبيرة حيث يحدث التهجين ، وتستخدم أنماط التهجين التفاضلي للكشف عن الأنواع الفرعية لفيروسات الأنفلونزا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الكشف القياسي عن التألق ، هي أنها غير مكلفة إلى حد ما وتوفر نتيجة سريعة مرئية للعين المجردة مع حساسية تحليلية مماثلة للتألق. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتوصيف فيروسات الأنفلونزا باستخدام شريحة الإنفلونزا لأنها طريقة عالمية للكشف عن الفيروس.

يمكن أيضا تطبيق Ampl Fox على مجموعة متنوعة من الأنظمة الأخرى ، مثل المصفوفات الدقيقة منخفضة الكثافة القائمة على الحمض النووي والبروتين. من الناحية النظرية ، يجب أن يكون أي منتج حيوي قابلا للكشف باستخدام amox. سيظهر الإجراء أمبر تايلور ، عالم مشارك ، وكيفن مولتون ، مساعد باحث هنا في إنديفور اللذين كان كلاهما مركزيا في تطوير أداة فوكس وكيمياء الكشف على مدى السنوات العديدة الماضية.

استخرج الحمض النووي الريبي الفيروسي من 200 ميكرولتر من المعزول الفيروسي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي وبروتوكول الشركة المصنعة. قم بالتخلص من 60 ميكرولتر من الحجم النهائي وقم بتخزين المستخلصات عند 70 درجة مئوية تحت الصفر أو أقل لاستخدامها لاحقا. ثم قم بإعداد المزيج الرئيسي R-T-P-C-R على ICE وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

باستخدام خليط DNTP الحيوي ، أضف مزيج برايمر رقائق الأنفلونزا ، والذي يحتوي على التركيزات الموضحة للمزيج الرئيسي. يجب أن يحتوي التمهيدي واحد من كل مجموعة على خمسة مجموعات فوسفول رئيسية لتسهيل الهضم الأنزيمي. تنتج مجموعة الإنفلونزا التمهيدي 1032 منتجا أساسيا ، وتنتج مجموعة التمهيدي للإنفلونزا B منتجا 811 زوجا أساسيا.

لفترة وجيزة وتوزيع 18 ميكرولترا من المزيج الرئيسي في أنابيب PCR رقيقة الجدران. ثم أضف ميكرولترين من قالب الحمض النووي الريبي إلى كل أنبوب تفاعل. انقل أنابيب PCR إلى جهاز تدوير حراري واستخدم ملف تعريف ركوب الدراجات بدرجة حرارة مناسبة للركوع.

ملف تعريف ركوب الدراجات المستخدم في هذا الاختبار هنا. قم بإعداد مزيج الهضم الأنزيمي عن طريق الجمع بين 2.2 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل الإنزيم و 0.8 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز و 1.0 ميكرولتر من إنزيم لامدا إكسونوكلياز لكل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بإزالة العينات من جهاز التدوير الحراري وأضف أربعة ميكرولترات إلى كل أنبوب PCR.

أعد العينات إلى جهاز التدوير الحراري وقم ببرمجة جهاز التدوير الحراري كما هو موضح إلى 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، متبوعة ب 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتطبيق آبار تهجين للاستخدام الفردي حول المصفوفات الدقيقة المراد تهجينها. ثم اغسل الشرائح في 110 مل من الماء النقي على شاكر مداري لمدة خمس دقائق.

جفف الشرائح عن طريق لمس منديل الأنسجة برفق على حافة البئر. اجمع بين 22 ميكرولترا من اثنين من المخزن المؤقت للتهجين مع كل منتج من منتجات الحمض النووي أحادية الخيط المجزأة المجزأة الممزوجة لفترة وجيزة وماصة 40 ميكرولترا في آبار المصفوفات الدقيقة. اسمح للشرائح بالتهجين لمدة ساعة واحدة في غرفة الرطوبة بعد التهجين ، وقم بإزالة الشرائح من غرفة الرطوبة واشطف كل شريحة لفترة وجيزة بملليلترين من المخزن المؤقت للغسيل D. ضع الشرائح في رف شرائح.

بعد ذلك ، أضف 110 مل من مخازن الغسيل A و B لفصل الحاويات باستخدام شاكر مداري. اغسل رف الشرائح في المخزن المؤقت A عند 60 إلى 90 دورة في الدقيقة ، وهي السرعة المستخدمة في جميع عمليات الغسيل اللاحقة لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بإزالة رف الشرائح من المخزن المؤقت للغسيل A واشطفه لفترة وجيزة باستخدام مخزن الغسيل D.انقل رف الانزلاق لغسل المخزن المؤقت B واغسله على شاكر المداري لمدة خمس دقائق.

بعد الغسيل ، جفف المصفوفات برفق على كل شريحة بمنديل مناديل ووضع الشرائح المجففة في غرفة الرطوبة. استعدادا لخطوات الكشف عن مقياس لون الثعلب ، اجمع بين 10 ميكرولتر من السعة ، و 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت للسعة x ، و 10 ميكرولتر من الماء النقي لكل مصفوفة لتتم معالجتها ، وانقل 40 ميكرولترا من خليط الملصقات إلى كل مصفوفة واسمح لتفاعل الملصقات بالمضي قدما في غرفة رطوبة مغلقة لمدة خمس دقائق أثناء التهجين ، تحضير 110 مل من مخزن الغسيل C في وعاء. بعد وضع العلامات ، اشطف كل مصفوفة على الفور باستخدام عازلة الغسيل D.ضع كل شريحة في رف الشرائح واغسل المخزن المؤقت C على شاكر المداري لمدة خمس دقائق بعد غسل البحر العازل ، وغمر رف الشرائح لفترة وجيزة ثلاث مرات في وعاء من الماء النقي.

لإزالة بقايا الملح ، جفف المصفوفات كما هو موضح سابقا. قم بتخزين المصفوفات في مربع شرائح داكن حتى تنشيط الصورة والتصوير ، والتي يجب أن تكتمل في غضون 24 ساعة. بعد ذلك ، قم بتشغيل قارئ Amli Fox وتأكد من أن برنامج عرض Amli جاهز لتنشيط الصورة قبل اكتشاف عينة المصفوفة.

أولا، حدد الوقت الأمثل لتنشيط الصورة لجميع العينات باتباع إجراء معايرة قصير. مرة واحدة لكل استخدام يومي، قم بتسخين محلول Amplify إلى درجة حرارة الغرفة والدوامة لفترة وجيزة لخلط الماصة ثلاثة ميكرولترات من محسن التضخيم في قارورة التضخيم والدوامة جيدا. لمدة 10 ثوان ، ضع 40 ميكرولترا من محلول Amplify بالتساوي على شريحة واحدة فقط في كل مرة ، مع ضمان عدم وجود فقاعات.

أدخل شريحة المصفوفة الدقيقة في حجرة تنشيط الصور الخاصة بقارئ Amplify. ابدأ تنشيط الصورة عن طريق تحديد ، وابدأ في برنامج عرض PL باستخدام وقت تنشيط الصورة المحدد في عملية المعايرة. بمجرد الانتهاء ، اشطف المصفوفة الدقيقة بملليلترين من الماء النقي لإزالة التضخيم الزائد ، وقد حدث تكوين البوليمر الصافي الآن على البقع التي تحتوي على الحمض النووي المستهدف ولكن يتم تصورها بشكل أفضل.

بعد التلوين ، اترك بقع البوليمر تجف لمدة دقيقتين. ثم وزعي قطرتين من اللون الأحمر الوافر على المصفوفة واتركي التلوين يستمر لمدة دقيقتين بعد التلوين ، اشطف الشريحة بسرعة بالماء النقي وجففها كما هو موضح سابقا ، أدخل الشريحة في حجرة التصوير الخاصة بقارئ Amli Fox لجمع صورة باستخدام برنامج amli لمعالجة النتائج. تظهر الصورة اليسرى اكتشاف رواية عام 2009 H one N عينة واحدة من قبل Amli Fox.

بينما تستخدم الصورة الموجودة على اليمين التألق التقليدي الناتج عن ماسح ضوئي مضان متحد البؤر ، يمكن رؤية نفس نمط الكشف العام بسهولة لكلتا الطريقتين. ومع ذلك ، فإن نتيجة ثعلب أملي مرئية للعين المجردة. تظهر هذه الصور نتائج رقائق الإنفلونزا من أصل بشري ، H ثلاثة N اثنين من أصل بشري ، H واحد N واحد ، أصل الخنازير ، H واحد N واحد ، ومجموعة ثعالب سلبية تفتقر إلى الأنفلونزا التي يمكن اكتشافها.

ينتج التسلسلان الثاني والثالث الموضحان باللون الأزرق إشارة لجميع الأنفلونزا. تظهر أنواع فرعية ، لكن التسلسلات الموضحة باللون الأحمر في أسفل اليمين تنتج فقط إشارة لأصل الخنازير ، H واحد N عينة واحدة. تظهر العينة السالبة إشارة على تسلسل تحكم داخلي موضح باللون الأخضر ، مما يشير إلى عدم وجود تثبيط أو فشل في تفاعل R-T-P-C-R.

بمجرد إتقان العملية برمتها من استخراج القارورة إلى الكشف عن الأموكس وتفسير النتيجة النهائية يمكن إجراؤها في حوالي ست ساعات. يمكن إكمال جزء الكشف عن Ampl Fox من الإجراء ، بما في ذلك معايرة الجهاز ، في حوالي 30 دقيقة باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الجينوم الجزئي أو الكامل للإجابة على أسئلة إضافية.

يهدف اختبار الأنفلونزا هذا إلى أن يكون فحصا أوليا ، خاصة للعينات التي تؤدي إلى نمط تهجين فريد. نظرا لأن الكشف هو اختبار عام ، نأمل أن يجد الباحثون تطبيقات مصفوفة دقيقة جديدة ومثيرة للاهتمام منخفضة الكثافة يمكن أن يضيف إليها الاكتشاف قيمة.