توصيف المعزولة ، مهواة ، والرئة ماوس المجهزة Perfused مع تدفق نابض

لدراسة علاقات تدفق الضغط الرئوي النابض. يشرح هذا البروتوكول كيفية عزل رئتي الفأر وتهويتهما وتفتيشهما. تتعرض القصبة الهوائية جراحيا للتهوية.

ثم يتم عزل القلب والرئتين بحيث يمكن قنية الشريان الرئوي والأذين الأيسر. ثم يتم نفخ الجهاز الرئوي. يتم إجراء التجارب عن طريق تغيير تدفق الشريان الرئوي وحجمه وشكله الموجي و / أو التردد.

يتم تسجيل أشكال موجات الشريان الرئوي والضغط الأذيني الأيسر الناتجة وتوضح علاقات تدفق الضغط الرئوي النابض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل الاستعدادات في الجسم الحي ، هي التغيرات في علاقات تدفق الضغط. يمكن الحصول على علاقات تدفق الضغط النابض في حالة عدم وجود تغييرات في حالة الحجم ، ونغمة الجهاز العصبي الودي ، والنشاط ، وتأثيرات التخدير.

أيضا ، تقيس معظم مستحضرات الرئة المعزولة علاقات تدفق الضغط الثابت فقط ، بينما تسمح تقنيتنا بتحديد علاقات تدفق الضغط النابض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فسيولوجيا الرئة ، مثل كيف يؤثر مرض الأوعية الدموية الرئوية على ديناميكا الدم الرئوية النابضة ، أو كيف يؤثر تصلب الشريان الرئوي الكبير على الحمل اللاحق للبطين الأيمن؟ يعد العرض البصري لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم تعريض القلب والرئتين وتأمين القنية في الشريان الرئوي.

يمكن أن يتسبب الضغط الزائد الناتج عن الأجهزة في حدوث وذمة في الرئتين ويمكن أن يؤدي وضع القنية بشكل غير صحيح إلى ثقب الشريان الرئوي. قبل البدء في التجربة ، من الضروري إعداد نظام IL واحد يستخدم لتهوية الرئة المعزولة وتفتيحها. يجب توصيل الأنبوب بمحولات الضغط.

ا مضخة انفرادية ومقياس تدفق تماما اغسل النظام بالماء المقطر الدافئ إلى 37 درجة مئوية وقم بإزالة أي فقاعات في الأنبوب. ثم قم بتجهيز أنبوب مضخة Endur tech بنسبة 1٪ PBS. الآن صفر.

الضغط لكل محول طاقة P 75 عن طريق إغلاق صممه أولا إلى نظام IL واحد وفتح صممه في الغلاف الجوي. ثم استخدم مضخم الصوت SIS للقابس لتصفير الضغط تلقائيا قبل تحضير ، وقم بترطيب إعداد IO one عن طريق نقع قطعة السيراميك المسامية في الماء المقطر. بعد تخدير الماوس ، قم بتثبيت الماوس لإجراء الجراحة عن طريق تثبيت كفوفه الأمامية على اللوح.

الآن رش الصدر بالكحول بنسبة 95٪. استخدم ملقطا مستقيما للإمساك بالجلد عند الرقبة وقطع فتحة بطول سنتيمتر واحد بالمقص المستقيم. بمجرد انكشاف الجزء الداخلي من الرقبة ، قم بقطع الأنسجة الغدية البيضاء في العضلات السطحية أثناء البحث عن المريء والقصبة الهوائية.

اعزل المريء والقصبة الهوائية عن الأنسجة على كلا الجانبين والخلف واربط خياطة فضفاضة حول القصبة الهوائية. لتقشير القصبة الهوائية ، قم بقطع حرف V صغير بعناية في جانب واحد منه باستخدام المقص الصغير. الآن خذ الماوس إلى نظام IL one باستخدام ملقط حاد.

أمسك قنية القصبة الهوائية وحركها في القصبة الهوائية. قم بتأمين القنية بخياطة. ابدأ التهوية بهواء الغرفة أولا ، ورش الصدر بالكحول وقم بإزالة الجلد باستخدام ملقط مستقيم ومقص مستقيم.

قطع الجلد لأعلى على طول القص. ارفع الجلد على كل جانب واقطع على طول خط الأضلاع السفلية. الآن فهم عملية الخنجري باستخدام الملقط واستخدم مقص طرف الكرة لقطع ثقب في الحجاب الحاجز حيث يلتقي بالجزء السفلي من القص.

أمسك الحجاب الحاجز واقطعه بعيدا عن الضلوع. باستخدام مقص كروي ، أمسك عملية الخنجري مرة أخرى واستخدم المقص الكروي المائل لقطع القص بعناية من خلال الأضلاع دون الإضرار بالرئتين أو القلب أو الأوعية الدموية. لفضح القلب ، أمسك الأضلاع اليسرى واقطع أطرافها.

الآن حقن البطين الأيمن ببطء مع 0.1 مل من الهيبارين بعد الحقن ، قم بقطع باقي الأضلاع. استخدم الجزء الخلفي أو الطرف المستدير من الملقط لدفع الرئتين برفق بعيدا عن الضلع أثناء قطع الضلوع تحت المجهر. إزالة الأنسجة الغدية في الدهون الموجودة أعلى القلب.

استخدم الملقط لسحب المناديل وتقليمها. باستخدام مقص الزنبرك لوضع خياطة حول الشريان الأورطي والشريان الرئوي ، ضع القلب برفق بملاقط ضعيفة. يجب أن يكون هناك القليل من المقاومة.

الآن اربط خياطة فضفاضة برمي مزدوج. بعد ذلك ، قم بقطع أسفل البطن. استخدم مقصا بزاوية لقطع الأضلاع والعمود الفقري.

سيؤدي ذلك إلى تدفق كمية كبيرة من الدم. استخدم Q-tip لوقف التدفق. بمجرد إيقاف تدفق الدم ، قم بتجهيز نظام IL بأربعة ملليلتر من RPMI من حقنة مملوءة ب 10 ملليلتر من RPMI.

من الجيد التحقق مرة أخرى من أن الأنبوب لا يحتوي على فقاعات. الآن قم بتقطيع البطين الأيمن عن طريق قطع شق صغير بالقرب من القمة وإدخال قنية Aim لأسفل في اليمين للوصول إلى الشريان الرئوي. يجب أن يكون طرف المسبار مرئيا من خلال الجدار شبه الشفاف للشريان الرئوي.

ثم شد الخيط حول القنية والشريان الأورطي والشريان الرئوي لقنية البطين الأيسر. اقطع درجة في القمة وأدخل القنية مع توجيهها لأعلى في الأذين الأيسر. قد تكون هناك حاجة إلى ضغط طفيف للعثور على الصمام ، ولكن بمجرد العثور عليها ، ستنزلق القنية وتكون آمنة بدون خياطة.

قم بغرس RPMI يدويا من حقنة 10 مليلتر بسرعة 0.3 مل في الدقيقة حتى ترى التدفق في أنبوب التدفق الخارج. إذا لم يكن هناك تدفق في أنبوب التدفق الخارج، فقم بتغيير موضع قنية البطين الأيسر. ومع ذلك، إذا لم يكن هناك تدفق في الرئتين، فقم بإجهاض التجربة لأنه من المحتمل أن يكون الشريان الرئوي مصابا بالتسرب.

الآن بعد أن تم تقويه القلب بالكامل ، قم بتوصيل المحقنة سعة 60 ملليلتر بنظام IL one. باستخدام مضخة التدفق الثابت وغرس RPMI Perfuse ثمانية بمعدل مليلتر واحد في الدقيقة. تحقق من وجود تسرب أثناء التروية الأولية.

قم ببث الرئتين تدريجيا لمدة دقيقتين أخريين تتحول خلالها الرئتان إلى اللون الأبيض. لدراسات التدفق النابض. قم أولا بتعيين إزاحة مكبس المضخة الانفرادية على المستويات المطلوبة.

ثم اضبط معدل التدفق الثابت. الآن افتح الصمام إلى مضخة osli وابدأ في تسجيل البيانات مباشرة قبل تشغيل ملف تعريف تدفق osli. بمجرد الانتهاء ، افتح ملف إخراج البيانات وارسم التدفق التجريبي بناء على التدفقات التجريبية من التجربة الأولية.

اضبط إزاحة مكبس المضخة التذبذبية عند كل تردد بحيث يكون Q max حسب الرغبة. امسك التهوية عند ضغط ثابت أثناء جمع البيانات لتجارب التدفق الثابت ، أغلق الصمام على المضخة الانفرادية واضبط معدل التدفق الثابت على المستوى المطلوب. ابدأ في تسجيل البيانات وانتقل عبر بروتوكول التدفق الثابت.

جمع البيانات لمدة 10 ثوان على الأقل في كل معدل تدفق بين التجارب. أعد ضبط معدل التدفق إلى 0.5 مل في الدقيقة. تأكد من الاحتفاظ بالتهوية عند ضغط ثابت أثناء جمع البيانات.

إذا كانت التجارب الصفرية للضغط الأذيني الأيسر مطلوبة ، فقم بإزالة أنابيب التدفق أثناء إجراء التجارب. راقب بيقظة RPMI في أنابيب مجرى الهواء. يجب عدم السماح ل RPMI بالوصول إلى محولات ضغط مجرى الهواء وإلا ستتلف.

فيما يلي نتائج نضح التدفق المستمر مع التدفق Q في الصف العلوي والشريان الرئوي الناتج والضغوط الأذينية اليسرى في الصف الثاني في ظل مجموعة متنوعة من الظروف. في أول لوحتين ، زاد الضغط الأذيني الأيسر وانخفض مع Q لأن أنبوب التدفق الخارجي كان في مكانه ، وتظهر اللوحة الأولى ضغط الهواء في النهاية ، وضغط الشهيق ، والثانية تظهر ضغط الهواء عند ضغط الزفير النهائي. بعد ذلك ، تمت إزالة الأنبوب بحيث يكون الضغط الأذيني الأيسر ثابتا ومستقلا عن Q.ثم تم ضبط ارتفاع أنبوب المخرج يدويا بحيث يكون الضغط الأذيني الأيسر أعلى.

ولكن بغض النظر عن Q مرة أخرى ، تظهر اللوحة الأولى ضغط الهواء في النهاية ، وضغط الشهيق ، والثانية تظهر ضغط الهواء في النهاية. ضغط الزفير. يمكن الحصول على علاقات تدفق ضغط الشريان الرئوي الثابت الناتجة لكل حالة عن طريق رسم الضغط مقابل التدفق.

فيما يلي نتائج نضح التدفق النابض مع التدفق Q في اللوحة العلوية والشريان الرئوي الناتج وضغط الأذين الأيسر والهواء. في اللوحة السفلية. من علاقات تدفق الضغط الرئوي النابض هذه ، يمكن حساب مقاومة الأوعية الدموية الرئوية ، مما يعكس الحمل اللاحق للبطين الأيمن الكلي.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 20 إلى 30 دقيقة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تأخذ وقتك وتسترخي حتى تكون يديك ثابتتين. بمجرد أن يتم نفخ الرئتين بشكل كاف ، ينتهي الجزء الصلب.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تقنيات أخرى مثل الأنسجة أو المقايسات الكيميائية الحيوية على أنسجة الرئة للإجابة على أسئلة إضافية مثل الآليات الجزيئية المسؤولة عن التغيرات الملحوظة في علاقات تدفق الضغط النابض الرئوي. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال فسيولوجيا الرئة لاستكشاف دور جينات وبروتينات معينة في تطور وتطور أمراض الأوعية الدموية الرئوية باستخدام الفئران المعدلة وراثيا.