Name: غزو الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: تعلم قياس قدرة سلالات Staphylococcus aureus على غزو الخلايا البشرية باستخدام بروتوكول دقيق. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات التفاعل بين المضيف والممرض وتطوير استراتيجيات علاجية محتملة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست (WT 0795880).

وبروتوكول التالية تصف الدراسة لغزو الخلايا البطانية التي كتبها S. ويمكن نظريا المذهبة ولكن يمكن استخدامها لدراسة الغزو الخليوي عن أي بكتيريا زروع. مراحل محددة لS. يشار المذهبة والبطانية الخلايا. 1. اعداد البكتيريا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة س سلالات المكورات ل16/04 ساعة (تبعا لمرحلة النمو المطلوبة) في 10 مل الدماغ و القلب مرق (بهي) تسريب عند 37 درجة مئوية في الهواء مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. هذه الشروط هي محددة لنمو س. قد المذهبة ، وتحتاج إلى تكييف للبكتيريا أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل البكتيريا ثلاث مرات في المتوسط ​​Dulbecco في التعديل النسر (DMEM ؛ Invitrogen) بواسطة قذائف بديلة للطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة (5000 س ز ، 10 دقيقة) ، وإزالة لطاف والثقافة ، وإعادة تعليق من بيليه الجرثومي في وحدة تخزين ما يعادل DMEM. قياس كثافة بصرية لتعليق الناتجة من البكتيريا ومن ثم يمكن تعديله على النحو المطلوب. لS. المذهبة ، ونحن نستعد تعليق على OD 600 = 1 ، والذي يتوافق مع 10 ~ 9 -1 مل CFU. </li></ol> 2. الخلية البطانية الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة خط الخلية البطانية EA.hy926 1 في DMEM تستكمل مع الجنين مصل الأبقار (FBS ؛ 10 ٪) والجلوتامين L - (2 ملم) في 37 درجة مئوية في ثاني ٪ 5 2. بدلا من ذلك ، يمكن شراؤها المجمعة الأولي الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVECs) من Lonza (بازل ، سويسرا) والمثقف في المتوسط ​​القاعدية البطانية تستكمل مع FBS 2 ٪ ، واستخراج الدماغ البقري (بما في ذلك الهيبارين) ، والبشرية عامل النمو البطاني والهيدروكورتيزون في 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2 وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (Lonza). هذه الشروط هي محددة لنمو هذه الخلايا ، وربما تحتاج إلى أن تتكيف لغيرها من أنواع الخلايا المضيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة خلايا بطانية T75 في قوارير لإكمال confluency ، التحقق من العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات 24 - جيدا لادراج coverslips. وهناك حاجة إلى ملقط غرامة (لهب تعقيمها) لنقل coverslips التي سطح واحد لامعة شفافة واحد. coverslips مكان في الآبار من 24 لوحة جيدا مع سطح معتم تواجه صعودا للسماح مرفق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحرير الخلايا من القارورة T75 مع 3 مل التربسين - EDTA (0.25 ٪) وإضافة إلى 10 مل من مستنبت ذات الصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من معلق الخلايا إلى جانب 24 لوحات تحتوي على زجاج coverslips Thermanox. قدم أحد T75 قارورة متموجة من الخلايا خلايا كافية لوحات 24 على اثنين ، مما أدى إلى حوالي 5 × 10 5 خلايا لكل بئر (في المتوسط ​​500 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات لمدة 48 ساعة كما هو موضح أعلاه ، وتحقق 100 ٪ الخلية confluency بواسطة المجهر الضوئي مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع غسل coverslips في برنامج تلفزيوني وإضافة إلى لوحات 24 بئر جديدة تحتوي على 490 DMEM ميكرولتر FBS تحتوي على 10 ٪ في كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للنظر في دور العمليات الأيضية محددة في غزو الخلايا ، يمكن إضافة مثبطات إلى الخلايا المستزرعة ح 1 قبل إضافة البكتيريا وتجمعات المحافظة خلال الفحص. على سبيل المثال ، لتحديد دور في إعادة ترتيب أكتين س. غزو ​​الخلايا البطانية المذهبة ، ويمكن اضافة 50 ميكرومتر مثبط حركة الخلايا D ، أو لدور caveolae ، 5 ملي الميثيل β - cyclodextrin يمكن إضافتها. </li></ol> 3. غزو ​​الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 10 ميكرولتر من البكتيريا غسلها (مما أدى إلى ما يقرب من 2 × 10 7 مل CFU المذهبة س -1) التي تحتوي على كل بئر ساترة غسلها مع طبقة من الخلايا البطانية متكدسة في 490 DMEM ميكرولتر تحتوي على 10 ٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحتضان 15-90 دقيقة في 37 في 5 ٪ CO 2 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس العدد الكلي للبكتيريا المرتبطة الخلايا (ملتصقة والمنضوية) ، وتراجع في غسل coverslips ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني وإضافة إلى آبار جديدة تحتوي على 500 ميكرولتر تريتون 0.5 ٪ X - 100 في برنامج تلفزيوني. لضمان الخلايا ليز بالكامل والإفراج عن جميع البكتيريا المنضوية ، ماصة لعدة مرات ، لافتا غيض من ماصة مباشرة على سطح ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعداد البكتيريا عن طريق طلاء تعليق السائل (أو التخفيفات هذا إذا لزم الأمر) على سطح اللوحات TSA. منذ TX - 100 وليز العديد من الجراثيم سلبية الغرام ، يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك سابونين 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس عدد من البكتيريا المنضوية ، إزالة طاف الثقافة من كل البكتيريا غير منضم يحتوي جيدا واستبدالها ب 500 ٪ FBS DMEM/10 ميكرولتر تستكمل مع 200 ميكروغرام جنتاميسين -1 مل. نستخدم عادة جنتاميسين بدلا من lysostaphin هنا كما هو أرخص ويسمح لنا للتبديل بين التجارب باستخدام أنواع مختلفة من البكتيريا (مثل المكورات العنقودية وLactococci) دون الحاجة إلى تغيير بروتوكول التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2 لمدة 60 دقيقة لقتل جميع الجراثيم خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips 3 مرات في برنامج تلفزيوني ،ليز و تعداد بواسطة الطلاء على TSA صفه للمقايسة التصاق أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في بعض الحالات قد يكون من الأفضل أن نعتمد بصريا عدد من البكتيريا باستخدام المجهر الضوئي. في هذا المثال ، ومحددة لس. المكورات غزو الخلايا ، استخدم lysostaphin (10 ميكروغرام مل -1) بدلا من الجنتاميسين لتدمير البكتيريا فعليا خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحتضان coverslips 20min عند 37 درجة مئوية في ثاني 2 في حل lysostaphin ، ثم شطف والإصلاح مع Cytopath (Cellpath). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفيضانات coverslips مع الكريستال البنفسجي (0.5 ٪ ، ث / ت) ل5min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الماء ، والهواء الجاف وتراجع شطف جبل على الشرائح الزجاجية. ويمكن قياس عدد من البكتيريا في 2 مم من الخلايا البطانية متموجة باستخدام المجهر الضوئي. </li></ol> 4. ممثل النتائج : التعبير عن البروتينات ملزمة فبرونيكتين (FnBPA وFnBPB) على سطح س. المكورات يمنح القدرة على غزو الخلايا البطانية. الأعمال الأخيرة أدى إلى إعادة تعريف المجال فبرونيكتين الملزم FnBPA 3. البرية من نوع (WT) س. المكورات 8325.4 يغزو الخلايا البطانية ذات كفاءة عالية ، في حين تفتقر سلالة كلا FnBPA وباء (Δ FNB) أظهرت انخفاض مستويات كبيرة من تدخيل (الشكل 1A). تكامل للمتحولة مع ترميز FNB البلازميد ناقص لم المجال فبرونيكتين ملزم (pFnR0) لا تشجع الغزو (الشكل 1A). على النقيض من ذلك ، تكامل للمتحولة مع ترميز البلازميد في FNB كامل المورثة (pFnBA4) استعادة الغزو إلى مستويات WT (الشكل 1A). ويمكن أيضا دور في غزو FnBPA الخلية البطانية يمكن أظهر باستخدام المضيف اللبنية التعبير Lactococcus مغاير. التعبير عن بلازميد ترميز FnBPA في L. لم اللبنية (pRM9 9) لن يعزز بشكل ملحوظ لالتصاق الخلايا البطانية مقارنة البكتيريا معربا عن أي FnBPA (CTL) (الحانات مفتوحة ، 1B الشكل). على النقيض من ذلك ، معربا عن FnBPA - L. غزت اللبنية الخلايا البطانية على مستويات أعلى بكثير من سلالة غير التعبير عن (الحانات التي أغلقت ، 1B الشكل). وأجريت التجارب في مكررة أربع مرات ، وقدم يعني ± الانحراف المعياري. * تمثيل البيانات الإحصائية التي تختلف اختلافا كبيرا (ع = &lt;0.05) من وزن أو قيم CTL. <img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. غزو EA. Hy926 الخلايا البطانية التي كتبها س. الذهبية (A) أو L. اللبنية (B).

<ol><li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).</li>
<li>Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+variation+of+the+opacity+outer+membrane+protein+controls+invasion+by+Neisseria+gonorrhoeae+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells.</a> EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).</li>
<li>Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+attach+to+human+fibronectin+through+a+tandem+beta-zipper%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper.</a> Nature. 423, 177-181 (2003).</li>
<li>Magoffin, R. L., Spink, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protection+of+intracellular+Brucella+against+streptomycin+alone+and+in+combination+with+other+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics.</a> J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).</li>
<li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+intraleukocytic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Interaction of intraleukocytic bacteria.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).</li>
<li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22+Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).</li>
<li>De Melo, M. A., Pechere, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mucin+on+Campylobacter+jejuni+association+and+invasion+on+HEp-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells.</a> Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).</li>
<li>Shaw, J. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+invasion+of+human+tissue+culture+cells+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).</li>
<li>Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Host+Cell+Invasion+and+Virulence+in+Sepsis+is+Facilitated+by+the+Multiple+Repeats+within+FnBPA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).</li>
<li>Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+invasion+of+a+human+oral+cell+line+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans.</a> Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).</li>
<li>Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusobacterium+nucleatum+transports+noninvasive+Streptococcus+cristatus+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).</li>
<li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun.%22%5BJournal%5D)">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).</li>
<li>Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+fibronectin+binding+protein-A+induces+motile+attachment+sites+and+complex+actin+remodeling+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).</li>
<li>Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li>
<li>Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pyogenes+serotype+M1+encodes+multiple+pathways+for+entry+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li>
<li>Eiff, C. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+small+colony+variants%3A+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li>
<li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li>
<li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

<html> يستند مقايسة وصفنا على مقايسة حماية الجنتاميسين ، والتي استخدمت على نطاق واسع لدراسة غزو الخلايا المضيفة البكتيريا. واستخدمت ملاحظات لعدم قدرة المضادات الحيوية وغيرها من الجنتاميسين لقتل البكتيريا داخل الخلايا في الدراسات المبكرة على غزو الخلايا المضيفة 4-8 البكتيريا. استخدام 48 أو 24 أو حتى 96 - جيدا يسمح لوحات توليد كميات كبيرة من البيانات ، وكمية استنساخه في فترة قصيرة من الوقت وبتكلفة منخفضة نسبيا. في مقايسة غير جذابة أيضا لأنها لا تتطلب معدات متخصصة ، يمكن أن تكون مصممة للعمل مع مختلف الجراثيم والخلايا ، ويمكن استخدامها لدراسة دور كل من عمليات الخلية البكتيرية والمضيفة في غزو 9. في الواقع ، منذ وقت التجارب ، وقد تم فحص الحماية المستخدمة على نطاق واسع الجنتاميسين لقياس الخلية المضيفة غزو من قبل مجموعة من البكتيريا أو تركيبات مختلفة من البكتيريا حتى 10،11. في حين أن المبادئ الأساسية هي أن العديد اختلافات دقيقة في نفس الأسلوب قد تم الإبلاغ عنها. في هذه المقالة قد وصفنا نسختنا وأشار إلى التعديلات التي قد تكون ضرورية لغيرها من البكتيريا أو الخلايا المضيفة. عند تصميم تجربة لقياس المضيف غزو الخلايا باستخدام هذا النهج أن هناك عددا من النقاط الهامة في الاعتبار : الحساسية البكتيرية للجنتاميسين. قد يبدو هذا واضحا ، ولكن من المهم التأكد من أن هذه البكتيريا التي يجرى بحثها هي عرضة للجنتاميسين في درجة الحرارة ، وتركيز وعلى مدى الفترة الزمنية التي يتعين استخدامها. في حالة عدم الاكتراث ، فإنه قد يكون من الممكن استخدام المضادات الحيوية الأخرى 5. ويمكن اتباع نهج بديل يتمثل في استخدام الإنزيمات lytic (lysostaphin ، mutanolysin ، الليزوزيم) 12. حضانة وقيحة. عند تنفيذ هذا الاختبار للمرة الأولى ، من المهم لإنشاء حضانة مرات الأمثل واللقاح الجرثومي لاستخدامه. ولذلك ، ينبغي النظر في التجارب الأولية على حد سواء التصاق والغزو على مر الزمن (5 دقائق ليصل الى 6 ساعات). من المهم أيضا لتقييم مدى تأثر غزو من جانب تعدد العدوى (وزارة الداخلية ، وعدد من البكتيريا في الخلية). عموما فإنه من الأفضل استخدام عدد من البكتيريا بأقل عدد ممكن لأن هذا سيؤدي إلى تقليل الأضرار إلى الخلايا المستزرعة. قد يكون غاب عن اختلافات مهمة بين سلالات إذا فترات حضانة طويلة أو قائح كبيرة تستخدم 9،13. تلف الخلايا ، ومن المهم أن يغسل البكتيريا قبل الاستخدام. ومع ذلك ، لا يقتصر الضرر الخلوي لإنتاج السم. الغزو الجرثومي ، ويمكن استحثاث موت الخلايا المبرمج ، وتعطل الوظائف الخلوية العادية تتسبب جميع الأضرار الخلوية. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تغلغل الجنتاميسين في الخلية ، وقتل البكتيريا المنضوية إعطاء الانطباع بأن الغزو لم يحدث 14. شروط الحضانة. ويمكن لدرجة الحرارة وتكوين ثقافة المتوسطة يكون لها تأثير كبير على الغزو. على سبيل المثال ، والغزو من الخلايا العقدية المقيحة هيلا التي تعتمد على وجود فبرونيكتين القابلة للذوبان ، والتي هي عادة موجودة في المصل 15. وهناك اعتبار آخر هو نمو البكتيريا في مستنبت أثناء التجربة. ثقافة وتقدير من البكتيريا داخل الخلايا. وعلى الرغم TX - 100 قد لا تقتل البكتيريا داخل الخلايا ، فإنه قد تحول دون نموها. على هذا النحو ، فمن المهم للتحقق من النسخ المتماثل على وسائط جرثومية الصلبة في وجود المنظفات. حيث تتأثر ، قد يكون من الممكن استخدام تركيزات أقل من المنظفات أو استخدام بديل مثل سابونين. وهناك فائدة للمقايسة حماية الجنتاميسين على تلطيخ البنفسجي الكريستال والفحص المجهري هو أنه أقل من العمالة المكثفة ، وأنها تسمح للكشف والتمييز بين المجموعات الفرعية من السكان من البكتيريا المنضوية. على سبيل المثال ، S. يمكن أن تنتج إما المذهبة نوع مستعمرة العادي (NCT) أو المتغير مستعمرة صغيرة (SCV) 16 ، والتي لن تكون مميزة من خلال الفحص المجهري للخلايا بكتيرية الفردية. وهناك فائدة من تلطيخ البنفسجي الكريستال والفحص المجهري على مقايسة حماية الجنتاميسين هو يمكن شكلت خلية للتكتل وأن البكتيريا التي تدخل الخلايا &quot;قابلة للحياة ولكن غير زروع&quot; وسيتم الكشف عن 17 حالة. دراسة دور عمليات الخلية المضيفة في الغزو الجرثومي. استخدمت العديد من الدراسات مثبطات وظيفة الخلايا المضيفة مثل D مثبط حركة الخلايا ، والتي تتعارض مع إعادة ترتيب أكتين. مثل هذه الدراسات يمكن أن تشمل أيضا الأجسام المضادة التي تستهدف مستقبلات سطح الخلية وضربة قاضية للجينات محددة سيرنا 18. من المهم جدا للتأكد من أن هذه العلاجات لا تؤثر على صلاحية أو مرفق من الخلايا المستنبتة أو تكون لها آثار سامة على البكتيريا. التوجهات المستقبلية : ontent &quot;&gt; لأنه يتم عادة إجراء هذا الاختبار في لوحات متعددة جيدا ثقافة الخلية ، فمن الممكن نظريا لتكييفه مع عملية الفرز الفائق الإنتاجية ، والتي قد تنطوي على دراسة المكتبات وظيفة الخلية مثبطات المحتملة ، ومكافحة العدوى أو المضادات الحيوية صممت لاستهداف البكتيريا داخل الخلايا. كبديل ، يمكن أن تستخدم مثل هذا النهج إلى الشاشة متحولة المكتبات لتحديد الجينات المسؤولة عن الالتصاق ، والغزو ، أو البقاء داخل الخلايا ، وفي بعض الحالات قد يكون من المرغوب فيه لتشمل قوى القص (التدفق) في النظام النموذجي ، على سبيل المثال عندما النمذجة البطانة ، على نحو أوثق محاكاة البيئة في الجسم الحي. التقدم الحالي في مجال تصميم وتصنيع الخلايا التدفق ونظم ميكروفلويديك خلية ثقافة توفر إمكانية توظيف مقايسة الجنتاميسين في حماية المضيف الممرض النماذج التي تضم قوى القص. باختصار ، يقوم بروتوكول الموصوفة هنا على النهج المماثلة المستخدمة على مدى سنوات عديدة. فمن على نطاق واسع ينطبق على العديد من أنواع الخلايا المستزرعة ، والأنواع البكتيرية ويمكن أن تولد كميات كبيرة من البيانات بسرعة وبتكلفة قليلة نسبيا.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>منقوع قلب ودماغ</td><td>BioChemika</td><td>53286</td><td></td></tr><tr><td>مصل بقري جـ&amp;#8211;نـي</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2519</td><td></td></tr><tr><td>وسط أساسي للخلايا البطانية</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3121</td><td></td></tr><tr><td>مستخلص دماغ بقري (يتضمن الهيبارين)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092</td><td></td></tr><tr><td>عامل نمو بطاني بشري</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4017C</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكورتيزون</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4035C</td><td></td></tr><tr><td>GA-1000</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-4092C</td><td></td></tr><tr><td>جنتاميسين</td><td>Invitrogen</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ليسوستافين</td><td>AMBI</td><td>LSPN-50</td><td></td></tr><tr><td>أغطية شرائح Thermanox</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TKT-210-330P</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Cytopath</td><td>TCS Biosciences</td><td>HC8595</td><td></td></tr><tr><td>بنفسجي كريستالي</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>دوارق T75</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>سيتوكالاسين D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2618</td><td></td></tr><tr><td>ميثيل-B-سيكلوديكسترين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>332615</td><td></td></tr></tbody></table>

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

هنا سنقوم بشرح كيف ندرس غزو الخلايا البطانية الإنسان عن طريق البكتيريا العنقودية الذهبية الممرض. ويمكن تطبيق بروتوكول عام لدراسة الغزو خلية بكتيريا أي تقريبا زروع. وسيتم تسليط الضوء على المراحل التي يمكن أن تدرس جوانب محددة من الغزو ، مثل إعادة ترتيب دور الأكتين أو caveolae. تزرع الخلايا المضيفة في قوارير والمصنف عندما جاهزة للاستخدام في 24 لوحات تحتوي كذلك coverslips Thermanox. يسمح باستخدام coverslips اللاحقة إزالة الخلايا من الآبار للحد من التدخل من بروتينات مصل المودعة على الجانبين من الآبار (S. المذهبة التي سوف نعلق). تزرع البكتيريا إلى الكثافة المطلوبة وغسلها لإزالة أي تفرز بروتينات (مثل السموم). يتم نقل Coverslips مع طبقات من الخلايا البطانية متكدسة لوحات 24 بئر جديدة طازجة تحتوي على مستنبت قبل إضافة البكتيريا. ثم يتم تحضين الجراثيم والخلايا معا من أجل المبلغ المطلوب من الوقت في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. لS. المكورات هذا هو عادة بين 15-90 دقيقة. تتم إزالة coverslips Thermanox من كل بئر وتراجع غسلها في برنامج تلفزيوني لإزالة البكتيريا غير مرتبط. إذا كان مجموع البكتيريا المقترنة (ملتصقة والمنضوية) هي أن يكون كميا ، ثم توضع في بئر coverslips الطازجة التي تحتوي على تريتون 0.5 ٪ X - 100 في برنامج تلفزيوني. pipetting طيف يؤدي إلى تحلل الخلايا وإكمال يتم تعداد البكتيريا عن طريق التخفيف المتسلسل والطلاء على أجار. اذا كانت هناك حاجة لعدد من البكتيريا التي قد غزت الخلايا ، تضاف إلى coverslips الآبار تحتوي على 500 زراعة الأنسجة ميكرولتر المتوسطة تستكمل مع الجنتاميسين وحضانة استمرت لمدة 1 ساعة ، والتي سوف تقتل كل البكتيريا الخارجية. lysed الخلايا يمكن أن تكون ثم Coverslips غسلها ، والبكتيريا التي تم تعدادها على الطلاء أغار على النحو المبين أعلاه. إذا كانت التجربة يتطلب رؤية مباشرة ، يمكن ان تكون ثابتة وcoverslips ملطخة المجهري للضوء ، أو مضان مبائر أو معدة للفحص المجهري الإلكترون.

بروتوكول عام لدراسة غزو الخلايا المضيفة من قبل الممرض الجرثومي ، مع التركيز على<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; والخلايا البطانية الإنسان.

سنقوم هنا بوصف كيفية دراسة غزو الممرض البكتيري Staphylococcus aureus للخلايا البطانية البشرية. ويمكن أن يكون البروتوكول العام...

الهدف العام من هذه التجربة هو قياس قدرة السلالات البكتيرية على غزو الخلايا المضيفة. تُنقل الخلايا المضيفة في المزرعة إلى شرائح غطاء زجاجية في طبق يحتوي على 24 بئراً، وتُحضن حتى تصل إلى مرحلة التلاقي (confluency). بعد ذلك، تُغسل شرائح الغطاء وتُنقل إلى طبق جديد.يتم غسل البكتيريا التي تم جمعها من مزرعة مرق قياسية عن طريق الطرد المركزي، ثم تُضاف إلى مزرعة الخلايا المضيفة. وبمجرد حدوث الغزو، تُقتل البكتيريا الموجودة خارج الخلايا باستخدام Gentamycin، ثم تُغسل الشرائح الزجاجية الرقيقة وتُنقل إلى طبق جديد. وفي الختام، يتم تحلل الخلايا المضيفة وزرع نواتج التحلل على أطباق الآجار لتحديد عدد البكتيريا داخل الخلايا.وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج توضح القدرة الغزوية لبكتيريا معينة. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة عن أسئلة رئيسية في مجال الإمراض الميكروبي، مثل كيفية تسبب الغزو البكتيري لخلايا المضيف في حدوث المرض. كما يمكنها تسهيل تحديد وتوصيف البروتينات البكتيرية المشاركة في التفاعلات بين المضيف والممرض.سيقوم الدكتور Andrew Edwards، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من أحد المختبرات، بشرح هذا الإجراء. نستخدم في هذا المقايسة خلايا بطانية بشرية EAHY 9 26 مستزرعة في دوارق T 75 عند درجة حرارة 37 °C. يتم حصاد الخلايا بمجرد وصولها إلى حوالي 95% من درجة التلاقي.اغسل الخلايا بـ 10 milliliters من PBS لإزالة وسط النمو. قم بفصل الخلايا عن طريق التحضين في محلول trypsin EDTA لمدة خمس دقائق. ثم انقلها إلى أنبوب chronicle.بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً وأعد تعليقها في حوالي 25 milliliters من وسط DMEM الكامل أو بتركيز مليون خلية لكل milliliter باستخدام ملاقط معقمة. ضع شريحة غطاء حرارية في كل بئر من أطباق زراعة الأنسجة ذات الـ 24 بئراً. تأكد من وضع الجانب المعتم من شريحة الغطاء، وهو الجانب الذي يمكن للخلايا الالتصاق به، بحيث يكون موجهاً للأعلى.بعد ذلك، أضف 500 µL من الخلايا إلى كل بئر واحضن الطبق عند 37 °C لمدة 48 ساعة أو حتى تصل الخلايا إلى درجة الالتحام. بعد فترة الحضن، استخدم ملاقط نظيفة لإزالة كل شريحة غطاء بعناية وغطسها في DMEM لإزالة البروتينات المفرزة الذائبة. انقل شرائح الغطاء المغسولة إلى آبار فردية في طبق 24 بئر جديد يحتوي كل بئر منه على 490 µL من DMEM الكامل.مع الحرص على الحفاظ على اتجاه شرائح التغطية بحيث تكون الخلايا متجهة للأعلى. قم بتحضير مزرعة بحجم 10 milliliter من بكتيريا staphylococcus aureus في مرق تغذية الدماغ والقلب (brain heart infusion broth). انقل المزرعة البكتيرية إلى أنبوب مخروطي وقم بطرد البكتيريا مركزياً بقوة 5,000 ×g لمدة 10 minutes.بمجرد تجميع الخلايا في صورة ركازة، قم بإزالة السائل الطافي وإعادة تعليق الركازة في 10 milliliters من وسط DMEM المعقم لغسل الخلايا، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى وكرر عملية الغسل ثلاث مرات. أعد تعليق البكتيريا في وسط DMEM وقم بقياس الكثافة الضوئية للمعلّق.قم بتعديل التركيز للحصول على كثافة بصرية (OD 600) تبلغ 1.0، وهو ما يعادل تقريبًا 10⁹ وحدة تشكيل مستعمرة لكل مللي لتر. بمجرد تحضير المعلق البكتيري، أضف 10 µL من البكتيريا إلى كل بئر من آبار الطبق المكون من 24 بئرًا والذي يحتوي على شرائح التغطية.يُحضن الطبق عند 37 degrees Celsius لمدة تتراوح من 15 إلى 90 دقيقة للسماح للبكتيريا بالالتصاق بالخلايا وغزوها. بعد هذه الحضنة، يتم سحب السائل الطافي من كل بئر يحتوي على البكتيريا غير المرتبطة واستبداله بـ 10%F-B-S-D-M-E-M مُدعم بـ Gentamycin. ثم يُحضن الطبق عند 37 degrees Celsius لمدة 60 دقيقة لقتل البكتيريا الموجودة خارج الخلايا.بعد انتهاء فترة الحضن هذه، اغسل كل شريحة غطاء ثلاث مرات باستخدام وسط DMEM لإزالة المضاد الحيوي. ثم انقلها إلى طبق جديد يحتوي على 24 بئراً، بحيث يحتوي كل بئر على 500 microliters من Triton X 100 بتركيز 0.5% في PBS.كما سلف، احرص على إبقاء الجانب المغطى من الخلية متجهاً للأعلى، واغسل كل شريحة غطاء بقوة باستخدام محلول Triton عن طريق سحب السائل في البئر ودَفعه للأعلى وللأسفل مباشرة فوق شريحة الغطاء، وذلك لضمان تحلل جميع الخلايا وتحرر البكتيريا الموجودة داخلها. قم بإجراء تخفيفات متسلسلة للمحلل لتقدير عدد البكتيريا المعدية. اجمع المحلل وازرع التخفيفات المتسلسلة على أطباق TSA.يمكن تحديد وحدات تكوين المستعمرات على هذه الأطباق بعد 24 ساعة من الحضن عند 37 درجة مئوية. يوضح هذا الرسم البياني عدد بكتيريا Staphylococcus aureus من النوع البري أو تلك التي تعاني من نقص في البروتين الرابط للفبرينوجين والتي تغزو الخلايا البطانية البشرية مقارنة بالبكتيريا من النوع البري. تعاني بكتيريا Staphylococcus aureus التي تفتقر إلى البروتين الرابط للفبرونكتين من ضعف ملحوظ في قدرتها على غزو الخلايا البطانية.لم يؤدِ استكمال الطفرة باستخدام بلازميد يشفر بروتين ربط الفبرونكتين، ناقص نطاق ربط الفبرونكتين، إلى تعزيز الغزو. وفي المقابل، أدى استكمال الطفرة باستخدام بلازميد يشفر بروتين ربط الفبرونكتين كاملاً إلى استعادة الغزو لمستويات النوع البري. وفي هذه التجربة، تبيّن أن بكتيريا lactococcus Lactus التي تعبر عن بروتين ربط الفبرونكتين قادرة على غزو الخلايا المضيفة.وبينما لم تكن البكتيريا التي لا تعبر عن البروتين قادرة على الالتصاق بالخلايا، كانت القدرة على الالتصاق متساوية لكلا السلالتين. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاث ساعات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير البكتيريا والخلايا المضيفة لدراسة غزو الخلايا.يجب أن تكون قادراً أيضاً على تحديد المراحل التي يمكن طرح أسئلة إضافية حولها لزيادة فهمك لهذا الجانب من المرض.

invasion-of-human-cells-by-a-bacterial-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

يوضح هذا الفيديو تقنية لتقييم قدرة Porphyromonas gingivalis ، وهي بكتيريا مسببة للأمراض اللاهوائية ، على الالتصاق بالخلايا البطانية للأوردة السرية البشرية (HUVECs) وغزوها. بعد إصابة الخلايا المضيفة بالبكتيريا ، يتم تحلل الخلايا المضيفة لإطلاق كل من البكتيريا الملتصقة والداخلية عندما يتم طلاء المحللة في وسط مناسب ، فإن وجود المستعمرات يشير إلى تفاعلات الخلايا المضيفة البكتيرية الناجحة.

مقايسة العدوى البكتيرية لدراسة تفاعلات البكتيريا اللاهوائية بين الخلايا المضيفة

أداء المقايسات ثقافة الخلية عن التحقيق في التصاق البكتيريا وغزو تحت الظروف الهوائية عادة ما يكون غير ممثل...

الغزو الجرثومي المعوي الخلايا الظهارية المعوية<em&gt; في المختبر</em&gt; تتعزز بشكل كبير عن طريق دائرة إنتشار عمودي الموديل

المستوحدة الليستيريا هو الممرض الجرثومي موجبة الجرام كثيرا ما تستخدم كنموذج رئيسي لدراسة التطفل داخل الخلايا. التصوير أواخر L. المستوحدة مراحل العدوى في سياق شاشات الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة يسمح للدراسة عالمية من مسارات الخلوية اللازمة لعدوى بكتيرية من الخلايا المضيفة الهدف.

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em

الليستيريا monocytogenes يسبب التهابات الجنين في النساء الحوامل والتهاب السحايا في السكان المعرضين.  يمكن أن تستعمر الاكتظاظ السكاني الفرعي للبكتيريا أنسجة القلب ، مما يسبب التهاب عضلة القلب في المرضى المختبر.  هنا نقدم بروتوكولا يصف كيفية تقييم L. monocytogenes غزو الخلايا القلبية في المختبر والاستعمار القلبي في الحيوانات المصابة.

تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا

هنا يرد بروتوكول لقياس التقاط البكتيريا عن طريق خلايا CD4 + T التي تحدث أثناء تقديم المستضد عبر transinfection من الخلايا الجذعية المصابة مسبقا (DC). وتبين لنا كيفية تنفيذ الخطوات الضرورية: عزل الخلايا الأولية، وإصابة DC، DC / T تشكيل المترافقة الخلية، وقياس البكتيرية ترنسفكأيشن الخلايا التائية.

T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية

&lt; p class = 'jove_content'&gt;تشكل الخلايا الظهارية للضفيرة المشيمية (CP) حاجز السائل الدموي النخاعي (BCSFB). يستخدم نموذج المختبر ل BCSFB خلايا الورم الحليمي المشيمي البشري (HIBCPP). توضح هذه المقالة الاستزراع والعدوى القاعدية لخلايا HIBCPP باستخدام نظام إدخال مرشح ثقافة الخلايا.

نموذج قائم على خلية المشيمية الضفيرة طلائي من الجدار السائل الإنسان الدم النخاعي لدراسة العدوى البكتيرية من الجانب Basolateral

ونحن تصف كلا فحوصات الإصابة في المختبر وفي الحية التي يمكن استخدامها لتحليل أنشطة العوامل المضيفة-ترميز.

استخدام مسببات الأمراض بكتيرية للتحقيق لاستجابات المضيف الخلوية ومستوى أورجانيسميك

تقدم الدراسة طريقة للتحقيق في المختبر للعدوى البكتيرية باستخدام عضويات معوية مشتقة من الخلايا الجذعية في الأنسجة. يصف البروتوكول كيفية زراعة وتمييز الأعضاء في بعدين، وإصابتها بفيروس الإشريكية القولونية الغازي الملحق، وتقييم القراءات الرئيسية، بما في ذلك اختراق الحاجز الطلائي، وتصوير العدوى، واستجابة الحمض النووي الريبي الظهاري.

زراعة عضوية ثنائية الأبعاد على مستخلص الغشاء الغازي أو القاعدة لدراسة التفاعلات بين المضيف والبكتيريا

الخلايا M في ظهارة جريب المرتبطة المتخصصة التي تغطي بقع باير لتلعب دورا هاما لالترصد المناعي المخاطي في الأمعاء المرتبطة الأنسجة اللمفاوية. نحن هنا وصف طريقة لتقييم من قبل خلايا جرثومية transcytosis...

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

وwormsorter يسهل شاشات الوراثية في انواع معينة ايليجانس عن طريق الفرز الديدان وفقا لتعبير عن صحفيين الفلورسنت. هنا، نحن تصف استخدام جديدة: الفرز وفقا لاستعمار من قبل الممرض، معربا عن GFP، ونحن نوظف ذلك لدراسة دور غير مفهومة الاعتراف الممرض في الشروع في الاستجابات المناعية.

الفصل الآلي لل<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; المستعمرة بنسب مختلفة من قبل الممرض الجرثومي

تعلم قياس قدرة سلالات Staphylococcus aureus على غزو الخلايا البشرية باستخدام بروتوكول دقيق. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات التفاعل بين المضيف والممرض وتطوير استراتيجيات علاجية محتملة.

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

استكشف المزيد من الفيديوهات

غزو الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي