في Axotomy الليزر المجراة في C. ايليجانس

الهدف العام من هذا الإجراء هو قطع عصبونات CL في ديدان C. elegans بدقة باستخدام الليزر في الجسم الحي (in vivo). ويتحقق ذلك من خلال تجميع نظام قطع المحاور العصبية (axotomy system)، والتركيز الدقيق لليزر، ومحاذاته، وضبط قدرته. وعند تثبيت الديدان على شريحة مجهرية، يمكن قطع عصبوناتها بتحكم دقيق مكانيًا وزمانيًا.

يتم بعد ذلك قياس مدى تجدد العصبونات المقطوعة من خلال تسجيل عدد مخاريط النمو و/أو تتبع أطوال الزوائد العصبية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل ليزر الفيمتو ثانية، في أن ليزر النبضات النقطية الدقيقة يمثل نظاماً فعالاً من حيث التكلفة، وسهل الإعداد والصيانة، وقابلاً للتكيف بسهولة مع مجموعة واسعة من التطبيقات، رغم أننا نطبق هذه الطريقة عادةً لدراسة تجدد العصبونات الحركية GABA. كما يمكن استخدام النظام لاستئصال أنواع أخرى من الخلايا مثل خلايا الجلد أو العضلات، أو مشابك عصبونية محددة.

تتطلب هذه الطريقة نظام ليزر دقيق النقطة (micro point laser system). يُثبت الليزر في منفذ الفلورة فوق البؤرية (epi fluorescence port) لمجهر مركب، ويتضمن مرشحاً ثنائي اللون (dichroic) واحداً يتوافق مع الفلوروفور الموجود في الخلايا المراد قطعها، ومولداً للنبضات، ودواسة قدم لتشغيل الليزر. وبحد أدنى، يجب أن يكون المجهر مجهزاً بعدسة شيئية زيتية بقوة تكبير 100 مرة وفتحة عددية 1.4 NA، وعدسة شيئية بقوة تكبير 4 مرات.

استخدم منصة آلية تعمل بجهاز تحكم (joystick) وتكون مثبتة على طاولة هوائية للإضاءة. يتم توصيل مصدر ضوئي مزود بدليل ضوئي وآلية غالق بليزر النقطة الدقيقة. وتفيد آلية الغالق في تقليل كثافة الإضاءة بشكل مستقل عن الليزر.

تتطلب الكاميرا المتصلة بجهاز الكمبيوتر معدل إطارات لا يقل عن 16 hertz ويجب أن تعمل بكفاءة في ظروف الإضاءة المنخفضة. كما يتطلب جهاز الكمبيوتر برنامج تصوير مثل Nikon elements لعرض العصبونات، وتشغيل الكاميرا، والتحكم في المنصة الآلية. وبمجرد اكتمال التجميع، يمكن للمستخدم ضبط بؤرة المجهر بيد واحدة، وتحريك المنصة باليد الأخرى، وتنشيط الليزر باستخدام دواسة القدم، مع الحصول على رؤية واضحة للصورة المعروضة على الشاشة.

يمكن أن يكون قطع العصبونات في كائن بحجم حبة رمل أمراً صعباً. ولتحقيق ذلك، يجب تركيز الليزر بدقة في جميع الأبعاد الثلاثة. ابدأ بتركيز المستوى Z.

قم بدفع مرشح الكثافة المحايدة ND 16 لتخفيف شدة الليزر أثناء التركيز من أجل الحصول على تركيز أدق، مع دفع كل من ND 16 ومرشحات الفلورية ND four. بعد ذلك، اضبط ليزر النقطة الدقيقة (micro point laser) على نبضة واحدة باستخدام مفتاح الاختيار، ثم حرك عجلة المرشحات إلى مرشح حاجز تمرير طويل (long pass barrier filter) المناسب. الآن، ضع شريحة مرآتية على المنصة وقم بالتركيز على الثقوب الدقيقة (pinholes) الموجودة بها باستخدام الشيئية 4x والضوء النافذ.

بمجرد ضبط التركيز، أضف قطرة من زيت الغمر إلى الشريحة وأعد ضبط التركيز على الثقوب الدقيقة باستخدام العدسة الشيئية بقوة 100 مرة. ثم استخدم رافعة تحويل المسار البصري لفتح غالق الكاميرا وفتح غالق الليزر. إذا كان من الصعب الحصول على تركيز دقيق، فقم بتقليل كثافة الضوء النافذ لتصبح حواف الثقب الدقيق حادة.

لاختبار البؤرة، استخدم دواسة القدم لتشغيل الليزر. إذا كان المستوى Z مضبوط البؤرة بشكل صحيح، فيجب أن تظهر ثقبة صغيرة في المرآة. الآن، اضبط بؤرة المجهر بحيث تكون أعلى قليلاً من مستوى الشريحة المرآتية، ثم قم بتشغيل الليزر مرة أخرى.

يؤدي ذلك إلى إحداث ثقب أصغر من الثقب الناتج عن الطلقة الأولى، أو قد لا يترك أي أثر على الإطلاق. وينبغي ملاحظة النتائج ذاتها عند التركيز أسفل الشريحة العاكسة. ومع ذلك، إذا نتج ثقب أكبر، فيجب إعادة تركيز الليزر باستخدام حلقة التركيز الموجودة في رأس الاستئصال.

أخيراً، تحقق من أن الثقب لا يزال محاذياً بشكل صحيح لخطوط التقاطع في العدسة العينية. ومع الاستخدام المستمر، نادراً ما يحتاج تركيز المستوى Z إلى ضبط. لتركيز الليزر في المستوى XY، قم بعمل ثقب آخر في المرآة، ثم انتقل إلى البرنامج في Nikon elements.

قم بتفعيل وضع الالتقاط المباشر من قائمة الاستحواذ. في شريط أدوات القياس، اختر محرر منطقة الاهتمام (ROI editor)، ثم حدد أداة التقاطع المزدوج واسحب خطوط التقاطع لمحاذاتها مع مركز الثقب الجديد. انقر فوق حفظ منطقة الاهتمام (save ROI) ثم اخرج من المحرر لاستئناف الالتقاط المباشر.

للتحكم في المنصة باستخدام الماوس، قم بتنشيط إعداد الماوس XY. الآن أصبح الليزر مركزاً. أعد مرشحات الكثافة المحايدة إلى وضعها الأصلي، واضبط نبضات الليزر من 1 إلى 10 للاستخدام المستقبلي.

أولاً، قم بتحضير محلول من aros المنصهر بتركيز 3% في محلول M nine، وانقل حوالي five milliliters إلى أنبوب سعة 50 milliliter. ضع الأنبوب في حمام مائي درجة حرارته من 55 إلى 65 درجة Celsius، واحفظ الكمية المتبقية للاستخدام المستقبلي. الآن، استخدم شريحتين مغطاتين بملصقات تعريفية.

قم بلصق زوج من الشرائح النظيفة وضع قطرة من الأجاروز لتكوين وسادة يمكن وضع الديدان عليها. بعد مرور 30 ثانية، سيتجمد الأجاروز؛ عندها استخدم الماصة لوضع من 3 إلى 5 µL من حبيبات البوليسترين بحجم 0.05 إلى 0.1 µm على الوسادة. وفي غضون 10 دقائق، قم بترتيب من 5 إلى 10 ديدان معدلة وراثياً بسرعة فوق الحبيبات باستخدام ملقط بلاتيني، بحيث يمكن رؤية العصبونات المحددة بوضوح. ولتجنب إتلاف الديدان، ضع غطاء شريحة قياسي بعناية فوق الديدان.

تحريك الشريحة. أصبحت شريحة الديدان الآن جاهزة لإجراء التصنيفات. باستخدام العدسة العينية، حدد موقع الديدان تحت تكبير 4 مرات، ثم أعد التركيز باستخدام العدسة الشيئية ذات التكبير 100 مرة، وأوقف تشغيل الضوء النافذ، وقم بتشغيل الفلورية وتحويل المسار البصري إلى الكاميرا.

استخدم الفأرة لتركيز العصبون عند تقاطع خطوط التصويب. الآن، قم بتشغيل الليزر باستخدام دواسة القدم. ستؤدي كمية طاقة الليزر المناسبة إلى قطع العصبون في نبضة واحدة أو نبضتين.

ستؤدي قوة الليزر المفرطة إلى حدوث تلف محيطي أو إحداث ثقب في الدودة؛ ولضبط قوة الليزر، قم بتحريك صفيحة الموهن. وفي حال ضعف الليزر، يمكن ضبط موضع صفيحة الموهن لمواصلة القطع. ومع ذلك، فمن المرجح أن يكون هذا مؤشراً على ضرورة استبدال Kumar في four 40 في خلية D الخاصة بالليزر عند التنفيذ بشكل صحيح.

يؤدي القطع الليزري (Laser taxotomy) إلى إحداث قطع صغير في العصبون. وفي حالات معينة، قد تتكون ندبة صغيرة حول موقع الإصابة. من الناحية العملية، يتم قطع ما بين عصبون واحد إلى ثلاثة عصبونات لكل حيوان، ولكن لا يوجد حد نظري لذلك.

عند الانتهاء، استعد الديدان عن طريق إزالة غطاء الشريحة بحركة مباشرة نحو الأعلى، مع الحرص على بقاء الديدان على وسادة أغار الروز (agro rose pad). لا تقم بسحب غطاء الشريحة انزلاقياً. استخدم ملقطاً مدبباً لقص الوسادة من حول الديدان.

ضع الوسادة على طبق NGM حديث الزرع يحتوي على OP 50، وحرر الديدان باستخدام 10 µL من محلول M9 المعقم. يمكن تقييم التجدد في فترة تتراوح بين 8 و 48 ساعة بعد عملية استئصال الطرف (ex otomy)؛ وللقيام بذلك، أعد تثبيت الديدان السليمة على 3 إلى 5 µL من حبيبات البوليسترين، وقم بتصوير عصبوناتها في العصبونات المقطوعة. سيظل هناك جذع عصبي بعيد عن موقع القطع. يتراجع كل من الجذعين البعيد والقريب في البداية بعد القطع، ولكن من المتوقع حدوث التجدد من الجذع القريب.

يمكن تقييم التجدد من خلال رصد تكوين مخروط النمو. وبدلاً من ذلك، يمكن تتبع طول الزوائد العصبية ومقارنتها؛ وعادةً ما تشكل 60 إلى 70% من عصبونات GABA مخاريط نمو خلال 24 ساعة من قطعها. وإذا لم يكن الليزر يقطع بشكل صحيح، فمن المرجح أن يكون ذلك إما بسبب عدم ضبط تركيز الليزر أو بسبب حاجة الصبغة في خلية الصبغة إلى الاستبدال.

علاوة على ذلك، إذا لاحظت تحرك الديدان، فمن المرجح أن تكون وسادة agros رطبة للغاية. وقد وجدنا أنه من الضروري ترك الوسادات لمدة 30 ثانية تقريباً قبل وضع الديدان عليها لتفادي هذه المشكلة. بالإضافة إلى ذلك، يمكنك تجربة استخدام حبيبات مجهرية (microbeads) بحجم أصغر لتثبيت الديدان.

أخيرًا، إذا وجدت أن المحاور العصبية تظهر بمظهر حبيبي، فمن المرجح أن يكون ذلك بسبب جفاف وسادة الأجار بشكل زائد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد نظام ليزر النقطة الدقيقة، وكيفية تثبيت الديدان لإجراء عملية القطع العصبوني، وقطع عصبونات فردية، وتقييم التجدد اللاحق.