يعيش التصوير الكالسيوم الخلية المشتركة مع وساطة سيرنا إسكات الجينات يحدد كا ^{2 +} قنوات تسرب في غشاء ER وآلياتها التنظيمية

في خلايا الثدييات ، تلعب الشبكة الإندوبلازمية أو ER دورا مهما في التكوين الحيوي للبروتين وإشارات الكالسيوم. يوفر مركب الجنس غير المتجانس 61 في غشاء ER مسارا مائيا لعديد الببتيدات المركبة حديثا في تجويف ER. تشير البيانات الحديثة إلى أن الجنس 61 قد يشكل أيضا قنوات تسرب كالسيوم عابرة لمعالجة دور مركب Sex 61 بشكل مباشر كقناة محتملة لتسرب الكالسيوم.

ولتوصيف آلياته التنظيمية المفترضة ، يتم التعامل مع الخلايا أولا باستخدام siRNAs الموجهة ضد الجنس 61 A جين واحد. في تحليل التكميل ، يتم نقل الخلايا بناقل قزحية GFP يسمح بالتعبير المقاوم ل irna للجنس من النوع البري 61 A جين واحد. ثم يتم تحميل الخلايا بمؤشر الكالسيوم المتري RO الثاني ويتم مراقبة التغيرات في تركيز الكالسيوم العصاري الخلوي عن طريق المجهر الفلوري.

عندما يتم قياس مستويات الكالسيوم ، يتم إجراء تغييرات في المحلول لتقييم تأثير العوامل المختلفة مثل مضادات الكالمودولين والأرجون على تسرب الكالسيوم. يكشف التحليل الكمي للصور الناتجة عن التغيرات في تدفق الكالسيوم F الناجم عن إسكات الجنس 61 A واحد. في هذا الفيديو ، سيتم تقديم نموذج لدور الجنس 61 A واحد في تدفق الكالسيوم F بعد عرض الإجراء وعرض النتائج.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل التجارب الحيوية لدهون الكوكب ، أو قياسات القناة الواحدة هي أنه يمكن تحليل بروتينات الغشاء المرشحة في البيئة الأصلية وبدون تنقية مملة وإعادة تشكيل وظيفية غير فعالة عادة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إشارات الكالسيوم ، مثل ، على سبيل المثال ، ما هي مساهمة بروتينات غشاء ER معينة في الكالسيوم ffl من ER في أنواع الخلايا المختلفة وكيف يتم التحكم فيها؟ سيكون عرض الإجراء طويلا واثنين من طلاب الدراسات العليا الموهوبين من مختبراتنا ابدأ هذا الإجراء بإعداد المحاليل والكواشف المراد استخدامها أولا ، قم بإعداد مخزن مؤقت خال من الكالسيوم وفقا للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب المصاحب.

اتصل بعد ذلك ، قم بتخفيف محلول مخزون مؤشر الكالسيوم. يموت في الساعة 2:00 صباحا في مليلتر واحد من DMEM يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين إلى تركيز نهائي من أربعة ميكرومولار يخفف من محلول مخزون أبسو جارين بمقدار واحد ملليمولار في مخزن مؤقت خال من الكالسيوم إلى تركيز نهائي يبلغ ثلاثة ميكرومولار يحتوي أيضا على 200 ميكرومولار أولين أ و 20 ميكرومولار لتقليل مخاطر دراسة التأثيرات غير المستهدفة لإيرنا معين. يتم استخدام اثنين من irna المختلفين لإسكات كل جين لتقييم الآثار الجانبية المحتملة لإجراء التعدين.

siRNAs للتحكم السلبي ، والتي تتكون من تسلسل عشوائي من النيوكليوتيدات بالتوازي مع siRNAs التجريبية. من المهم أن يتم إنقاذ تأثير الإسكات بوساطة irna عن طريق التعبير عن النوع البري CD NA. لذلك ، يتم اختيار siRNAs المستخدمة في التجربة على وجه التحديد بحيث لا يتأثر بلازميد الإنقاذ ب siRNAs. في هذه التجربة ، يتم توجيه siRNAs ضد كل من منطقة الطلاء وغير المطلية أو المنطقة غير المترجمة ، وهي اختصار UTR للجين محل الاهتمام.

عندما يتم توجيه siRNAs ضد إنقاذ UTR ، يمكن استخدام البلازميدات التي لا تحتوي على UTR الداخلي لأداء transfect في خلايا hela. قم بإعداد الخلايا للتعداء عن طريق وضع زلة غطاء مطلية بالبوليول ليسين 25 ملم في طبق ثقافة خلية واحد يبلغ طوله ستة سنتيمترات لكل تعداء بعد ساعة واحدة ، وأضف 5.2 أضعاف 10 إلى خلايا hela الخامسة واستكمل DMEM لكل طبق. لنقل الخلايا ، قم بتسمية أنبوب طرد مركزي صغير واحد.

لكل تفاعل تعدي لكل أنبوب ، أضف أربعة ميكرولترات من 20 ميكرومولار S irna مذابة في 80 ميكرولتر من الأمثل هنا ، SEC 61 A واحد ، الجنس 61 A UTR واحد والتحكم السلبي irna يتم تحضيرها لكل أنبوب. أضف 20 ميكرولترا من كاشف التعداء المثالي المفرط بلطف ، ثم احتضن التفاعلات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. لنقل الخلايا ، أضف مزيج irna 104 ميكرولتر إجمالا بالتنقيط إلى خلايا طائرات الهليكوبتر الجالسة وقم بتدوير الطبق برفق لضمان التوزيع المنتظم لمجمعات التعدين.

تحتضن 37 درجة مئوية في بيئة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط ب 3.9 مل من الوسط الطازج. ثم لزيادة كفاءة التعدي ، قم بإجراء التعدي مرة ثانية ، باستخدام نفس مزيج irna لتقييم الإسكات ، وإجراء تحليل اللطخة الغربية.

يجب أن يكون الإسكات أعلى من 80٪ كما هو موضح هنا لممارسة الجنس 61 أ واحد. عادة ما يظهر الحد الأقصى لتأثير الإسكات بعد 96 ساعة من التعدي الأول ، بعد 48 ساعة من التعدي الأول الذي تم إعداده لإنقاذ النمط الظاهري الناتج عن الجنس. 61 يبدأ إسكات الأصوات بوضع ملصقات على أنبوب طرد مركزي صغير جديد.

لكل تفاعل ، سيتم الآن نقل الخلايا إما بناقل فارغ أو جنس من النوع البري. 61 بلازميد تعبير واحد. تم إنشاء البلازميد للتعبير عن النوع البري المستخدم هنا عن طريق إدخال الجنس 61 A (cDNA) واحد في موقع الاستنساخ المتعدد ل pcd.

ناقل GFP داخلي ثلاثي الريبوسومات يحتوي على محفز الفيروس المضخم للخلايا ، القزحية بالإضافة إلى تسلسل طلاء البروتين الفلوري الأخضر. قم بإعداد كاشف التعدي عن طريق إضافة أربعة ميكروغرامات من كل بلازميد مذاب في 80 ميكرولتر من الأمثل لكل أنبوب. ثم أضف إلى ذلك 16 ميكرولترا من كاشف التعداء عالي الدقة الجيني FU ، وقم بدوامة هذا المحلول بلطف واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

ثم بعد تبادل الوسط ، أضف مزيج البلازميد بالتنقيط إلى الجلوس 5.2 مرات 10 إلى خلايا الهليكوبتر الخامسة وقم بتدوير الطبق برفق لضمان التوزيع المنتظم لمجمعات التعدي. ضع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون واحتضانها لمدة 48 ساعة أخرى. لتحديد كفاءة التعدي ، قم بتقييم تعبير GFP عن طريق المجهر الفلوري.

بعد 48 ساعة ، يجب نقل 80٪ على الأقل من الخلايا. قبل التصوير. استخدم الملقط لنقل زلات الغطاء مع خلايا hela المنقولة إلى طبق ثقافة خلية جديد يبلغ طوله 3.5 سم وأضف ملليلترا واحدا من DMEM بأربعة ميكرومولار.

إذا كنت في الساعة 2:00 صباحا ، فقم باحتضانها لمدة 45 دقيقة عند 25 درجة مئوية في الظلام. لإجراء التصوير ، انقل زلة الغطاء مع عدد أقل من خليتين محملتين إلى غرفة تسجيل معدنية وقم بتثبيتها في مكانها عن طريق شد جزأين من الغرفة معا. باستخدام ماصة ، أضف وقم بإزالة 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت الخالي من الكالسيوم إلى الخلايا لغسلها.

كرر ثم قم بتركيب غرفة التسجيل على مجهر I MIC باستخدام محرقة متعددة الألوان. باستخدام مجموعة مرشح ل URA two ، ابحث عن حقل يحتوي على 20 خلية على الأقل لتقدير التألق المستقل عن الكالسيوم ل FU A اثنين. الطول الموجي للإثارة المستخدم في هذه الخطوة هو 360 نانومتر.

بمجرد تحديد مجال مناسب ، قم بإعداد برنامج التصوير للإثارة عند 340 نانومتر و 380 نانومتر ولقياس التألق المنبعث عند 510 نانومتر كل ثلاث ثوان ، اضبط وقت التعرض لإنتاج شدة مضان حول 1000 وحدة تعسفية للإعداد الموضح هنا. يتم تعيين وقت التعرض لمدة خمسة مللي ثانية. بالإضافة إلى ذلك، حدد مناطق الاهتمام أو عائد الاستثمار لمنطقة خلفية خالية من الخلايا وما يصل إلى 20 محيطا للخلية.

ابدأ تصوير خلايا الحياة أثناء تشغيل التجربة ، سيقدم النظام الصور المترية للنسبة لعدد أقل من إشارتين بالإضافة إلى نسب F في الوقت الفعلي ، وثلاثة 40 F ، وثلاث نسبات 80 لكل عائد استثمار محدد كمخطط خطي حيث تتوافق F three 40 و F three 80 مع شدة التألق داخل عائد الاستثمار عند 340 و 380 نانومتر على التوالي. بعد دقيقة واحدة ، أضف محاليل الاختبار إلى غرفة التصوير لاختبار المعلمات التجريبية المختلفة. في هذه التجارب ، يتم اختبار مضاد Cal Modlin ، والفلور الثلاثي ، والبولين A بعد إجراء قياسات مترية للنسبة لمدة 10 دقائق إضافية.

بالنسبة للخصوم المعياريين ل CAL ، أضف DSA gargan واستمر في القياسات. سجل 400 صورة مقترنة لكل تجربة. بمجرد جمع الصور ، راجع الصور وحدد عائد الاستثمار ل 20 خلية على الأقل لكل مجال رؤية.

استخدم بعد ذلك خيار التحليل الحركي في البرنامج لإنشاء سلسلة من صور نسبة الخلفية المطروحة ومخطط يوضح حركية نسبة الكالسيوم المطروحة في الخلفية. لكل عائد استثمار ، قم أخيرا بتصدير البيانات إلى Excel و Origin باستخدام طريقة معايرة محددة. يمكن حساب تركيز الكالسيوم العصارة الخلوية من قياسات النسبة لفحص ما إذا كان الجنس 61 A يؤثر جين واحد على تسرب الكالسيوم من er.

تم إسكات الجنس 61 A جين واحد بواسطة اثنين من الحمض النووي الريبي وخلايا الهيليكوبتر المختلفة لمدة 96 ساعة. تم تقييم الإسكات من خلال تحليل الدم الغربي لأعداد الخلايا المماثلة في ثلاث نسخ كما هو موضح هنا ، هناك إشارة ألفا قوية 6 61 في الممرات من واحد إلى ثلاثة وإشارة أضعف بكثير في الممرات من أربعة إلى ستة ومن سبعة إلى تسعة تتوافق مع خلايا الصمت 6 61 A واحدة. لتحديد النتائج ، تم تطبيع إشارات ألفا 61 للجنس إلى إشارات الأكتين بيتا التي تم تحقيقها بنسبة أكبر من 80٪ من إسكات الصوت لاختبار دور الكالمودولين في تدفق الكالسيوم F ER.

URA اثنين من التصوير للجنس 61 A سيدي واحد تم إجراء خلايا الهليكوبتر المعالجة في وجود أو عدم وجود مضاد Cal Modin. Bollin A.يظهر هذا الفيلم خلايا التحكم المعالجة بالبولين بعد 10 دقائق من بولين. بدأ إطلاق الكالسيوم العلاجي من خلال تطبيق FSO Gargan ، وهو مثبط حول ما يفك القناع عن إطلاق الكالسيوم من غرفة الطوارئ في حالة عدم وجود كالسيوم خارجي كما يتضح هنا.

أدت إضافة الأرجون FSA إلى زيادة عابرة ولكنها كبيرة في التألق مما يشير إلى تدفق الكالسيوم F من er. في المقابل ، فإن تدفق الكالسيوم F بعد إضافة FSO garin في عظام PHE ، A الجنس المعالج 61 A الخلايا الصامتة أقل وضوحا كما يمكن رؤيته هنا. يمكن رؤية هذا الاختلاف بوضوح في هذا الرسم البياني ، الذي يوضح تقدير الكالسيوم الخلوي بمرور الوقت في سلسلة من الأفلام ، وتؤكد النتائج الكمية الموضحة هنا زيادة الكالسيوم FLX في خلايا التحكم استجابة للأرجون الثيك في وجود offi bolin A كما يتضح من هذا الرسم البياني الشريطي.

شوهدت نفس الظاهرة بالنسبة لخصم الكاميرا الثاني تريازين. ومع ذلك ، لم تظهر تأثيرات مضادات الكاميرا عندما تم استنفاد مركب الجنس 61 من الخلايا من قبل أي من الجنسين. 61 يمكن رؤية إنقاذ جزئي محدد من siRNAs لهذا النمط الظاهري عند الجنس 61 A تم نقل الخلايا الصامتة مع الجنس.

61 بلازميد تعبير واحد كما يمكن رؤيته هنا. يتم استعادة الكالسيوم ffl استجابة لناهضات Cal Modin جزئيا مع تعداء البلازميد البري غير الحساس من irna. تشير هذه النتائج إلى أن Cal Modlin متورط في الحد من ER الكالسيوم flx على مستوى مركب الجنس 61 في الخلايا.

إذا كان الأمر كذلك ، فإن تعداء الجنس ، 61 جين واحد مع طفرة مزدوجة في موقع ربط كال مودين لا ينبغي أن ينقذ النمط الظاهري الناجم عن irna. في الواقع ، عندما تم نقل الخلايا باستخدام الجنس 61 بلازميد تعبير واحد مع طفرة مزدوجة في شكل الذكاء ، لم يكن هناك إنقاذ للنمط الظاهري معا. تشير هذه البيانات إلى أن إطلاق السلاسل الناشئة من مركب الجنس 61 يؤدي بالفعل إلى إطلاق الكالسيوم من غرفة الطوارئ وتشكيل مجال نانو الكالسيوم حول فم اختيار cyto للجنس 61 المركب.

يرتبط هذا الكالسيوم ب Cal Moulin والكالسيوم Cal Moulin يغلق مركب الجنس 61. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الجمع بين إسكات الجينات بوساطة IRNA في الخلايا البشرية مع تصوير الكالسيوم في نمط الحياة بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التعبير عن CDNAs مع طفرات ارتباط المرض من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التأثير المحتمل لطفرات المرتبطة بالمرض في المكونات غير ذات الصلة.

ولا تنس أن العمل مع أدوية مثل الصنبور ، مرة أخرى ، يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما أن تؤخذ السلائف ، مثل استخدام القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.