قياس التماسك الحصى بواسطة Tensiometry الأنسجة السطحية

يوضح هذا الإجراء كيفية قياس قوة التماسك داخل الخلايا في الأنسجة ثلاثية الأبعاد مثل التجمعات الخلوية. تتمثل الخطوة الأولى في توليد تجمعات خلوية كروية تشبه الأنسجة ونقلها إلى طبق بتري مملوء بوسط زراعة الأنسجة. بعد ذلك، يتم سحب التجمعات الفردية بواسطة ماصة باستور وتحميلها في لوحة الضغط السفلية لغرفة مقياس التوتر.

بعد ذلك، يتم توصيل لوحة الضغط العلوية بسلك من النيكل والكروم، والذي يربطها بالميزان الإلكتروني ويقوم بتحديد خط أساس للوزن الصفري يُشار إليه بـ F zero. تبدأ التجربة برفع لوحة الضغط السفلية حتى يتم ضغط التجمع بين لوحتي الضغط السفلية والعلوية، وتنتهي عندما تصل التجمعات إلى حالة توازن في الشكل والقوة أو FEQ. وتتمثل الخطوات النهائية للإجراء في التقاط الصور، وقياس هندسة التجمع وقوة المقاومة، ثم إدخال هذه القياسات في معادلة young LA place.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر التغيرات في تماسك الأنسجة وكيفية تأثير ذلك على انتشار الورم أو التموضع المكاني بين المجموعات الخلوية المختلفة من خلال مقايسات انتشار التجمعات أو مقايسات فرز الخلايا على التوالي. لذا، يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجالات بيولوجيا الأورام، والتطور الجنيني، وهندسة الأنسجة. أسئلة مثل: كيف يؤثر تماسك الورم على الغزو الخبيث، وتطبق الطبقات الجرثومية أثناء عملية التبطين الجنيني؟

أو كيف يمكننا هندسة التماسك فعلياً لتوليد بنيات تشبه الأعضاء الوظيفية في المختبر (In vitro)؟ يجب إجراء المعالجات التجريبية التي تتضمن استزراع الخلايا الحية تحت ظروف تعقيم في غطاء تدفق صفائحي مخصص. كما يجب استخدام المحاليل المعقمة والأدوات المختبرية المعقمة طوال العملية. لبدء هذه التجربة، قم بحصاد الخلايا الملتصقة عند وصولها إلى 90% من درجة الالتحام.

أولاً، يتم سحب الوسط الزرعي وشطف ورقة الخلايا مرتين باستخدام PBS. ثم يتم سحب PBS ونقل 2 milliliters من محلول 0.05%trips in EDTA بواسطة الماصة فوق الطبقة الأحادية. توضع الشريحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius ويتم تحضينها حتى تنفصل الخلايا.

بعد ذلك، أخرج الطبق من الحاضنة وأوقف عملية التحلل بإضافة 2 mL من الوسط الغذائي الكامل. استخدم ماصة سعة 5 mL لرج المزيج حتى تصبح الخلايا معلقة بالكامل. ثم انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL.

قم بنقل 40 µL من محلول DNA بتركيز 10 mg/mL إلى معلق الخلايا، ثم حضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد التحضين، قم برج معلق الخلايا لفترة وجيزة باستخدام جهاز الـ vortex، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 200 ×g لمدة خمس دقائق. بمجرد اكتمال عملية الطرد المركزي، قم بسحب السائل الطافي والتخلص منه. بعد ذلك، أعد تعليق الراسب في 1 mL من الوسط الغذائي الكامل وكرر عملية الطرد المركزي لغسل الراسب.

قم بتعليق الراسبة في 1 mL من الوسط الغذائي الكامل، ثم قم بإجراء عد للخلايا، وإذا لزم الأمر، اضبط تركيز معلق الخلايا ليصل إلى 6 × 10⁶ cells/mL باستخدام الوسط الغذائي الكامل والماصة. انقل 3 mL من معلق الخلايا إلى دورق ذو قاع مستدير سعة 10 mL، ثم قم بالتحضين في حمام مائي هزاز عند 37 °C و 5% carbon dioxide لمدة أربع ساعات بسرعة 120 rotations per minute، حتى تتعافى الخلايا من التأين، وهو ما يستدل عليه بالتصاق الخلايا ببعضها لتكوين تجمعات صغيرة.

بعد ذلك، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي ذو قاع مستدير، ثم قم بإجراء الطرد المركزي عند 200 ×g لمدة أربع دقائق لتكوين طبقة رقيقة بعد عملية الطرد المركزي. قم بفك غطاء الأنبوب للسماح بالتبادل الغازي، ثم ضع الأنبوب في حاضنة زراعة الأنسجة. تُحضن الخلايا لمدة 24 ساعة، حيث ينبغي أن تصبح الطبقة متماسكة.

بعد مرور 24 ساعة، قم بهز أنبوب الطرد المركزي برفق لفصل الصفيحة. ثم صب محتويات أنبوب المزرعة في طبق زجاجي صغير ومعقم لزراعة الأنسجة. استخدم مشارط دقيقة لتقطيع صفيحة الخلايا إلى قطع بأحجام مختلفة، ثم انقل القطع إلى دورق مستدير القاع سعة 10 milliliter يحتوي على ثلاثة milliliters من وسط زراعة الأنسجة.

يتم تحضين الشظايا عند 37 درجة مئوية في حمام مائي هزاز بسرعة 120 دورة في الدقيقة تحت 5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام أو حتى تصبح كروية. كما يمكن إجراء تكوين التجمعات باستخدام طريقة القطرة المعلقة. وفقًا للبروتوكول المنشور سابقًا، يتكون إعداد مقياس توتر السطح النسيجي أو TST من غرفة قياس التوتر الرئيسية التي تحتوي على خلية الضغط، وحمام مائي للحفاظ على درجة حرارة الغرفة، ومجهر تشريحي مزود بكاميرا CCD، وميزان كهربائي للسيارات مع وحدة تزويد بالطاقة، ومسجل مخططات.

تتكون خلية الضغط في جهاز TST من حجرتين، حجرة خارجية وحجرة داخلية. وتحتوي الحجرة الداخلية على لوحة ضغط علوية ولوحة ضغط سفلية مكسوتين بـ poly two hydroxyethyl methacrylate. أولاً، اضبط مضخة المياه الدوارة على 37 درجة Celsius وتأكد من توصيل الأنابيب بالمنافذ الموجودة في الحجرة الخارجية.

بعد ذلك، قم بربط التجميعة السفلية، المستخدمة لرفع الركام لبدء عملية الضغط، في قاعدة الغرفة الداخلية. بعد ذلك، قم بتجهيز قطعة من سلك النيكل والكروم مفرودة باللهب، وذلك عن طريق تعليق قطعة سلك بطول 15 inch من حامل ثلاثي الأرجل وتثبيت مشبك ورقي صغير في طرفها. ثم قم بتمرير لهب موقد بنزن صعوداً وهبوطاً على طول السلك حتى يتوهج السلك باللون الأحمر.

استخدم قاطعة أسلاك لقص السلك المفرود إلى الطول المناسب. ثم استخدم شفرتي حلاقة لثني السلك على مسافة ربع بوصة تقريبًا من الطرف لتشكيل خطاف صغير. وأخيرًا، املأ الحجرة الداخلية لـ TST بوسط زراعة أنسجة خالٍ من ثاني أكسيد الكربون، والذي تم إزالة الغازات منه عن طريق التحضين عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

استخدم ماصة epa لإزاحة أي فقاعات هواء قد تكون تكونت على لوحة الضغط السفلية. أصبح جهاز TST الآن جاهزاً لتجربة ضغط التجمعات الخلوية. استخدم ماصة APA لسحب تجمع خلوي يتراوح حجمه من 200 إلى 300 ميكرون من طبق الزرع.

بعد ذلك، قم بإخراج التجمع بلطف على لوحة الضغط السفلية في الغرفة الداخلية لجهاز TST. ضع التجمع في أقرب نقطة ممكنة من منتصف لوحة الضغط السفلية عن طريق دفعه برفق باستخدام أنبوب شعري مزود بحلقة شعر صغيرة. قم بتوصيل سلك النيكل كروم الموجود أعلى تجميعة اللوحة بذراع الميزان في ميزان التسجيل الكهربائي can venton Model 2000.

قم بتعديل وضع الميزان حتى تصبح لوحتا الضغط العلوية والسفلية متوازيتين ومتقابلتين مباشرة. اترك اللوحة العلوية حتى تستقر. ثم قم بتصفير مسجل المخطط البياني وفقاً لوزن الخط القاعدي المحدد.

استخدم المجهر التشريحي المزود بكاميرا CCD لالتقاط صورة للتجمع غير المضغوط. بعد ذلك، اضبط ارتفاع جهاز اللب الداخلي للتحكم في درجة الضغط المطلوبة، ثم ارفع لوحة الضغط السفلية حتى ينضغط التجمع مقابل لوحة الضغط العلوية. استخدم المجهر التشريحي المزود بكاميرا CCD لمراقبة عملية الضغط والتقاط صور للتجمع مثل تلك الموضحة هنا.

سجل باستمرار التغير في الوزن الظاهري لصفيحة الضغط العلوية باستخدام مسجل مخطط شريطي طوال عملية الضغط حتى يتم تحقيق الشكل المطلوب. ويُستدل على حالة الاتزان من خلال استقرار جهد المخرج لميزان العلب. مرة أخرى، استخدم مجهر التشريح المجهز بكاميرا CCD لالتقاط صورة للتجمع المضغوط.

ستُستخدم هذه الصورة لقياس هندسة التجمعات. بعد التقاط الصورة، قم بخفض لوحة الضغط لفك ضغط التجمعات لقياس قوة الضغط عند حالة التوازن. اقرأ مخطط مسجل البيانات كفرق بين القوة المقاسة مباشرة قبل فك ضغط التجمعات وخط الأساس الصفري المحدد. كرر هذه العملية باستخدام درجة ضغط مختلفة لتحديد توازن القوة هذه المرة.

قم بقياس قوة الضغط والهندسة عند توازن القوة، وطبق هذه القياسات مع قياسات توازن الشكل على معادلة يونغ-لابلاس (Young laplace equation) لاستخراج القيم العددية للتوتر السطحي الظاهري للنسيج. وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب، يوضح هذا الجدول قياسات التوتر السطحي للنسيج وتأكيد سيولة التجمعات لتجمعات من بروستاتا الجرذ، والخلايا الليفية، وخلايا العضلات الملساء. تبلغ قيمة التوتر السطحي لتجمعات الخلايا الليفية في بروستاتا الجرذ 22.8 ± 1.1 داين لكل سنتيمتر.

علاوة على ذلك، كانت قيم متوسط التوتر السطحي المقاسة بعد الضغط الأول وبعد الضغط الثاني متطابقة إحصائياً عند مقارنتها بواسطة اختبار T المقترن. كما قارنا نسب sigma two إلى Sigma one ونسب F two إلى F1 للتأكد من أن هذه التجمعات لم تخضع لقانون هوك كما سيكون الحال لو تصرفت كأجسام صلبة مرنة، كما هو موضح في الجدول one. وبالفعل، فإن نسبة sigma two إلى Sigma one تقترب من الواحد.

علاوة على ذلك، كانت نسبة F two إلى F1 أكبر بكثير من نسبة sigma two إلى sigma one، مما يؤكد أن هذه التجمعات لا تخضع لقانون هوك، بل تسلك في الواقع سلوك السوائل. وفي المقابل، وكما هو واضح في الجدول one، فإن نسبة sigma two إلى sigma one لخلايا العضلات الملساء في بروستاتا الجرذ أكبر بكثير من واحد، ولم تكن مختلفة إحصائياً عن نسبة F two إلى F1. ولإثبات السلوك الشبيه بالسوائل بشكل أكبر، استكشفنا العلاقة بين التوتر السطحي وحجم التجمع كما هو موضح هنا. يظهر أن الحجم مستقل عن sigma بالنسبة لخلايا RPF كما يوضحه خط الانحدار الأحمر، بينما يبدو أن هناك بعض الاعتماد لـ sigma على الحجم بالنسبة لخلايا العضلات الملساء في بروستاتا الجرذ كما يوضحه خط الانحدار الأزرق.

تؤكد هذه البيانات كذلك أن تجمعات الخلايا الليفية في بروستاتا الجرذ تسلك سلوكاً شبيهاً بالسوائل، بينما تبدو تجمعات خلايا العضلات الملساء في بروستاتا الجرذ وكأنها تسلك سلوك المواد الصلبة المرنة. لذا، وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التطور الجنيني والغزو الخبيث وهندسة الأنسجة لاستكشاف دور تماسك الأنسجة في إنشاء المقصورات والحدود بين أنواع الخلايا المختلفة أثناء تطور الطبقات الجنينية، وأثناء التفاعل بين الخلايا السدوية للأورام وإعادة ترتيب خلايا جزر البنكرياس في عدد من النماذج الحيوانية المختلفة، بما في ذلك البرمائيات والأسماك والطيور والنماذج البشرية.