الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

يوضح هذا الفيديو طريقة لاستزراع وتوزيع سلالات الفلورسنت من CL gans للفحص عالي الإنتاجية للمكتبات الكيميائية أو الكشف عن الملوثات البيئية لتقييم تأثير العوامل الكيميائية أو البيئية على نشاط بروتيني معين. في CL elgan ، يتم تحضير الثقافات البكتيرية أولا كغذاء للديدان و GFP المعدلة وراثيا. يتم استزراع الديدان المتزامنة.

ثم يتم جمع 0.5 إلى 2 مليون دودة وغسلها وتوزيعها في 3 84. تتم إضافة ألواح الميكروتيتر ، ثم جزيئات صغيرة من مكتبة كيميائية أو عينات اختبار مثل الماء أو الطعام أو التربة إلى الديدان. أخيرا ، يتم قياس تألق الديدان باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.

يكشف تحليل بيانات شدة التألق عن جزيئات صغيرة تعدل مسارات النسخ المحفزة أو تسمح باكتشاف الملوثات البيئية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل المقايسات القائمة على الثقافة في المختبر والخلايا ، هي أنه لن يضيع الوقت على المركبات السامة أو غير النشطة في الجسم الحي. يمكن أن تساعد طريقة الإنتاجية العالية هذه في تحديد الجزيئات الصغيرة التي تعدل المسارات المحفزة المتنوعة.

على الرغم من أننا طورنا هذه الطريقة لفحص الإنتاجية العالية لمكتبات الجزيئات الصغيرة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الاستشعار الحيوي للملوثات في عينات الطعام والبيئة. سيوضح الإجراء أندرو داين ، فني مختبري و Q long باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري. قم بإعداد طعام الديدان البكتيرية في وقت مبكر.

ابدأ بتلقيح 500 مل من المرق الرائع ، مع استكمال 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الستربتومايسين مع خمسة ملليلتر من القولونية المشبعة. منطوق 50. ضع المزرعة على شاكر وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، قم بتقسيم الثقافة إلى 10 50 أنابيب ملليلتر. ثم ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي مبرد وقم بتدويرها عند 2 ، 500 RCF لمدة 20 دقيقة. بعد الدوران Resus, كل حبيبات بكتيرية في 10 ملليلتر من وسائط نمو الديدان الخيطية السائلة أو NGM.

هز المعلقات أفقيا. شاكر أرضي لمدة 15 دقيقة لتعليق البكتيريا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للثقافة البكتيرية عند 2 ، 500 RCF عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

صب NGM ووزن الحبيبات البكتيرية. ثم أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت NGM وأعد تعليق الكريات عن طريق الدوامة. أخيرا ، قم بتقسيم ثلاثة ملليلتر من المزرعة البكتيرية المعلقة في أنابيب سعة 15 مليلتر وقم بتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تكون هناك حاجة إليها.

في هذا العرض التوضيحي ، سيتم قياس تأثير قرض Xeno Duke الذي يسبب الإجهاد على عامل النسخ Sskn one كمثال. من المعروف أن Sskn one ينشط الجينات الواقية للخلايا أثناء الإجهاد التأكسدي والزينوبي. يتم إعداد ثقافة واسعة النطاق لخط Trenchgenic c gans VP 5 96 ، والذي يحمل اثنين من التركيبات الفلورية.

تعبر الديدان VP 5 96 عن كل من مروج ضريبة السلع والخدمات الأربعة الذي يقود GFP ، والذي يستخدم لمراقبة نشاط عامل النسخ. Sskn واحد و DOP ثلاثة مروج القيادة. يستخدم RFP كمعيار لتطبيع عدد الدودة.

DOP ثلاثة هو المحفز لمستقبلات الدوبامين ويتم التعبير عنه بشكل أساسي في الخلايا العصبية في جميع أنحاء الجسم. في المثال ، بالنظر إلى أن xenobi lon ينشط بقوة sskn one ويزيد من كمية GFP المعبر عنها من GS T أربعة محفز لإعداد الثقافات تبدأ بالجمع بين 150 مل من N NGM buffer و 1.5 مل من LB 150 ، وميكرولتر من الكوليسترول المولي الواحد و 75 ميكرولتر من 100 ملليغرام لكل مليلتر. الستربتومايسين. تساعد إضافة LB على منع الديدان من الالتصاق بالأواني الزجاجية والأواني البلاستيكية ، لكن هذه الكمية لا تكفي لدعم نمو البكتيريا.

قم بالتصفية لتعقيم الخليط ، ثم انقله إلى قارورة معقمة سعة لتر واحد واترك القارورة جانبا لتحرير البيض من الديدان البالغة الوراثية. اغسل البكتيريا من الديدان عن طريق الطرد المركزي واستبدال وسط NGM حتى يصبح الاستلقاء واضحا. اغسل الديدان للمرة الثانية عن طريق Resus ، وتعليقها في جهاز طرد مركزي مائي معقم مرة أخرى بعد الدوران.

قم بإزالة supinate واملأ الأنبوب ب 3.75 مل من الماء المعقم. أضف ملليلترا واحدا من المبيض المنزلي و 250 ميكرولترا من 10 هيدروكسيد الصوديوم العادي ممزوجا على الفور عن طريق الانعكاس من خمس إلى ست مرات. ضع الأنبوب في مدور بعد تعرض الديدان للتبييض لمدة أربع دقائق.

ضع الأنبوب تحت مجهر استريو. يجب أن يكون معظم البالغين أكاذيب. هز الأنبوب بقوة من 15 إلى 20 مرة للمساعدة في تكمن أي ديدان بالغة متبقية بعد حدوث التحلل لمدة خمس دقائق ، أضف الماء المعقم حتى يمتلئ الأنبوب.

تخلط عن طريق الانعكاس من خمس إلى ست مرات لجمع البيض. الطرد المركزي الأنبوب لمدة دقيقة واحدة عند 500 RCF. اغسل البيض ثلاث مرات بواسطة Resus ، وثنيه في 10 مل من الماء المعقم ، وقم بالدوران وإزالة supinate.

بعد ذلك ، قم بتخفيف عينة 100 ميكرولتر من البيض 100 أضعاف عن طريق إضافة 10 مل من مخزن NGM المؤقت. ثم ضع الماصة ثلاثة أجزاء من خمسة ميكرولترات على غطاء طبق بتري تحت المجهر. احسب عدد البيض في ثلاثة حصص منفصلة سعة خمسة ميكرولتر.

لتقدير العدد الإجمالي للبيض. أضف 200،000 إلى 2 مليون بيضة إلى القارورة باستخدام مخزن NGM وقم بهز المزرعة عند 100 دورة في الدقيقة عند 20 درجة مئوية. بعد 16 ساعة على الأقل من إضافة البيض إلى القارورة ، يستخدم ماصة مصلية معقمة لإزالة ما يقرب من 0.5 مل من مزرعة الديدان العالقة.

ماصة ثلاث قطرات بسعة خمسة ميكرولتر على الغطاء المعقم لطبق بتري. ضع الغطاء في فريزر 20 درجة تحت الصفر لمدة دقيقة إلى دقيقتين لشل الديدان بمجرد إصابة الديدان بالشلل. احسب متوسط عدد الديدان الحية المفرغة لكل خمسة ميكرولترات باستخدام مجهر استريو لتقدير العدد الإجمالي.

قم بإذابة المزرعة البكتيرية المجمدة OP 50 المحضرة مسبقا عن طريق وضعها على مقعد لبضع دقائق. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من 50٪ OP 50 لكل 500،000 ديدان فقس. رج القارورة 100 دورة في الدقيقة عند 20 درجة مئوية.

سوف تتطور الديدان إلى L أربع يرقات ومراحل الشباب في حوالي 51 ساعة. مراقبة كمية البكتيريا في جميع أنحاء الحضانة عن طريق الفحص البصري. أضف المزيد من البكتيريا إذا أصبحت الوسائط واضحة.

استخدم ماصة مصلية معقمة لنقل ما يقرب من 0.5 ملليلتر من مزرعة الديدان العالقة إلى صفيحة أجار NGM القياسية. شاهد الديدان بمجهر ستيريو للتأكد من أن معظمها من اليرقات الأربعة L والشباب تحت الفحص المجهري الساطع ، سيكون لليرقات الأربعة بقعة بطنية واضحة في منتصف الجسم. سيكون الشباب أكبر قليلا ولن يكون لديهم بقعة واضحة.

بعد ذلك ، اسحب ثقافة الدودة إلى أنابيب معقمة سعة 50 مل. ضع الأنابيب في رف أنبوب اختبار في الغطاء واسمح لها بتسوية البيض غير المفرغ أو الديدان التي لا تتطور. تستقر بشكل أبطأ من الديدان المتطورة.

بعد 10 دقائق ، قم بإزالة الجوائد ، التي تحتوي على ديدان غير مفقسة وغير متطورة عن طريق الشفط بحوالي 10 ملليلتر من المخزن المؤقت NGM لكل حبيبات وتعليق الديدان عن طريق تحريك الأنابيب برفق. اجمع كل الديدان في أنبوب واحد سعة 50 مل. قم بالدوران في جهاز الطرد المركزي للدلو المتأرجح عند 500 RCF لمدة 30 ثانية.

ثم أعد تعليق الديدان في 50 مل من NGM مع 1٪ رطل لغسلها. كرر ذلك ، اغسل ثلاث إلى أربع مرات لإزالة البكتيريا بعد الغسيل. املأ الأنبوب ب NGM بالإضافة إلى LB Buffer حتى 50 ملليلترا.

اسكبيها في قارورة توزيع دودة مخصصة في شريط التحريك وضعيها على طبق تحريك. هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 20 مل أو 60،000 دودة لملء المساحة الميتة في قارورة التوزيع وكاسيت الموزع. احسب عدد الديدان في ثلاث قطرات سعة خمسة ميكرولتر كما هو موضح سابقا.

بعد العد عند NGM بالإضافة إلى LB بتركيز 12 إلى 15 دودة لكل قطرة خمسة ميكرولتر ، تتطلب كل صفيحة بئر 3 84 حوالي 35،000 دودة أو 11.5 مل من الديدان العالقة. قم بتحميل كاسيت توزيع سعة 10 ميكرولتر في الموزع وتعقيمه عن طريق التحضير بنسبة 70٪ من الإيثانول. اشطف الإيثانول عن طريق التحضير بالماء المعقم.

أدخل نهاية كاسيت التوزيع في القارورة بحيث تكون فوق قضيب التحريك مباشرة دون تعطيل حركتها. تأكد من بقاء الديدان معلقة في جميع أنحاء القارورة. قم ببرمجة الموزع لتوزيع الديدان بسرعة منخفضة باستخدام نبضتين مسبقيتين وتشغيل ما لا يقل عن 10 مل من الديدان العالقة.

املأ ألواح الميكروتيتر ، والتي يجب أن تحتوي بالفعل على مركبات اختبار بسرعة لمنع الديدان من الاستقرار في الأنبوب. هنا من المقرر أن يكون مركب الاختبار الذي تم تحميله مسبقا على لوحة الميكروتيتر. أزهر. أغلق الألواح بشريط مسامي لمنع تجمع الغبار في الآبار.

ضع الألواح على منصة اهتزاز في حاضنة عند درجة الحرارة المناسبة للفحص. لا تكدس الألواح لأن ذلك قد يحد من تدفق الهواء. ضع اللوحة المستهدفة في قارئ صفيحة دقيقة لقياس شدة التألق لكل بئر مع الأطوال الموجية المناسبة للانبعاث والإثارة هنا.

المرشحات المستخدمة في GFP هي الإثارة عند 4 85 والانبعاث عند 5 28. مرشحات RFP هي الإثارة عند خمسة 40 والانبعاث عند خمسة 90. بعد قراءة اللوحة ، احسب نسبة GFP إلى RFP وقم بالتطبيع مع قراءات آبار التحكم ، والتي لا تحتوي على المركب المنشط لتحديد فرق الطية الدقيق لشدة التألق المستمدة من المعالجات الفردية.

يستخدم اختبار SSKN الموضح هنا تقريرا مزدوجا متكاملا من الناحية الكروموسومية ، وهو سلالة عندما تم حساب الديدان يدويا باستخدام مجهر استريو. يرتبط عدد الديدان بالحجم الذي تم الاستغناء عنه بقيمة R تربيع 0.94 وقيمة p أقل من 0.0001. يشير هذا إلى أنه يمكن التحكم في عدد الديدان التي يتم توزيعها في كل بئر عن طريق ضبط الحجم الذي يتم توزيعه.

إجمالي مضان GFP لكل بئر موضح على اليسار ومضان RFP لكل بئر موضح على اليمين قابل للتكرار بدرجة كبيرة من البئر إلى البئر عبر صفيحة بئر 3 84 في هذه الأشكال. يشير XS إلى التألق النسبي المقاس في كل بئر. تشير الخطوط الصلبة إلى الوسائل وتشير الخطوط المكسورة إلى ثلاثة انحرافات معيارية أعلى أو أقل من متوسط مضان جميع الآبار كان لها معامل تباين أقل من 9٪ كما هو موضح في هذا الشكل ، يرتبط مضان GFP من المروج الرابع GST خطيا بمضان RFP من مروج DOP الثالث عبر 3 84 بئرا بقيمة R تربيع 0.62 وقيمة p أقل من 0.0001.

لذلك ، يمكن استخدام مراسل RFP غير المحفز لتطبيع المحفز. مراسل GFP. عندما يعبر عن نسبة GFP عبر RFP ، يصبح مضان RFP قابلا للتكرار بدرجة كبيرة من البئر إلى البئر عبر لوحة 3 84 بئر.

حساب نسبة GFP إلى RFP إلى تقليل معامل التباين إلى أقل من 6٪ مما يدل على قدرة مبلغي RFP المحفز الثالث DOP على تقليل التباين كما هو موضح هنا. إن تحريض GFP بالنسبة إلى RFP مع SK N واحد ينشط xeno الحيوي قوي وقابل للتكرار بدرجة كبيرة عبر صفيحة بئر 3 84 ، ويتم تمييز متوسط نسب التألق النسبي لجميع آبار التحكم والآبار المستحقة GLO بخطوط صلبة. يتم تمييز ثلاثة انحرافات معيارية فوق متوسط التحكم وأسفل متوسط dlo بخطوط مكسورة.

بمجرد إتقان ، يمكن بدء زراعة الدودة حوالي ساعة واحدة في اليوم الأول وجمعها وتوزيعها. يمكن عمل الديدان حوالي ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. في حين أن محاولة هذا الإجراء من المهم أن تتذكر أن تبدأ مع ما لا يقل عن 60,000 الديدان وإبقائها معلقة أثناء الاستغناء, بعد شاشات هذا الإجراء مع أخرى, على سبيل المثال, سلاسل تقرير لمسارات محفزة أخرى يمكن إجراؤها من أجل تطوير معدلات لمسارات أخرى بعد تطويره.

يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجالات الفحص عالي الإنتاجية والاستشعار الحيوي لتحديد معدلات مسار الجزيئات الصغيرة بسرعة أو اكتشاف الملوثات البيئية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استزراع وتوزيع وقياس سلالات الفلورسنت من أجل الفحص عالي الإنتاجية إذا كانت مسارات النسخ المحفزة أو اختبار عينات متعددة للملوثات البيئية.