الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

يوضح هذا الفيديو طريقة لاستزراع وتوزيع سلالات فلورية من C. elegans من أجل الفحص عالي الإنتاجية للمكتبات الكيميائية أو الكشف عن الملوثات البيئية لتقييم تأثير العوامل الكيميائية أو البيئية على نشاط بروتين معين. في C. elegans، يتم أولاً تحضير المزارع البكتيرية كغذاء للديدان، ثم يتم استزراع ديدان متزامنة من النوع GFP transgenic.

يتم بعد ذلك جمع ما يتراوح بين 0.5 إلى 2 مليون دودة، وغسلها وتوزيعها على 3 أطباق معايرة دقيقة ذات 84 بئراً، ثم تُضاف جزيئات صغيرة من مكتبة كيميائية أو عينات اختبار مثل الماء أو الغذاء أو التربة إلى الديدان. وأخيراً، يتم قياس فلورة الديدان باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة.

يكشف تحليل البيانات لشدة الفلورة عن جزيئات صغيرة تعمل على تعديل مسارات النسخ القابلة للاستحثاث أو تسمح بالكشف عن الملوثات البيئية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المقايسات المختبرية أو تلك القائمة على المزارع الخلوية، في عدم إضاعة الوقت على المركبات السامة أو غير النشطة داخل الجسم الحي (in vivo). يمكن لهذه الطريقة عالية الإنتاجية أن تساعد في تحديد الجزيئات الصغيرة التي تعدل مسارات استحثاثية متنوعة.

على الرغم من تطويرنا لهذه الطريقة للفحص عالي الإنتاجية لمكتبات الجزيئات الصغيرة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في الاستشعار الحيوي للملوثات في عينات الأغذية والعينات البيئية. سيقوم بتوضيح الإجراء أندرو داين، فني في مختبري، و كيو لونغ، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري. قم بتحضير غذاء الديدان البكتيري مسبقاً.

ابدأ بتلقيح 500 ملليلتر من مرق terrific، المدعم بـ 50 ميكروجرام لكل ملليلتر من streptomycin، بخمسة ملليلترات من سلالة e coli. OP 50 المشبعة. ضع المزرعة على جهاز هزاز واتركها تنمو طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي، قم بتقسيم المزرعة إلى 10 أنابيب سعة 50 milliliter. ثم ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي مبرد وقم بتدويرها عند 2, 500 RCF لمدة 20 دقيقة. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإعادة تعليق كل كتلة بكتيرية في 10 milliliters من وسط نمو النيماتودا السائل أو NGM.

رجّ المعلقات أفقياً باستخدام هزاز أرضي لمدة 15 دقيقة لإعادة تعليق البكتيريا. بعد ذلك، قم بطرد المزرعة البكتيرية مركزياً عند 2,500 RCF في درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

قم بسكب وسط NGM ووزن كتلة البكتيريا المترسبة. ثم أضف حجماً مساوياً من منظم NGM وقم بإعادة تعليق الراسب عن طريق الخلط الدوامي. وأخيراً، وزع ثلاث مليلتر من المزرعة البكتيرية المعاد تعليقها في أنابيب سعة 15 مليلتر واحفظها في درجة حرارة -20 °C حتى وقت الحاجة إليها.

في هذا العرض التوضيحي، سيتم قياس تأثير القرض التحريضي للإجهاد Xeno Duke على عامل النسخ Sskn one كمثال. ومن المعروف أن Sskn one ينشط الجينات الواقية للخلايا أثناء الإجهاد التأكسدي وإجهاد المواد الغريبة. يتم تحضير مزرعة واسعة النطاق من سلالة Trenchgenic c gans VP 5 96، والتي تحمل اثنين من البناءات الفلورية.

تعبر 96 دودة من سلالة VP 5 عن كل من محفز GST four الذي يقود GFP، والذي يُستخدم لمراقبة نشاط عامل النسخ Sskn one، ومحفز DOP three الذي يقود RFP، والذي يُستخدم كمعيار لتقييس عدد الديدان.

يعتبر DOP three المروج لمستقبل الدوبامين، ويُعبر عنه بشكل تأسيسي في الخلايا العصبية في جميع أنحاء الجسم. في هذا المثال، نظراً لأن المادة الغريبة تفعّل sskn one بقوة وتزيد من كمية GFP المُعبر عنها من مروج GS T four، فإنه لتحضير المزارع، ابدأ بخلط 150 milliliters من منظم N NGM، و 1.5 milliliters من LB و 150 microliters من كوليسترول بتركيز one molar و 75 microliters من Streptomycin بتركيز 100 milligrams per milliliter. تساعد إضافة LB في منع الديدان من الالتصاق بالأواني الزجاجية والبلاستيكية، ولكن هذه الكمية ليست كافية لدعم النمو البكتيري.

قم بترشيح المزيج لتعقيمه، ثم انقله إلى دورق معقم سعة لتر واحد واتركه جانباً لتحرير البيوض من ديدان GR البالغة. اغسل البكتيريا من الديدان عن طريق إجراء عملية طرد مركزي لها واستبدال وسط NGM حتى يصبح الراشح صافياً. اغسل الديدان مرة ثانية عن طريق تعليقها في ماء معقم ثم أجرِ عملية طرد مركزي أخرى بعد التدوير.

قم بإزالة الماصة واملأ الأنبوب بـ 3.75 milliliters من الماء المعقم. أضف one milliliter من مبيض منزلي و 250 microliters من sodium hydroxide بتركيز 10 normal، ثم اخلط المزيج فوراً عن طريق القلب من خمس إلى ست مرات. ضع الأنبوب في جهاز تدوير (rotator) بعد تعريض الديدان للمبيض لمدة أربع دقائق.

ضع الأنبوب تحت مجهر ستيريو. يجب أن تكون معظم البالغين قد تحللت. رج الأنبوب بقوة من 15 إلى 20 مرة للمساعدة في تحلل أي ديدان بالغة متبقية؛ وبعد أن تستغرق عملية التحلل خمس دقائق إجمالاً، أضف ماءً معقماً حتى يمتلئ الأنبوب.

اخلط عن طريق القلب من خمس إلى ست مرات لتجميع البيض. قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة دقيقة واحدة عند 500 RCF. اغسل البيض ثلاث مرات عن طريق إعادة التعليق، من خلال خلطهم في 10 milliliters من الماء المعقم، ثم الطرد المركزي وإزالة السائل الطافي.

بعد ذلك، قم بتخفيف عينة بحجم 100 µL من البيض بمقدار 100 ضعف عن طريق إضافة 10 mL من NGM buffer. ثم انقل باستخدام الماصة ثلاث حصص بحجم 5 µL لكل منها على غطاء طبق بيتري تحت المجهر. قم بعدّ عدد البيض في ثلاث حصص منفصلة بحجم 5 µL.

لتقدير العدد الإجمالي للبويضات، أضف من 200,000 إلى 2 مليون بويضة إلى القارورة المحتوية على NGM buffer، ثم قم برجّ المزرعة بسرعة 100 RPM عند درجة حرارة 20 degrees Celsius. بعد مرور 16 ساعة على الأقل من إضافة البويضات إلى القارورة، استخدم ماصة سيرولوجية معقمة لسحب 0.5 milliliters تقريبًا من مزرعة الديدان المعلقة.

قم بنقل ثلاث قطرات بحجم 5 µL باستخدام الماصة إلى الغطاء المعقم لطبق بتري. ضع الغطاء في مجمد بدرجة حرارة -20 °C لمدة دقيقة إلى دقيقتين لشل حركة الديدان. وبمجرد شل حركتها، قم بحساب متوسط عدد الديدان الحية التي فقست لكل 5 µL باستخدام مجهر ستيريو لتقدير العدد الإجمالي.

قم بإذابة المزرعة البكتيرية المجمدة من سلالة OP 50 التي تم تحضيرها مسبقاً عن طريق وضعها على طاولة المختبر لبضع دقائق. بعد ذلك، أضف 3 mL من OP 50 بتركيز 50% لكل 500,000 من الديدان التي فقست. رج القارورة بسرعة 100 RPM عند درجة حرارة 20 °C.

ستتطور الديدان إلى يرقات من المرحلة الرابعة L4 ومراحل البلوغ المبكرة خلال 51 ساعة تقريبًا. راقب كمية البكتيريا طوال فترة الحضانة عن طريق الفحص البصري. أضف المزيد من البكتيريا إذا أصبح الوسط شفافًا.

استخدم ماصة سيرولوجية معقمة لنقل حوالي 0.5 milliliters من مستنبت الديدان المعلق إلى طبق أغار NGM قياسي. افحص الديدان باستخدام مجهر ستيريو للتأكد من أن معظمها في طور اليرقات L four والبالغين اليافعين؛ فبموجب المجهر ذو الحقل المضيء، ستظهر لدى يرقات L four بقعة بطنية شفافة في منتصف الجسم، بينما يكون البالغون اليافعون أكبر حجماً قليلاً ولا تظهر لديهم هذه البقعة الشفافة.

بعد ذلك، اسحب مزرعة الديدان إلى أنابيب معقمة سعة 50 milliliter. ضع الأنابيب في حامل أنابيب اختبار داخل غطاء التدفق الصفائحي واترك البيوض غير المفقسة أو الديدان التي لم تتطور تترسب. تترسب هذه العناصر ببطء أكبر من الديدان المتطورة.

بعد مرور 10 دقائق، قم بإزالة السائل الطافي، الذي يحتوي على الديدان غير الفقسة وغير المتطورة، عن طريق الشفط، ثم أضف ما يقرب من 10 milliliters من منظم NGM إلى كل راسب وقم بتعليق الديدان عن طريق تدوير الأنابيب بلطف. اجمع كل الديدان في أنبوب واحد سعة 50 milliliter. ثم قم بالطرد المركزي في جهاز طرد مركزي ذو دلو متأرجح عند 500 RCF لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك، أعد تعليق الديدان في 50 milliliters من وسط NGM مع 1%lb لغسلها. كرر هذه العملية، واغسلها من ثلاث إلى أربع مرات لإزالة البكتيريا بعد الغسل. املأ الأنبوب بـ NGM بالإضافة إلى LB buffer حتى 50 milliliters.

صب هذا المزيج في دورق مخصص لتوزيع الديدان يحتوي على قضيب تحريك، وضعه على لوح تحريك. يلزم توفر حد أدنى يبلغ حوالي 20 milliliters أو 60,000 دودة لملء الحيز الميت في دورق التوزيع وخرطوشة الموزع. قم بعدّ عدد الديدان في ثلاث قطرات بحجم 5 µL كما تم توضيحه مسبقاً.

بعد العد في وسط NGM مضافًا إليه LB للوصول إلى تركيز يتراوح من 12 إلى 15 دودة لكل قطرة بحجم خمسة µL، يحتاج كل طبق بـ 84 بئرًا إلى حوالي 35,000 دودة أو 11.5 mL من الديدان المعلقة. قم بتحميل كاسيت توزيع سعة 10 µL في الموزع وعقمه عن طريق التطهير بـ 70% ethanol. اشطف الـ ethanol عن طريق التطهير بالماء المعقم.

أدخل طرف كاسيت التوزيع في الدورق بحيث يكون فوق قضيب التحريك مباشرة دون إعاقة حركته. تأكد من بقاء الديدان معلقة في جميع أنحاء الدورق. قم ببرمجة الموزع لتوزيع الديدان بسرعة منخفضة مع نبضتين تمهيديتين، وقم بتشغيل 10 milliliters على الأقل من الديدان المعلقة.

املأ ألواح معايرة الميكرو (microtiter plates)، والتي يجب أن تحتوي بالفعل على المركبات المختبرة، بسرعة لمنع الديدان من الاستقرار في الأنابيب. وهنا يتم وضع المركب المختبر الذي تم تحميله مسبقًا على لوح معايرة الميكرو. Glow. قم بإغلاق الألواح بشريط لاصق مسامي لمنع تجمع الغبار في الآبار.

ضع الأطباق على منصة هزازة داخل حاضنة في درجة الحرارة المناسبة للمقايسة. تجنب تكديم الأطباق لأن ذلك قد يعيق تدفق الهواء. ضع الطبق المستهدف في قارئ الأطباق الدقيقة (microplate reader) لقياس شدة الفلورة لكل بئر باستخدام أطوال موجات الانبعاث والاستثارة المناسبة هنا.

تكون المرشحات المستخدمة لـ GFP عند طول موجي للتحفيز يبلغ 485 وطول موجي للانبعاث يبلغ 528. أما المرشحات الخاصة بـ RFP فهي عند طول موجي للتحفيز يبلغ 540 وطول موجي للانبعاث يبلغ 590. بعد قراءة الطبق، احسب نسبة GFP إلى RFP وقم بتطبيع النتائج باستخدام قراءات آبار التحكم، التي لا تحتوي على المركب المنشط، وذلك لتحديد الفرق الدقيق في أضعاف شدة الفلورة الناتجة عن كل معالجة على حدة.

يعتمد مقايسة SSKN الموضحة هنا على تقرير مزدوج مدمج كروموسومياً، وهي سلالة تم فيها عد الديدان يدوياً باستخدام مجهر ستيريو. وقد ارتبط عدد الديدان بالحجم الموزع بقيمة R squared بلغت 0.94 وقيمة p أقل من 0.0001. ويشير ذلك إلى أنه يمكن التحكم في عدد الديدان الموزعة في كل بئر عن طريق ضبط الحجم الموزع.

يظهر إجمالي فلورة GFP لكل بئر على اليسار وفلورة RFP لكل بئر على اليمين قابلية عالية للتكرار من بئر إلى آخر عبر لوحة تحتوي على 384 بئراً في هذه الأشكال. تشير XS إلى الفلورة النسبية المقاسة في كل بئر. وتشير الخطوط المتصلة إلى المتوسطات، بينما تشير الخطوط المتقطعة إلى ثلاثة انحرافات معيارية فوق أو تحت متوسط الفلورة لجميع الآبار، حيث كان معامل الاختلاف أقل من 9%. وكما هو موضح في هذا الشكل، فإن فلورة GFP من محفز GST four ترتبط خطياً بفلورة RFP من محفز DOP three عبر 384 بئراً بقيمة R squared تبلغ 0.62 وقيمة p أقل من 0.0001.

وبناءً على ذلك، يمكن استخدام مراسل RFP غير القابل للحث لمعايرة مراسل GFP القابل للحث. وعند التعبير، تصبح نسبة فلورية GFP إلى RFP قابلة للتكرار بدرجة عالية من بئر إلى آخر عبر لوحة ذات 384 بئراً.

أدى حساب نسبة GFP إلى RFP إلى تقليل معامل الاختلاف إلى أقل من 6%، مما يثبت قدرة مراسل RFP ذي المحفز الثلاثي DOP على تقليل التباين كما هو موضح هنا. إن تحريض GFP بالنسبة إلى RFP باستخدام مادة xeno biotic منشطة لـ SK N one قوي وقابل للتكرار بدرجة عالية عبر لوح يحتوي على 384 بئرًا، وقد تم تمييز متوسطات نسب الفلورة النسبية لجميع آبار التحكم وآبار due GLO بخطوط متصلة. كما تم تمييز ثلاثة انحرافات معيارية فوق متوسط التحكم وتحت متوسط dlo بخطوط متقطعة.

بمجرد إتقان هذه العملية، يمكن البدء في إنشاء مزرعة ديدان في غضون ساعة واحدة تقريبًا في اليوم الأول، بينما تستغرق عملية الجمع والتوزيع حوالي ساعتين إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم التذكر البدء بما لا يقل عن 60,000 دودة والحفاظ على تعليقها أثناء التوزيع. باتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء عمليات فحص أخرى، على سبيل المثال، تقارير السلاسل للمسارات الأخرى القابلة للاستحثاث، وذلك من أجل تطوير مُعدِّلات لمسارات أخرى بعد تطويرها.

يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجالات الفحص عالي الإنتاجية والاستشعار الحيوي لتحديد معدلات المسارات للجزيئات الصغيرة بسرعة أو الكشف عن الملوثات البيئية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استزراع وتوزيع وقياس سلالات *elegans* الفلورية لغرض الفحص عالي الإنتاجية لمسارات النسخ القابلة للتحفيز أو اختبار عينات متعددة بحثاً عن الملوثات البيئية.