عزل الخلايا الجذعية الأنف الشم من القوارض أو البشر

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الجذعية الشمية الأنفية من الجرذان أو البشر من أجل تحديد الشذوذات الجزيئية أو إصلاح الدماغ المصاب بآفة مرضية أو إصابة رضحيّة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع خزعات من المخاطية الشمية جراحياً من التجويف الأنفي. بعد ذلك، يتم التخلص من الظهارة الشمية وخلاياها الجذعية الظهارية للتركيز على الخلايا الجذعية الميزنشيمية الخارجية في الصفيحة المخصوصة الكامنة تحتها، ثم عزل تلك الخلايا عن طريق تفكيك أنسجة القوارض، أو جمع الخلايا النامية من الغروس البشرية المستزرعة تحت شرائح زجاجية غطائية.

تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تنمية كرات الخلايا الجذعية لتحفيز تمايزها إلى خلايا شبيهة بالعصبونات. وفي النهاية، يتم استخلاص الغشاء المخاطي الشمي بالكامل، والخلايا الجذعية الفردية. ويمكن استخدام الكرات العائمة أو الخلايا الشبيهة بالعصبونات لتحديد المؤشرات الجزيئية في أمراض الدماغ أو لإصلاح التلف في الجهاز العصبي.

نصف في هذا المقطع طريقتها في عزل الخلايا الجذعية الأنفية البشرية والخاصة بالقوارض من الغشاء المخاطي الشمي. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أن هذه الخلايا الجذعية تنتمي إلى نسيج عصبي، ويسهل الوصول إليها في كل فرد حي، ويمكن استخدامها لتشخيص الدماغ المرضي أو إصلاحه. وبصفتي جراح أنف وأذن وحنجرة، فقد أجريت المئات من الخزعات الأنفية لدراسات سريرية وظيفية.

هذا الإجراء آمن ويمكن تنفيذه، وذلك تحت تأثير التخدير العام الموضعي. أنا باحث مبتدئ متخصص في استزراع الخلايا الجذعية البشرية أو الخلايا العصبيّة أو الخلايا الأنفية أو الخلايا العاملة.

تُظهر هذه الخلايا معدل تكاثر مرتفعاً وميلًا للتمايز إلى أنواع الخلايا العصبية. وقد ثبتت فعاليتها في النماذج الحيوانية لفقدان الذاكرة ودعم علاج الأمراض الحسية. وقبل جمع المخاطية، يتم تجهيز خزعات في 3 أطباق بتري بقطر 35 ملم تحتوي على وسط زراعة DMEM Ham, F 12 داخل غطاء زراعة معقم.

الآن، بعد التحقق من وصول الجرذ إلى حالة التخدير العميق عن طريق قرصة أصابع القدم باستخدام صوديوم بنتوبيتال، يتم القتل الرحيم عن طريق فصل الرأس. اعزل الرأس وقم بإزالة الجلد. قم بإزالة الفك السفلي باستخدام المقص، وبمساعدة ملقط، قم بإزالة العضلات الوجهية على كلا الجانبين بدءاً من المنطقة الواقعة خلف القواطع.

باستخدام Ron Jur، قم بإزالة العظم الذي يغطي التجويف الأنفي جهة تلو الأخرى. ستظهر القرينات الشمية كأعضاء ذات لون برتقالي أو بني تقع في الجزء الخلفي من الأنف؛ قم بإزالة القرينات بعناية باستخدام الملقط.

باستخدام إبرة قياس 26، اعزل المخاطية الشمية الموجودة على الحاجز الأنفي عن طريق قطع النسيج على طول ثلاثة خطوط: قوس الصفيحة العمودية، والصفيحة المائلة (cribriform plate)، وسقف التجويف الأنفي. اجمع الخزعات من كلا الجانبين وانقلها إلى طبق بتري مملوء بوسط A-D-M-E-M ham F 12. يجب ألا تستغرق هذه العملية أكثر من 10 دقائق من بدء القتل الرحيم.

الآن، ومن أجل إزالة المخاط، يتم نقل الخزعات مرتين في أطباق بتري مملوءة بالوسط الزرعي. ووفقاً للجان الأخلاقية المحلية ذات الصلة، يجب أن يقوم جراح أنف وأذن وحنجرة بإجراء هذه العملية، كما يجب على كل مريض خارجي التوقيع على نموذج موافقة مستنيرة، وذلك باستخدام منظار صلب بزاوية صفر درجة أو 30 درجة. افحص كلا التجويفين الأنفيين وقيم الوجود المحتمل للسلائل أو أي آفات التهابية.

اختر أفضل تجويف أنفي مع مراعاة انحراف الحاجز الأنفي. وباستخدام مسحة قطنية، ضع مخدرًا موضعيًا مثل lidocaine مع epinephrine لمدة 10 دقائق مع ضمان التغلغل. استخدم ملقط الغربالية لجمع خزعة بمساحة مربعين مليمترين إما عند جذر الجانب الإنسي للقرينة الوسطى أو على الحاجز في المنطقة الظهرية الإنسية.

نوضح هنا الخزعة المأخوذة من منطقة الجذر. ثم تُنقل خزعة الشم باستخدام إبرة معقمة إلى أنبوب معقم سعة 2 mL مملوء بـ 1 mL من DMEM hem F 12. اقلب الأنبوب رأساً على عقب للتأكد من غمر الخزعة في وسط الزرع.

ضع الأنبوب في حاوية مبردة وانقله إلى مختبر الأبحاث. في هذه المرحلة، يمكن استخدام الخزعة بحد ذاتها لإجراء دراسات جزيئية مقارنة تركز على أمراض دماغية محددة أو معالجتها لتوليد خلايا جذعية. اغسل الخزعات البشرية أو خزعات الجرذان وDMEM ham F 12 ثم حضن الخزعات في طبق بتري مملوء بـ 1 mL من المعجون.

يُترك المحلولان لمدة ساعة واحدة عند 37 degrees celsius. بعد ذلك، يتم فصل الظهارة الشمية البشرية أو الجرذية عن الصفيحة المخصوصة الكامنة أسفلها باستخدام ملعقة دقيقة تحت مجهر تشريحي مزود بضوء معكوس منكسر. تظهر الظهارة الشمية شفافة فوق خلفية سوداء مقارنة بالصفيحة المخصوصة، التي تظهر مخططة باللون البني البرتقالي فوق خلفية بيضاء.

تبدو الظهارة باللون الرمادي والصفيحة المخصوصة باللون البني؛ وبمجرد تنقيتها، تُنقل الصفيحة المخصوصة إلى طبق بتري مملوء بوسط DMEM hem F 12. إذا كانت الأنسجة مأخوذة من قارض، تُقطع الصفيحة المخصوصة إلى قطع صغيرة باستخدام إبرتين بقياس 25 gauge. ثم تُنقل القطع إلى أنبوب سعة 15 milliliter مملوء بـ 1 milliliter من collagenase one A، وباستخدام ماصة بلاستيكية معقمة، يتم تفكيك الأنسجة داخل الأنبوب.

بعد ذلك، يتم تحضين الأنبوب لمدة 10 دقائق عند 37 °C. ولإيقاف عملية التفكك، يتم رج الأنبوب برفق وإضافة ملليلترات من PBS خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم، ثم يتم إجراء الطرد المركزي عند 200 ×g لمدة خمس دقائق. أعد تعليق كريات الخلايا في وسط الزرع ووزعها على أطباق زرع بلاستيكية.

الآن، إذا كانت الأنسجة بشرية، قم بتقطيع الليمون بشكل مناسب إلى ثلاث أو أربع قطع. ضع كل شريحة في بئر مستقل بقطر 2 سنتيمتر داخل طبق يحتوي على أربعة آبار، ثم غطِّ الأنسجة بـغطاءات زجاجية معقمة بقطر 1.3 سنتيمتر.

بعد ذلك، أضف 500 µL من وسط الزرع إلى كل طبق زرع لكلا نوعي الأنسجة. قم بتجديد وسط الزرع كل يومين إلى ثلاثة أيام. وبعد استزراعها لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام، ستبدأ الخلايا الجذعية في غزو طبق الزرع.

وبعد مرور أسبوعين، يجب أن تصبح الخلايا متلاحمة. وعند الوصول إلى حالة التلاحم، يتم تمرير الخلايا ونقلها إلى دوارق زراعة لإنتاج كرات الخلايا الجذعية.

أعد زراعة الخلايا بكثافة 16, 000 خلية لكل سنتيمتر مربع في دوارق معالجة مسبقاً كل يومين. قم بتغذية الخلايا بـ 0.2 ملليلتر لكل سنتيمتر مربع من الوسط الغذائي المكمل. وبعد مرور يومين إلى خمسة أيام، اجمع الكريات الخلوية العائمة وقم إما بإعادة زراعتها أو تفكيكها قبل عملية التطعيم.

نموذج حيواني للعلاج الخلوي لتمايز الخلايا الجذعية الشمية إلى خلايا شبيهة بالعصبونات. تُزرع الخلايا لمدة 21 يوماً في وسط Neurobasal يحتوي على B 27 والبنسلين والستريبتومايسين والجلوتامين والجلوتامات، مع تغيير الوسط كل ثلاثة أيام. يجب أن تظهر الخلايا الشبيهة بالعصبونات بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع، أي بعد خمسة إلى سبعة أيام من عملية الزرع.

نمت الخلايا الجذعية الشمية البشرية الأنفية من قطعة النسيج المستأصل وتكاثرت بسرعة. ويمكن الوصول إلى درجة تلاقي خلوية كاملة في غضون أسبوع أو أسبوعين. وعند تقييم ميزة رئيسية للخلايا الجذعية، وهي التداخل والتعبير، حينما زُرعت على البولي ليسين باستخدام وسط زراعي خالٍ من المصل ومدعم بـ EGF و FGF two، أنتجت الخلايا الجذعية الشمية كرات خلوية، وعندما زُرعت هذه الكرات في وسط زراعي يحتوي على المصل.

الوسط، وأدت إلى ظهور مجموعات خلوية تحتوي على خلايا تعبر عن GFAP بنسبة 50% تقريباً، وخلايا تعبر عن tubulin بنسبة تصل إلى 15%، وخلايا تعبر عن oh four بنسبة تصل إلى 5%. وعندما زُرعت الخلايا المشتقة من الكريات في وسط زراعة neuro basal مُدعّم، تحول معظم المجتمع الخلوي إلى خلايا شبيهة بالعصبونات تعبر عن beta three tubulin. كما عبرت هذه الخلايا الشبيهة بالعصبونات ذاتها عن map two.

وبالتالي، يمكن تعديل مصير الخلايا الجذعية خلال فصل دراسي واحد. ويمكن لهذه التقنية أن تنتج بسهولة الملايين من الخلايا الجذعية في أقل من أربعة أسابيع، مما يسمح للأطباء بإجراء عمليات زرع خلايا ذاتية في المستقبل. وتعتبر خزعات الأنف المقاومة مفيدة جداً لتحديد المؤشرات الحيوية وأمراض الدماغ.

لقد نجحنا مؤخرًا في العثور على جينات مرشحة جديدة لمرض التوحد. وقد قمنا بالفعل بإنشاء بنك من الخلايا الجذعية الشمية مأخوذة من أفراد مصابين بالتوحد ومجموعات ضابطة، ويمكن توسيع هذا البنك ليشمل اضطرابات دماغية بشرية أخرى.