استخراج الحمض النووي من مادة البارافين جزءا لا يتجزأ من التحليلات الجينية واللا جيني

سيوضح هذا الفيديو كيفية استخلاص DNA من عينات الأنسجة المدمجة في البارافين. العينة المستخدمة في هذا العرض هي نسيج أسطواني، قطره ثلاثة مليمترات، وطوله ستة مليمترات. وبينما تم استخدام عينة أسطوانية واحدة في هذا العرض، يمكن معالجة عينات أكبر يزيد قطرها عن خمسة مليمترات وطولها عن 10 مليمترات، أو من اثنتين إلى ثلاث عينات أسطوانية بحجم العينة المستخدمة هنا في تفاعل واحد.

ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن التعديلات على البروتوكول قد تكون مطلوبة لضمان الإزالة الكاملة للبرافين وهضم الأنسجة. قبل القيام بأي إجراء على الأنسجة، يجب إذابة شمع البرافين الذي يحفظ الأنسجة. يتم تحقيق ذلك باستخدام الزيلين، وبما أن الزيلين والفينول مادتان سامتان، فيجب إجراء أي عمل بهذه الكيماويات داخل خزانة استخلاص الأدخنة، ثم أضف 800 µL من الزيلين إلى الأنبوب الذي يحتوي على عينتك.

بعد ذلك، ضع العينة على هزاز لمدة 10 دقائق مع الرج اللطيف. قم بتدوير العينة بسرعة 14,000 RPM لمدة ثلاث دقائق لترسيب العينة، ثم أزل الزيلين وقم بإذابة البارافين من الأنبوب. كرر هذه الخطوات مرتين أو ثلاث مرات حتى يذوب البارافين تمامًا.

يجب أن يظهر النسيج رطباً وليناً. ومن المهم إزالة جميع آثار البارافين لزيادة الحصيلة النهائية من الـ DNA. وبناءً على ذلك، تتطلب عينات الأنسجة الأكبر حجماً عمليات غسيل إضافية.

بعد إزالة البارافين من العينة، يجب إعادة ترطيب النسيج للسماح بهضم النسيج. ويتم ذلك باستخدام سلسلة إعادة ترطيب بالإيثانول. أولاً، أضف 800 µL من الإيثانول بتركيز 100% إلى العينة، ثم قم بخلطها باستخدام جهاز الفورتكس وتدوير العينة بسرعة 14,000 RPM لمدة ثلاث دقائق.

قم بإزالة السائل الطافي. كرر هذه الخطوات باستخدام 800 µL من 70% ethanol، ثم باستخدام 50% ethanol. يجب أن تستغرق عملية الطرد المركزي النهائية خمس دقائق لأن الأنسجة ستكون أقل تماسكاً وتتطلب قوة أكبر لترسيبها.

الآن يجب هضم النسيج لتحرير الـ DNA من الخلايا. يتم ذلك باستخدام محلول التحلل (lysis buffer)، وهو محلول يتكون من مواد مكسرة للبروتين، مثل SDS وبروتيناز K (proteinase K)، وهو الإنزيم المسؤول عن تفكيك النسيج.

أضف من 200 إلى 500 µL من محلول التحلل (lysis buffer) إلى العينة. وبناءً على الحجم، يُعد استخدام 400 µL حجماً مناسباً. وبالطبع، تعمل مكونات محلول التحلل بالإضافة إلى درجة حرارة الحضن البالغة 56 °C على رفع نشاط البروتين إلى الحد الأقصى.

بما أن ACE K بروتين، فإن قدرته على تفكيك الأنسجة محدودة زمنياً، لذا يجب إضافة المزيد من الإنزيم بشكل دوري لاستمرار التفاعل. يتم إضافة 20 µL من بروتين ACE K بتركيز 10 mg/mL إلى العينة صباحاً ومساءً حتى تذوب الأنسجة تماماً.

عندما لا تعود هناك أنسجة صلبة مرئية، يجب استخلاص الـ DNA من محلول خ열 الـ cellular debris. يُستخدم الفينول المشبع لفصل العينة إلى طورين مائي وعضوي، حيث يحتوي الطور المائي على الـ DNA.

من المهم استخدام الفينول المشبع بالمحلول المنظم، لأن حمضية الفينول العادي لا تؤدي إلى تكسير الحمض النووي DNA فحسب، بل تؤدي أيضاً إلى عكس ترتيب طبقتي الطور المائي والطور العضوي. يرجى ملاحظة أن الفينول المشبع بالمحلول المنظم يُخزن في طورين، حيث يشكل الفينول الطبقة السفلية.

أضف حجماً مساوياً من الفينول المشبع بالمحلول المنظم إلى العينة واقلب الأنبوب عدة مرات. بعد ذلك، ضع العينة في جهاز الطرد المركزي وقم بتدويرها بسرعة 14,000 RPM لمدة خمس دقائق لتحفيز فصل الأطوار.

سيتواجد الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA في الطور المائي العلوي، بينما توجد البروتينات والليبيدات والبوليسكريدات في الطور البيني والطور العضوي السفلي. قم بإزالة الطبقة المائية بعناية دون تعكير الطور البيني وانقلها إلى أنبوب جديد. غالبًا ما يكون الطور البيني غير مستقر بعد عملية الطرد المركزي الأولى.

يجب إجراء عمليات الاستخلاص باستخدام أحجام صغيرة من الماء. يمكن العثور على بروتوكول عمليات الاستخلاص العكسي في النص المصاحب لهذا الفيديو. تُكرر هذه الخطوات حتى يصبح السطح الفاصل صافياً، وهو ما يتحقق عادةً بعد ثلاث إلى خمس تكرارات، ثم يتم المتابعة بإضافة حجم مساوٍ من الفينول كلوروفورم، وكحول الإيزوأميل إلى عينة DNA.

يؤدي هذا الغرض نفسه الذي يؤديه الفينول بمفرده، ولكنه يعمل على جعل الواجهة الفاصلة أكثر حدة لزيادة عائد DNA إلى أقصى حد. كرر هذا الإجراء مرة أو مرتين حتى تصبح الواجهة الفاصلة صافية وحادة. وبما أن عينتك الآن خالية من البروتين، يجب إزالة أي RNA ملوث.

يتم تحقيق ذلك بواسطة جزيئات الـ RNA. تُضاف مادة RNAase إلى العينة بتركيز نهائي قدره 100 µg/mL، وتُحضن العينة لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 °C. وبعد تحلل الـ RNA، يجب إزالة إنزيم RNAase.

تُكرر إجراءات تنقية الـ DNA كما سبق. وعند استخدام الفينول المشبع بالمحلول المنظم أولاً، ثم الانتقال إلى مزيج الفينول والكلوروفورم وكحول الأيزواميل، ستكون هناك حاجة إلى خطوات تنقية أقل، حيث أن التلوث الوحيد حالياً هو إنزيم RNA A والـ RNA المتحلل. وبما أن العينة الآن تحتوي على DNA فقط، يجب ترسيب الـ DNA من المحلول؛ أضف جزءاً واحداً من عشرة من حجم أسيتات الصوديوم وحجم واحد من الإيزوبروبانول.

وبدلاً من ذلك، يمكن إضافة حجمين ونصف من الإيثانول، ولكن سيتطلب ذلك استخدام أنبوب أكبر. تُحضن العينة عند درجة حرارة 20- °C لمدة تتراوح من 30 دقيقة إلى ساعة، أو في حال كنت تعمل في وقت متأخر من الليل. وبما أنك تتعامل الآن مع DNA، فتأكد من إبقاء العينة على الثلج لمنع تحللها.

قم بتركيز العينة باستخدام جهاز الطرد المركزي بسرعة 14,000 RPM لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لترسيب الحمض النووي DNA المترسب. قم بإزالة السائل الطافي مع الحرص على عدم تحريك الراسب لإزالة الأملاح الزائدة التي قد تتداخل مع التجارب اللاحقة مثل التسلسل الجيني. على سبيل المثال، أضف 1 mL من الإيثانول 70% المبرد وقم بإعادة تعليق العينة بلطف.

قم بطرد العينة مركزياً مرة أخرى بسرعة 14,000 RPM لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. أزل السائل الطافي بعناية واترك أي إيثانول زائد ليجف في الهواء لمدة تصل إلى خمس دقائق. من المهم عدم تجفيف العينة بشكل مفرط.

وأخيراً، يتم تنقية الـ DNA ويصبح جاهزاً لإعادة تعليقه في المحلول المنظم الذي تختاره. نستخدم هنا ماءً مقطراً ومعقماً بجهاز الأوتوكلاف. تماماً.

تُحفظ عينات DNA عند درجة حرارة 20- درجة مئوية لاستخدامها لاحقاً. وبعد اكتمال عملية الاستخلاص، يجب تقييم جودة وكمية الـ DNA. ويتم ذلك عن طريق القياس الطيفي باستخدام جهاز NanoDrop 3000، حيث يتم ضبط نوع القياس على الأحماض النووية (nucleic acid)، واختيار DNA 50 كمعامل للحساب، ثم تهيئة الجهاز باستخدام 1.5 µL من الماء.

قم بتنظيف القاعدة وخذ قياساً فارغاً باستخدام 1.5 µL من المذيب، وهو في هذه الحالة الماء المقطر. قم بتنظيف القاعدة وضع 1.5 µL من العينة ثم اضغط على زر القياس. نعم. ممتاز.

تعتبر نسبة A260/A280 التي تبلغ 1.8 مثالية في هذه المرحلة. وبذلك يصبح الحمض النووي (DNA) جاهزاً للاستخدام في التطبيقات اللاحقة، والتي تشمل على سبيل المثال لا الحصر: المصفوفات الدقيقة (Arrays)، والتهجين الجينومي المقارن، والترسيب المناعي للحمض النووي الميثيلي (Methylated DNA immunoprecipitation)، والتسلسل الجيني.

تظهر هنا الروابط الخاصة بهذه البروتوكولات، في حال لم تكن هناك حاجة إليها على الفور. احفظ عيناتك في درجة حرارة -20 °C لاستخدامها لاحقاً.