المسلكة الفأرية العدوى : نموذج من الحصانة من النوع 2 والتهاب في القناة الهضمية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء وصيانة نموذج عدوى طبيعية بالديدان الخيطية. أولاً، تُعدى الفئران ببيوض *Trichuris muris* عن طريق التغذية القسرية الفموية. وبعد 21 يوماً، يتم قتل الحيوانات المصابة رحيماً، ثم يتم جمع الدم، والعقد اللمفاوية المساريقية، والكرات البرازية، والقولونات، والأعور.

باستخدام هذه العينات، يمكن تحليل الاستجابة المناعية المتولدة ضد tricks. Mirrors. كما يمكن تحليل عينات المصل بواسطة lysa للكشف عن الأجسام المضادة النوعية لـ TRA.

يمكن إجراء إعادة تحفيز خلايا العقد اللمفاوية في المختبر (In vitro) لتحليل الاستجابات المناعية الخلوية. ويمكن استخدام كرات البراز في تحليل لطخة ويسترن (Western blotter) لتقييم محتوى البروتين، كما يمكن إجراء تحليل التعبير الجيني عن طريق تحليل QPCR للقولون. وأخيراً، يمكن استخدام طرف الأعور لإجراء الفحص النسيجي، بينما يمكن استخدام بقية الأعور لتحديد عبء الديدان في الفئران المصابة.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج توضح ما إذا كان الفأر مقاوماً أو عرضة للعدوى بـ trais MOUs، كما يمكن توصيف الاستجابة المناعية التي تتشكل ضد الطفيلي. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة محورية في مجال علم المناعة، مثل العوامل التي تتحكم في تنشيط الخلايا التائية المساعدة، وكذلك البروتينات المطلوبة لتمايز خلايا TH two. يمكن تكثير بيوض Trauss MOUs في الفئران التي تعاني من نقص المناعة أو السلالات القابلة للإصابة وراثياً مثل a KR بعد 35 يوماً من العدوى لجمع البيوض من الفئران التي تم القتل الرحيم لها.

اكشف عن السطح البطني للحيوان واغسل بطن الفأر بالإيثانول باستخدام ملاقط ومقصات معقمة. أمسك بجلد البطن واصنع شقاً صغيراً. اكشف عن محتويات البطن، وحدد الأعور والقولون الداني، ثم قم بإزالتهما.

انقل الأعضاء إلى طبق بتري بقطر 10 سنتيمتر يحتوي على وسط DMEM المكمل بالبنسلين والستربتومايسين. بعد ذلك، قم بفتح الأعور والقولون القريب باستخدام الملاقط لكشف التجويف والديدان. ضع الأعضاء المفتوحة في دورق يحتوي على PBS ورجّه بلطف لغسل الفضلات.

بمجرد غسل الأعور، انقله إلى أطباق بتري جديدة واستخدم ملقطاً منحنياً وسلساً لسحب الديدان بلطف. انقل جميع الديدان من كل فأر إلى عين واحدة من طبق بستة عيون يحتوي على 5 mL من وسط DMEM المدعم بالمضادات الحيوية. ضع الطبق ذو الست عيون مع منشفة ورقية مبللة داخل حاوية Tupperware واحضنه عند 37 °C لمدة أربع ساعات للسماح للديدان بوضع البيض.

بعد هذه الحضانة، استخدم الملقط لإزالة الديدان من البئر الأصلي وتوزيعها على بئرين جديدين يحتويان على DMEM. سيؤدي تقسيم الديدان بهذه الطريقة إلى زيادة استعادة البويضات باستخدام الماصة إلى الحد الأقصى. قم بجمع الوسط المتبقي الذي يحتوي على المستضد المفرز والبويضات من البئر الأصلي وانقله إلى أنبوب فالكون سعة 15 ملليلتر.

قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 3000 RPM لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة وحفظ السائل الطافي الذي يحتوي على المستضد لمدة أربع ساعات، واغسل الراسب الموجود في الأنبوب باستخدام ماء معقم. ضع الطبق ذو الست فتحات الذي يحتوي على الديدان عند 37 درجة Celsius مرة أخرى واحضه طوال الليل حتى صباح اليوم التالي.

بعد التخلص من الديدان، اجمع محتويات الآبار كما هو موضح سابقاً وقم بطرد مركزي للسائل الطافي لعزل البيض. احفظ السائل الطافي الذي يحتوي على المستضد الذي تم تحضيره طوال الليل، ثم أعد تعليق البيض في الماء. وكما سبق، ادمج هذا البيض مع البيض الذي تم الحصول عليه من فترة الحضانة التي استمرت أربع ساعات.

قم بترشيح البيض عبر مصفاة بمسام 70 micron لإزالة أي ديدان متبقية. ثم انقلها إلى دورق مربع بحجم 75 centimeter. غطِّ الدورق بورق ألومنيوم لحمايته من الضوء، واحفظ البيض لمدة ستة أسابيع في درجة حرارة الغرفة.

سيتيح ذلك للبيوض أن تنضج وتتطور إلى أجنة بعد ستة أسابيع. اغسل البيوض وقم بتصفية المياه ثم قم بعدّ البيوض الحية. كما هو موضح هنا.

كمثال على بيضة جنينية قابلة للحياة وأخرى غير قابلة للحياة، يتم ثني تركيز Exeter بمقدار 50 لكل 50 µL. في هذه المرحلة، يمكن تخزين البيض عند درجة حرارة 4 °C قبل إصابة الفئران. تأكد من إعادة تعليق المحلول المحتوي على البيض جيداً.

انقل الكمية المطلوبة من اللقاح إلى أنبوب ذو غطاء محكم سعة 14 milliliter واقلب الأنبوب للمزج. اسحب 200 microliters من البيوض باستخدام إبرة تغذية ذات حجم مناسب لحجم الحيوان، مثبتة على سرنجة سعة one milli liter. أمسك الفأر من منطقة الرقبة (scruff) وقم بإعطاء البيوض عن طريق التغذية القسرية الفموية (oral gavage).

أعد الفأر المصاب إلى قفصه واترك العدوى تستمر لمدة 21 يوماً. بعد مرور 21 يوماً، استخدم حقنة غير مجهزة بالهيبارين لسحب دم الفئران المصابة عن طريق ثقب القلب. وبعد القتل الرحيم باستخدام ثاني أكسيد الكربون، يمكن تخزين عينات الدم في درجة حرارة أربع درجات مئوية.

لعزل المصل وتحليل الأجسام المضادة IgG و IgE النوعية لـ tra بواسطة تقنية Eliza. قم بتعريض التجويف البطني للفأر كما تم وصفه سابقاً. ثم استخدم الملقط لسحب الأعور باستخدام مقص أو زوج آخر من الملاقط.

ادفع الأمعاء الدقيقة نحو اليمين للكشف عن العقد اللمفاوية المساريقية. قم بإزالة العقد اللمفاوية برفق مع الحرص على عدم جرح الأمعاء، وضعها في أنبوب Falcon سعة 15 milliliter يحتوي على 2 milliliter من الوسط الغذائي. يمكن لاحقاً استزراع خلايا العقد اللمفاوية في المختبر (in vitro) باستخدام طافي المستضد S من مزارع الديدان لمدة أربع ساعات لتحليل الاستجابة المناعية الخلوية تجاه الطفيلي.

بمجرد حصاد العقد الليمفاوية، يتم استئصال الأعور والقولون كما وُصف سابقاً؛ وباستخدام الملاقط، يتم تحرير الكريات البرازية من القولون القاصي ووضعها في أنبوب أكسجين سعة 2 mL. يمكن تخزين الكريات عند درجة حرارة -20 °C وتحليل محتواها البروتيني بواسطة تقنية western blot. وباستخدام المقص، يتم قطع حوالي 1 cm من القولون الداني ووضعه في أنبوب يحتوي على RNA، ثم يُخزن لاحقاً عند درجة حرارة 4 °C.

اقطع حوالي خمسة مليمترات من طرف الأعور مع الإمساك بطرفه باستخدام الملقط. استخدم حقنة سعة ثلاثة مليمتر وبإبرة مقاس 22 لغسل العينة بـ PBS. ثم انقلها إلى أنبوب فلكون (flk) وسدادة ضاغطة سعة خمسة مليمتر تحتوي على 4% paraldehyde.

يمكن تخزين عينة الأعور المثبتة بالبارالدهيد عند درجة حرارة 4 °C واستخدامها في التحليل النسيجي. ضع الجزء المتبقي من الأعور في طبق بتري وجمدة عند درجة حرارة -20 °C لقتل الديدان. ولتسهيل عملية العد، قم بإذابة عينة الأعور ووضعها باستخدام مقص في طبق بتري يحتوي على حوالي 5 mL من الماء.

قم بفتح الأعور لكشف التجويف ورجّه لجمع البراز في طبق. ضع الأعور النظيف في طبق بتري جديد يحتوي على الماء، واستخدم ملقطاً منحنياً وناعماً لكشط الخلايا الظهارية المعوية. انقل الأعور إلى طبق بتري جديد يحتوي على الماء وقم بتمزيق النسيج إلى قطع صغيرة.

افحص البراز، والخلايا الظهارية المعوية، وأنسجة الأعور تحت مجهر تشريحي وقم بتعداد الديدان، مع إزالتها أثناء العد ووضعها في طبق نظيف. هذا هو المظهر الذي يجب أن تبدو عليه الديدان في الأعور قبل وبعد العزل كما هو موضح هنا. بعد عدوى tragus mirrors، تتمكن فئران black six من السيطرة على الطفيليات، بينما تطور فئران KR أحمالاً طفيلية مرتفعة.

وبالمثل، تطور الفئران من سلالة A KR القابلة للإصابة عيارات أعلى بشكل ملحوظ من IgG النوعي لـ TRA مقارنة بالفئران من سلالة black six، وفقاً لما تم تحديده بواسطة مقايسة Eliza للمصل. وفي هذه التجربة، كشف تحليل Western blot أن كمية بروتين realm beta النوعي للخلايا الكأسية قد زادت في براز فئران black six، ولكن ليس في فئران A KR بعد العدوى. ويظهر التحليل النسيجي للأعور القاصي فرط تنسج الخلايا الكأسية وإنتاج المخاط في فئران TRAs MOUs المقاومة وفئران black six المصابة، ولكن ليس في فئران A KR القابلة للإصابة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تكثير بيوض trismus، وإصابة الفئران التجريبية، وجمع أنسجة الأمعاء، والمساريق، والعقد الليمفاوية المعوية، والدم لتحليل العدوى في الفئران القابلة للإصابة أو المقاومة.