Name: PCR متعددة وعكس الخط الفحص لطخة تهجين (mPCR / RLB) (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: تعلم تقنية PCR المتعدد وعكس الخط الفحص لطخة التهجين (mPCR/RLB) لاكتشاف الميكروبات والمسببات المرضية من العينات السريرية. هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ماثيو اوسوليفان وتشو فاي يتلقون الوطنية للصحة والبحوث الطبية الاسترالية مجلس البحوث الطبية منح الدراسات العليا.

<ol><li>O'Sullivan, M. V., Cai, Y., Kong, F., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+disk+separation+distance+on+accuracy+of+the+disk+approximation+test+for+detection+of+inducible+clindamycin+resistance+in+Staphylococcus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of disk separation distance on accuracy of the disk approximation test for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus spp.</a> J Clin Microbiol. 44, 4072-4076 (2006).</li>
<li>Zeng, X., Kong, F., Wang, H., Darbar, A., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+nine+antibiotic+resistance-related+genes+in+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of nine antibiotic resistance-related genes in Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization assay.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50, 204-209 (2006).</li>
<li>Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+single-+and+multilocus+sequence+typing+and+toxin+gene+profiling+for+characterization+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of single- and multilocus sequence typing and toxin gene profiling for characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> J Clin Microbiol. 45, 3302-3308 (2007).</li>
<li>Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+PCR-based+reverse+line-blot+hybridization+%28mPCR%2FRLB%29+assay+for+rapid+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29+typing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new multiplex PCR-based reverse line-blot hybridization (mPCR/RLB) assay for rapid staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) typing.</a> J Med Microbiol. 58, 1045-1057 (2009).</li>
<li>O'Sullivan, M. V., Kong, F., Sintchenko, V., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+transmission+in+hospitals+by+use+of+phage-derived+open+reading+frame+typing+enhanced+by+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission in hospitals by use of phage-derived open reading frame typing enhanced by multiplex PCR and reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 48, 2741-2748 (2010).</li>
<li>Wang, Q., Kong, F., Jelfs, P., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+phage+locus+typing+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%2C+using+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Extended phage locus typing of Salmonella enterica serovar Typhimurium, using multiplex PCR-based reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 57, 827-838 (2008).</li>
<li>Zhou, F., Kong, F., Tong, Z., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+less-common+Streptococcus+pneumoniae+serotypes+by+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 45, 3411-3415 (2007).</li>
<li>Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+identify+23+Streptococcus+pneumoniae+polysaccharide+vaccine+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes.</a> J Clin Microbiol. 44, 1887-1891 (2006).</li>
<li>Kong, F., Ma, L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+serotype+identification+of+Streptococcus+agalactiae+using+multiplex+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and serotype identification of Streptococcus agalactiae using multiplex PCR and reverse line blot hybridization.</a> J Med Microbiol. 54, 1133-1138 (2005).</li>
<li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+20+common+human+enterovirus+serotypes+by+use+of+a+reverse+transcription-PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of 20 common human enterovirus serotypes by use of a reverse transcription-PCR-based reverse line blot hybridization assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 2737-2743 (2009).</li>
<li>Zhou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+and+analysis+of+nonserotypeable+human+enteroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular identification and analysis of nonserotypeable human enteroviruses.</a> J Clin Microbiol. 48, 1276-1282 (2010).</li>
<li>Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+macroarray+based+on+16S-23S+rRNA+gene+internal+transcribed+spacer+sequences+for+rapid+identification+of+34+mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 mycobacterium species.</a> J Clin Microbiol. 44, 3544-3550 (2006).</li>
<li>Wang, H., Kong, F., Wang, B., McKechnie, M. L., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+polymerase+chain+reaction-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+to+detect+common+genital+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+STD+AIDS%22%5BJournal%5D)">Multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization assay to detect common genital pathogens.</a> Int J STD AIDS. 21, 320-325 (2010).</li>
<li>McKechnie, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+of+14+genital+microorganisms+in+urine+by+use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification of 14 genital microorganisms in urine by use of a multiplex PCR-based reverse line blot assay.</a> J Clin Microbiol. 47, 1871-1877 (2009).</li>
<li>Xiong, L., Kong, F., Zhou, H., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+PCR+and+reverse+line+blot+hybridization+assay+for+rapid+simultaneous+detection+and+serovar+identification+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis.</a> J Clin Microbiol. 44, 1413-1418 (2006).</li>
<li>Wang, Y., Kong, F., Yang, Y., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+%28mPCR%2FRLB%29+assay+for+detection+of+bacterial+respiratory+pathogens+in+children+with+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia.</a> Pediatr Pulmonol. 43, 150-159 (2008).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+%28mPCR%2FRLB%29+hybridisation+assay+for+the+rapid+identification+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Use of a multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridisation assay for the rapid identification of bacterial pathogens.</a> Clin Microbiol Infect. 14, 155-160 (2008).</li>
<li>Wang, H., Kong, F., Jelfs, P., James, G., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+identification+of+common+cell+culture+contaminant+and+pathogenic+mollicutes+strains+by+reverse+line+blot+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1483-1486 (2004).</li>
<li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR-based+reverse+line+blot+hybridization+assay+%28mPCR%2FRLB%29+-+a+practical+epidemiological+and+diagnostic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) - a practical epidemiological and diagnostic tool.</a> Nat Protoc. 1, 2668-2680 (2006).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الأسلوب mPCR / RLB تصاريح الكشف المتزامن لعدد كبير من amplicons PCR. نظرا لحساسية عالية للكشف التحقيق المستندة chemiluminescent ، يمكن استخدام واحد تفاعل PCR متعددة مع عدد كبير من أزواج التمهيدي لتضخيم قالب الحمض النووي. ويمكن الحصول عليها إذا لم إشارات التحقيق مع واحد أو أكثر من العينات ، وأداء الكهربائي للهلام مع أي منتج PCR المتبقية مساعدة على تمييز ما إذا كانت المشكلة هي مع التضخيم PCR أو التهجين التحقيق. حيث كل إشارات التحقيق على الغشاء ضعيفة أو غائبة ، لكنها تشير إلى نجاح هلام إستشراد PCR التضخيم ، وتشمل الاحتمالات مشاكل مع وسم الغشاء ، والتجديد غير صحيح من الغشاء بعد الاستخدام السابقة ، ودرجات حرارة غير صحيحة أثناء حضانة التهجين أو streptavidin ، أو معيبة ، streptavidin المتقارن البيروكسيداز أو كاشف الكشف. إذا تبين أن عينات مراقبة تحقيقات الفردية قد يكون منتجا لا يمكن أن يؤديها إشارات سلبية كاذبة ، واحد مع PCR جل المستندة إلى الكشف عن وتسلسلها لاحقة للتحقق من التضخيم من الناتج PCR والبحث عن الاختلاف في موقع تسلسل التحقيق ملزم. قد ضعف أو غياب إشارة التحقيق يكون راجعا إلى حجم كبير amplicon : إذا كان ذلك ممكنا ينبغي أن تكون جميع amplicons طول مماثلة وغليان أقل من 300. قد هياكل الحمض النووي الثانوي amplicons تنتج أيضا الفقراء ملزمة التحقيق ، وربما يستلزم إعادة تصميم أجهزة الاشعال. ويمكن أيضا التمهيدي الفردية أو تركيزات التحقيق تكون متنوعة لتحسين قوة الإشارة. ويمكن التحقيق إشارات إيجابية كاذبة بسبب التحقيق ملزم الاشعال nonamplified أو منتج التمهيدي - PCR ديمر عن طريق أداء واحد مع الجل القائم على الكشف وتسلسلها لاحقة. إذا حدث هذا ، إعادة تصميم تحقيقات قد يلزم. قد الطفرات نقطة في مواقع التحقيق ملزم يؤدي إلى إشارات ضعيفة أو غائبة. السماح تحقيقين لكل منتج تضخيم هذا يجعل من السهل اكتشافها. ويمكن استغلال هذه الخاصية مع الحذر والتصميم التمهيدي التحقيق للكشف عن تغيرات في الحمض النووي تسلسل الصغيرة المستهدفة. باختصار ، في حين أن هناك العديد من الأساليب للكشف عن المنتجات التالية متعددة تفاعلات PCR المتاحة ، mPCR / RLB لديها ميزة كونها عالية الإنتاجية وغير مكلفة مع انخفاض تكاليف الإعداد. المرونة في طريقة تسمح باستخدامه في لطائفة واسعة من التطبيقات.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> الكاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> 5 &#39;أمين C6 تعديل تحقيقات قليل النوكليوتيد </td><td> سيغما الدريخ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S - 8875 </td><td> أدلى 0.5 M الحل تصل إلى 8.4 درجة الحموضة </td></tr><tr><td> هيدروكسيد الصوديوم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S5881 </td><td> 0.1M الحل </td></tr><tr><td> 20xSSPE العازلة </td><td> Amresco </td><td> 0810 - 4L </td><td></td></tr><tr><td> سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> L - 4390 </td><td> يشكلون 10 ٪ محلول المخزون ، ينبغي أن لا الأوتوكلاف ، يمكن الاحتفاظ بها لمدة أقصاها أسبوع 1 قبل استخدام </td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic حمض (EDTA) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> E9884 </td><td> يشكلون 0.5 M الحل لتعديل درجة الحموضة 8.0 والأوتوكلاف </td></tr><tr><td> N - (3 - Dimethylaminopropyl) - N &#39;- ethylcarbodiimide هيدروكلوريد (EDAC) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> E7750 </td><td> تشكل حلا مل 20 16 ٪ فقط قبل استخدام باستخدام 3.2 EDAC ز و 18 مل من الماء ميليبور </td></tr><tr><td> BiodyneC النايلون 0،45 ميكرون الطول غشاء 20x20 </td><td> بال علوم الحياة </td><td> 74480C </td><td></td></tr><tr><td> Deionised ، والمياه النقية </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> المنظفات السائلة Pyroneg </td><td> جونسون دايفرسي </td><td> HH12291 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin - البيروكسيداز المتقارن </td><td> روش </td><td> 11 089 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> أمرشام ECL كشف الكواشف </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> أمرشام ECL كشف الكواشف </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> RPN2105 </td><td></td></tr><tr><td> OHP الفيلم الشفافية </td><td> الشركات اكسبرس </td><td> EXP 504 OHP </td><td></td></tr><tr><td> أمرشام hyperfilm ECL عالية الأداء الفيلم chemiluminescent 18x24 سم </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 28906837 </td><td></td></tr><tr><td> جليد </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. مستهلكات المستخدمة في فحص mPCR / RLB. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> معدات </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> أفران Shake&#39;n&#39;Stack Hybaid (2) زجاجة المتداول وشبكات النايلون فصل </td><td> الحرارية العلمية </td><td> HBSNSRS220 </td><td> لا يمكن أن يؤديها الأسلوب مع فرن واحد طالما هناك تسهيلات للحفاظ على الحلول في درجة حرارة 42 درجة مئوية و 60 درجة مئوية قبل الاستخدام </td></tr><tr><td> وتهز الراقصة منصة </td><td> Stovall علوم الحياة </td><td> اليورو BDbo </td><td></td></tr><tr><td> Miniblotter </td><td> Immunetics </td><td> MN100 - 45 </td><td></td></tr><tr><td> ماء الحمام </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> مص </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> صفيحة ساخنة </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> التعرض خرطوشة </td><td> سيغما الدريخ </td><td> Z36 ،009 - 0 </td><td></td></tr><tr><td> فيلم الأشعة السينية المطور </td><td></td><td></td><td> ويمكن أيضا استخدام مطور ، يتدخل والمياه في الصواني في غرفة مظلمة بدلا من الآليةالمطور. ويمكن أيضا Lumino - تصوير استخدامها بدلا من الأشعة السينية الفيلم </td></tr></tbody></table> الجدول 2. المعدات اللازمة لفحص mPCR / RLB.

pcr متعددة وعكس الخط الفحص لطخة تهجين (mpcr / rlb)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

PCR المتعدد / عكس طخة تهجين مقايسة الخط يسمح للكشف عن ما يصل الى 43 اهداف في 43 عينات الجزيئي باستخدام أحد تفاعل PCR متعددة تليها التهجين دقق في غشاء النايلون ، والتي يمكن إعادة استخدامها. تحقيقات والأمينات 5 &#39;تعديل للسماح لتثبيت الغشاء. الاشعال و5 &#39;تعديل البيوتين الذي يسمح الكشف عن المنتجات المهجنة باستخدام PCR - streptavidin البيروكسيداز وركيزة chemiluminescent عبر الفيلم للضوء. مع الإعداد والتكاليف المنخفضة للاستهلاك ، وهذا أسلوب غير مكلف (حوالي 2 دولار أمريكي لكل عينة) ، إنتاجية عالية (يمكن معالجتها الأغشية متعددة في وقت واحد) ، وفترة زمنية قصيرة (حوالي 10 ساعة). ويمكن استخدام هذه التقنية في عدد من الطرق. ويمكن تصميم عدة تحقيقات للكشف عن التباين تسلسل ضمن منتج واحد تضخيمها ، أو يمكن تضخيم منتجات متعددة في وقت واحد ، مع تحقيقات (أو أكثر) واحدة تستخدم للكشف عن لاحقة. ويمكن أيضا الجمع بين النهجين أن تستخدم في غضون مقايسة واحد. وتشمل القدرة على تحقيقات متعددة للتسلسل هدف واحد يجعل من الفحص محددة للغاية. تطبيقات المنشورة mPCR / RLB تشمل الكشف عن الجينات المقاومة للمضادات الحيوية 1،2 ، كتابة من المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين 3-5 والسالمونيلا س 6 ، المصلي الجزيئي لل7،8 العقدية الرئوية ، العقدية القاطعة للدر 9 و 10،11 الفيروسات المعوية ، وتحديد س 12 من المتفطرة ، والكشف عن الأعضاء التناسلية والمسالك التنفسية 13-15 16 وغيرها من مسببات الأمراض والكشف عن 17 وتحديد mollicutes 18. ومع ذلك ، فإن براعة تقنية يعني تطبيقات غير محدودة تقريبا ، وليس مقتصرا على التحليل الجزيئي للكائنات الحية الدقيقة. الخطوات الخمس في mPCR / RLB هي التمهيدي) وتصميم المسبار ، ب) استخراج الحمض النووي وPCR التضخيم ج) إعداد الغشاء ، د) التهجين والكشف ، وه) التجديد في الغشاء.

وصفت وغير مكلفة ، وطريقة إنتاجية عالية للكشف في وقت واحد لمدة تصل إلى 43 أهداف الجزيئي. تطبيقات mPCR / RLB تشمل كتابة الجراثيم واكتشاف مسببات الأمراض متعددة من العينات السريرية.

PCR متعددة وعكس الخط الفحص لطخة تهجين (mPCR / RLB)

يسمح مقاييس تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد/التهجين باللطخة الخطية العكسية (Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization) بالكشف عن ما يصل إلى 43 هدفاً جزيئياً في 43 عينة باستخدام تفاعل PCR متعدد واحد...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد وجود أو غياب مجموعة من تتابعات الأحماض النووية المحددة التي تم تضخيمها مسبقاً في تفاعل PCR متعدد (multiplex PCR). يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تثبيت مجسات DNA مُعلمة بالأمين على غشاء نايلون قابل لإعادة الاستخدام. بعد ذلك، يتم تهجين نواتج PCR المُعلمة بالبيوتين مع المجسات المرتبطة بالغشاء، ثم يُضاف strep TTR في peroxidase.يُضاف المتقارن إلى نواتج PCR المرتبطة. بعد ذلك، يتم الكشف عن نواتج PCR المرتبطة عن طريق إضافة كواشف الكشف بالتلألؤ الكيميائي، وتعريض الغشاء لفيلم الأشعة السينية عالي الحساسية. وأخيراً، يُغسل الغشاء لإزالة نواتج PCR المهجنة، مما يسمح بإعادة استخدامه في المقايسات المستقبلية.في النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر تهجين نواتج PCR مع المسابير المرتبطة بالغشاء على فيلم الأشعة السينية. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل PCR المتعدد، أو الفصل الكهربائي للهلام، أو PCR في الوقت الحقيقي أو المصفوفات الدقيقة، في كونها عالية الإنتاجية، وسريعة نسبياً، ولا تتطلب أي معدات متخصصة، والأهم من ذلك أنها غير مكلفة. قبل البدء، قم بتحضير المحاليل التالية وفقاً للجزء المكتوب من هذا البروتوكول.لتجهيز الغشاء، قم بتسخين الفرن مسبقاً إلى 60 °C. قم بتنظيف جهاز اللطخة الصغير (mini blotter) بـ 70% ethanol، ثم خفف مجسات قليلة النوكليوتيد (oligonucleotide probes) في محلول sodium bicarbonate بتركيز 0.5 molar لتصل إلى تركيز نهائي قدره 2 picomoles/µL وبحجم 200 µL. قص غشاء النايلون إلى قياس 15 × 15 cm، وباستخدام قلم رصاص ومسطرة، حدد مساحة قدرها 0.5 cm عبر الجزء العلوي من الغشاء، واكتب تفاصيل التجربة هناك.أغلق الغشاء في كيس بلاستيكي مع 20 milliliters من محلول 16%EDAC المحضر حديثاً، ثم قم بهزه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. اغسل الغشاء في ماء منزوع الأيونات لمدة 30 ثانية. بعد ذلك، ضع الغشاء في جهاز لطخ صغير (mini blotter) مع توجيه القنوات لتعبر الغشاء.بعد ذلك، ضع وسادة الدعم في مكانها وأغلق جهاز النقل الكهربائي. اشفط أي سائل من القنوات تماماً. املأ المسارين 1 و45 بـ 150 µL من بيكربونات الصوديوم بتركيز 0.5 M.استخدم 150 µL من كل محلول مسبار لملء المسارات من 2 إلى 44 بالتتابع، مع الحرص على تجنب تكون فقاعات هوائية. في حال ظهور فقاعة هوائية في القناة، ابقِ الماصة في مكانها واشفط المحلول بسرعة للسماح للفقاعة الهوائية بالطفو إلى أعلى طرف الماصة، ثم أعد المحاولة. تُحضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.قم بشفط محاليل المسبار. ثم أخرج الغشاء واغسله في 250 milliliters من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.1 molar في درجة حرارة الغرفة لمدة تسع دقائق. اغسل الغشاء في 250 milliliters من محلول SSPE بتركيز ضعفين لمدة 30 seconds.بعد ذلك، اغسلها في 250 milliliters من محلول SSPE 0.1%SDS مُسخن مسبقاً مرتين في الفرن عند 60 degrees Celsius لمدة خمس دقائق، وذلك في حال عدم استخدامها فوراً في عملية التهجين. اغسل الغشاء في 240 milliliters من 20 millimolar EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم ضع الغشاء في كيس بلاستيكي مع الـ 10 milliliters المتبقية من 20 millimolar EDTA واحفظه عند درجة حرارة أربع degrees Celsius.أخيرًا، اغسل الماصة الصغيرة (mini blosser) بمنظف pyro neck وباستخدام فرشاة، ثم اشطفها واتركها لتجف تمامًا. لم يتم وصف تضخيم PCR للأهداف المراد دراستها في هذا العرض التوضيحي، ولكن يجب إجراؤه قبل عملية التهجين. قبل البدء في إجراء التهجين، قم بتحضير المحاليل التالية وفقًا للجزء المكتوب من هذا البروتوكول.قم بتشغيل فرن واحد وضبطه على 60 درجة Celsius وفرناً آخر على 42 درجة Celsius. اغْلِ الماء في بيكر كبير على لوح تسخين. نظف جهاز اللطخة الصغير (mini blotter) باستخدام 70% ethanol.قم بتوزيع 10 milliliters من محلول SSPE بتركيز ضعفين و0.1% SDS في وعاء صغير. بعد ذلك، أضف 20 microliters من كل منتج PCR إلى 150 microliters من محلول SSPE بتركيز ضعفين و0.1% SDS في أنابيب مرقمة. قم بغلي منتجات PCR لمدة 10 minutes عند 100 degrees Celsius باستخدام حاملات من الستيروفوم، ثم ضعها على الثلج فوراً لمدة خمس دقائق على الأقل.اغسل الغشاء في الـ 240 milliliters المتبقية من محلول SSPE بتركيز 2x و 0.1%SDS في فرن بدرجة حرارة 60 degree Celsius لمدة خمس دقائق. ضع الغشاء في جهاز اللطخ الصغير (mini blotter) مع وسادة دعم. وجه الغشاء بحيث تكون القنوات ممتدة رأسيًا.قم بشفط السائل الزائد من قنوات ورق النشاف الصغير (mini blotter). أضف الـ 150 µL المتبقية من محلول SSPE بتركيز ضعفين مع 0.1%SDS إلى القناتين الأولى والأخيرة. أضف نواتج PCR المغلية إلى القنوات من 2 إلى 44 بالتتابع مع الحرص على تجنب تكون فقاعات هوائية.ضع جهاز لطخة النقل الصغيرة (mini blotter) بشكل مسطح في فرن درجة حرارته 60 degree celsius لمدة ساعة واحدة للسماح بحدوث التهجين. قم برش السائل من كل قناة. ثم أخرج الغشاء من جهاز لطخة النقل الصغيرة.تُغسل مرتين في 250 milliliters من محلول SSPE بتركيز ضعفين و0.5%SDS مُدفأ مسبقاً في فرن عند درجة حرارة 60 degree Celsius لمدة 10 دقائق. يتم ترطيب الدعامة النايلونية بمحلول SSPE بتركيز ضعفين و0.5%SDS عند درجة حرارة 42 degrees Celsius واستخدامها للف الغشاء. يوضع الغشاء الملفوف في أنبوب أسطواني ويتم فكه لضمان تلامس الغشاء مع السطح الداخلي.أضف 3 µL من مقترن strept AD في البيروكسيديز إلى 15 mL من محلول 2× SSPE و0.5% SDS عند درجة حرارة 42 °C ثم أضفه إلى الأنبوب. أحكم إغلاق الغطاء والآن قم بالتحضين في فرن دوار عند درجة حرارة 42 °C لمدة 60 دقيقة. تأكد من أن اتجاه الدوران يسمح بعدم شد الغشاء.افحص وجود أي تسريبات بشكل دوري. اغسل جهاز لطخ العينات المصغر (mini blotter) باستخدام منظف pyro neck والماء، ثم اتركه ليجف. أخرج الغشاء من أنبوب الأسطوانة واغسله مرتين في المحلولين المتبقيين من SSPE 0.5%SDS عند 42 degrees Celsius لمدة 10 minutes.بعد ذلك، اغسل الغشاء مرتين باستخدام محلول SSPE بتركيز ضعف التركيز المعتاد في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ارفع درجة حرارة الفرنين إلى 80 درجة مئوية، وضع 500 milliliters من 1%SDS في أحد الفرنين للتسخين المسبق. قم بتحضير محلول ECL واحضن الغشاء في محلول الكشف ECL لمدة دقيقتين.ثم يتم تعريض الغشاء للفيلم وتحميضه. كرر عملية التعريض بمدد زمنية أطول أو أقصر إذا لزم الأمر لإعادة تنشيط الغشاء. اغسله في 250 milliliters من 1%SDS عند 80 degrees Celsius لمدة 30 minutes مرتين.بعد ذلك، اغسل الغشاء باستخدام 240 milliliters من 20 millimolar EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 minutes. أحكم إغلاق الغشاء في كيس بلاستيكي مع 10 milliliters من 20 millimolar EDTA واحفظه في الثلاجة عند درجة حرارة four degrees Celsius لإعادة استخدامه مستقبلاً. يوضح هذا الشكل النتائج المستخلصة من مقايسة التهجين باللطخة الخطية العكسية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد (multiplex PCR reverse line blot hybridization assay)، حيث تمثل العينات من واحد إلى ستة ضوابط إيجابية فيما بينها.توجد إشارة مسبار إيجابية واحدة على الأقل لكل مسبار من المسابير الـ 43. يتم الكشف عن كل تتابع مستهدف من A إلى U باستخدام مسبارين مختلفين لرفع درجة النوعية إلى أقصى حد. يمثل المسباران "one" و"two" مسابير نوعية للأنواع، والتي يُتوقع أن تكون إيجابية في كل عينة وتساعد في توجيه فيلم المسبار.تتكرر العينة 1 في أسفل الغشاء. وتعتبر العينتان سبعة وثمانية ضوابط سلبية. لاحظ أن المجسات Q1 وQ2 وT one وT two تظهر إشارة في الضوابط السلبية، مما يشير إلى احتمالية حدوث ارتباط غير نوعي للبادئات أو تكون ثنائيات البادئات (primer dimer).سيكون من الضروري إعادة تصميم هذه المجسات أو البادئات؛ حيث تظهر المجسات C1 وD1 وF1 تخططاً عبر الغشاء، وهو ما يرجع على الأرجح إلى امتصاص غير محدد لـ strep TD في conjugate البيروكسيداز أو الركيزة المضيئة كيميائياً. ومع ذلك، يمكن تمييز ذلك بسهولة عن المجسات الإيجابية الحقيقية. أما المجسات D1 وD2، فتعطي إشارات ضعيفة نسبياً مقارنة بالمجسات الأخرى.قد يعود ذلك إلى أن قطع التضخيم الأكبر تؤدي إلى تضخيم أقل كفاءة. وأخيرًا، ظهر المسبار J two سلبياً في عدة عينات كانت فيها نتائج المسبار J one إيجابية، وهو ما يمثل على الأرجح وجود طفرة في موقع ارتباط J two في هذه العينات.بمجرد إتقان هذه التقنية، بدءاً من استخلاص DNA ووصولاً إلى تهجين PCR Pro، يمكن إتمام تفسير النتائج وإعادة تنشيط الغشاء في أقل من 10 ساعات.

multiplex-pcr-and-reverse-line-blot-hybridization-assay-mpcrrlb

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن تصف طريقة متعددة للكشف عن الكائنات الدقيقة ضمن عينة باستخدام الخرز ، بالإضافة الفلورسنت قليل النوكليوتيد. غير المهجنة Amplicon من جميع الكائنات الحية داخل عينة على لجنة التحقيق ، إلى جانب الخرز. وتستخدم أداة أو Luminex بيو الصفيف إلى الاستعلام كل حبة حبة لنوع وإشارة التهجين.

كشف متعددة من البكتيريا الموجودة في مجمع العينات السريرية والبيئية باستخدام قليل النوكليوتيد ، بالإضافة نيون المجهرية

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي المزدوج (ddPCR) - وهو تعديل لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية المفيدة في اكتشاف علامتين جينيتين مختلفتين في وقت واحد. يتم تقسيم تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الفردي إلى قطرات مستحلبة بحجم نانولتر يتم تضخيمها بشكل مستقل ، ويستخدم الكشف عن إشارات تضخيم التألق ذات الألوان المختلفة من جزء القطرات لحساب التركيز الأولي للتسلسلات المستهدفة.

تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي المزدوج للقياس الكمي المتزامن للعلامات الجينية المزدوجة

نعرض مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل البسيطة متعددة الإرسال للفحص السريع والكتابة لأنواع المكورات العنقودية المكورات العنقودية (SCCmec) من النوع I-V للمكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين ، ونوفر بعض الخطوات الحيوية والفروق الدقيقة الإجرائية التي تجعلها ناجحة في تكييف هذا الاختبار مع المختبرات الفردية.

?????? PCR ????? ??????? ?? ?????????? ????? ???????? ????? ?? ????? ??? ?????? ?? ????????? ??????<em&gt; ???????? ????????? ???????</em

الخطي التضخيم بوساطة (LAM)-PCR هو طريقة تم تطويرها لتحديد مواقع الدقيق لدمج ناقلات فيروسية في الجينوم. وقد تطورت هذه التقنية لتكون طريقة متفوقة لدراسة ديناميات النسيلي في المرضى العلاج الجيني، والسلامة البيولوجية التكنولوجيات رواية ناقلات، والتنوع تي خلية، ونماذج الخلايا الجذعية السرطانية، الخ...

الخطي التضخيم وساطة PCR - توطين العناصر الجينية وتوصيف غير معروف المرافقة الحمض النووي

يعد اختبار المراسل الجيني أداة راسخة وقوية لتشريح العلاقة بين تسلسل الحمض النووي وأنشطتها التنظيمية الجينية. يتيح اقتران العناصر التنظيمية المرشحة بجينات المراسل التي تحمل علامات تسلسل تحديد التوازي الهائل لهذه المقايسات.

فحوصات مراسل المتوازية نطاق واسع في خلايا الثدييات مثقف

Provided هو بروتوكول لتطوير مقايسة تضخيم البوليميراز المعاد تجميعها في الوقت الفعلي لتحديد التركيز الأولي لعينات الحمض النووي باستخدام إما جهاز تدوير حراري أو مجهر وسخان مرحلة. كما تم وصف تطوير التحكم الإيجابي الداخلي. يتم توفير البرامج النصية لمعالجة بيانات التألق الأولية في الوقت الفعلي.

تطوير الكمية Recombinase البلمرة التضخيم الفحص مع الرقابة الداخلية إيجابي

ويصف هذا البروتوكول تلفيق كاسيت صغير، وجاهزة للاستخدام التي يمكن تطبيقها للكشف البصري للأحماض النووية متعددة في اختبار واحد، التي من السهل أن تعمل. واستخدمت مجموعة شعرية في هذا النهج، للكشف عن الكائنات المعدلة وراثيا أهداف متعددة وذات كفاءة عالية.

الكشف عن الأحماض النووية متعددة في صفيف شعرية البصرية

الحالي متعدد التشخيص للكشف عن زيكا، الشيكونغونيا، وفيروسات حمى الضنك تتطلب إعداد نماذج معقدة ومكلفة للأجهزة، وهي صعبة الاستخدام في البيئات قليلة الموارد. علينا إظهار تشخيص التي يستخدمها التضخيم متحاور مع تحقيقات منقولة حبلا محددة الهدف لكشف والتفريق بين هذه الفيروسات مع حساسية عالية وخصوصية.

متعدد التضخيم متحاور على أساس منهاج التشخيصية للكشف عن زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك 1

ويصف هذا البروتوكول الخطوات الحاسمة والاحتياطات المطلوبة لأداء متعدد النسخ العكسي خلية مفردة البلمرة المتسلسل بعد التصحيح-المشبك. هذا الأسلوب أسلوب بسيط وفعال لتحليل الشخصية التعبير لمجموعة محددة سلفا من المورثات من خلية واحدة تتميز بتسجيلات المشبك التصحيح.

خلية مفردة متعدد النسخ العكسي البلمرة المتسلسل بعد التصحيح-المشبك

يلخص هذا العمل خطوات تطوير فحوصات مختلفة للكشف عن SARS-CoV-2 باستخدام نظام ddPCR بلونين. الخطوات مفصلة وتم تضمين ملاحظات حول كيفية تحسين المقايسات وأداء التجربة. يمكن استخدام هذه المقايسات للعديد من تطبيقات SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

بروتوكولات تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمية لقطرات النسخ العكسي المكونة من خطوتين للكشف عن SARS-CoV-2 وقياسه

يوضح هذا البروتوكول مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي في الوقت الفعلي (RT-PCR) لفيروس lysssavirus LN34 من جمع الأنسجة إلى تفسير النتائج ، بما في ذلك تحديثات التسلسلات والتركيبات الأولية لتحسين أداء الفحص لبعض فيروسات ليسا واللاجومورف غير داء. نوضح أيضا إعداد الفحص لتنسيق LN34 متعدد الإرسال أحادي البئر (LN34M).

تشخيص داء بعد الوفاة في عن طريق مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي في الوقت الحقيقي LN34 المحدث والمضاعف

تعلم تقنية PCR المتعدد وعكس الخط الفحص لطخة التهجين (mPCR/RLB) لاكتشاف الميكروبات والمسببات المرضية من العينات السريرية. هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية.

PCR متعددة وعكس الخط الفحص لطخة تهجين (mPCR / RLB)

استكشف المزيد من الفيديوهات