Vibratome Sectioning للحفاظ على المحسن من التهندس الخلوي للجهاز الثدييات كورتي

الهدف العام من التجربة التالية هو تصوير عضو كورتي مع الحفاظ الأقصى على البنية الخلوية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تقطيع الأذنين الداخليتين المشرحتين والمثبتتين باستخدام جهاز الفايبراتوم (vibratome) للحصول على مقاطع سميكة مع تقليل عدد الأسطح المقطوعة لكل قوقعة. ثم تُصبغ مقاطع الفايبراتوم باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية، مما يسمح بتحديد أنواع الخلايا المختلفة والبنى الخلوية في عضو كورتي.

بعد ذلك، يتم تثبيت المقاطع وتصويرها باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy) للحصول على صور عالية الدقة تحدد المواقع في المحور Z. يتم الحصول على نتائج من كل مقطع سميك من مقاطع Vibram تتيح إجراء الفحص المجهري البؤري للخلايا والهياكل في عضو كورتي مع تقليل الاضطرابات الناتجة عن عملية التقطيع إلى أدنى حد. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التقطيع بالشمع (paraffin) أو التقطيع بالتجميد (cryosectioning)، في تقليل الضرر المادي الذي يلحق بالقوقعة، مما يسمح بحفاظ أفضل على البنية الخلوية لعضو كورتي. ومن أجل عزل الأذن الداخلية، ابدأ أولاً بقطع رأس فأر بالغ تم إخضاعه للقتل الرحيم باستخدام شفرة حلاقة.

افتح الجمجمة على طول الخط الناصف ثم قم بإزالة الدماغ للكشف عن كل أذن باستخدام الملقط بعناية، واستخرج كلتا الأذنين الداخليتين. اغمر الأذنين الداخليتين في أنبوب تجميد يحتوي على 4% para formaldehyde طازج، وقم بهزه بلطف طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، اغسل المثبت بثلاث تغييرات من 1× phosphate buffered saline، ثم قم بإزالة الكالسيوم من أنسجة البالغين عن طريق الحضن في 10% EDTA عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمسة أيام.

اشطف الأذنين الداخليتين واحفظهما في محلول PBS بتركيز 1x حتى يحين وقت المعالجة. قم بتحضير agar منخفض الانصهار بتركيز 4% عن طريق إضافة agar إلى محلول PBS بتركيز 1x وتسخينه في الميكروويف حتى يذوب agar تماماً. احفظ الـ agar المنصهر في حمام مائي عند درجة حرارة 55 °C حتى يحين وقت الاستخدام.

أخرج الأذن الداخلية من محلول PBS باستخدام الملقط وضعها في قاع قالب التضمين القابل للنزع، ثم اسحب أي سائل متبقٍ باستخدام الماصة، وبعد ذلك املأ القالب بمادة mol and aros بحيث تغطي الأذن الداخلية تماماً لإنتاج مقاطع عرضية عبر عضو كورتي. ضع الأذن الداخلية بحيث تكون الرؤية جانبية مع القناة الهلالية الجانبية.

اجعل الزاوية مرئية، بحيث تكون الأذن الداخلية في وضعية تشكل فيها المنطقة الأكثر خلفية من القوقعة زاوية 45 درجة من مستوى القطع المقصود. وبمجرد أن يتصلب الأجار، قم بإزالة القالب البلاستيكي. استخدم شفرة حلاقة لتقليم الأجار الزائد وتشكيله على هيئة مكعب.

تأكد من ترك مساحة كافية من الأجار المحيط للحفاظ على دعم النسيج بشكل جيد. أثناء عملية التقطيع، قم بتثبيت قاعدة مكعب الأجار على سطح القطع بجهاز Vibram باستخدام الغراء السريع (super glue)، وقم بالتقطيع بسمك يتراوح من 40 إلى 100 ميكرون، ثم اجمع الشرائح في طبق يحتوي على 1× PBS مع 0.1% Triton X 100 باستخدام الملقط.

افصل الـ aros عن مقاطع الأنسجة. انقل المقاطع إلى طبق يحتوي على PBS طازج بتركيز 1× مع 0.1% Triton X 100، باستخدام طرف ماصة بفتحة واسعة، ثم تابع عملية التلوين بالأجسام المضادة في طبق زراعة أنسجة. بعد اكتمال التلوين بالأجسام المضادة، يتم تثبيت مقاطع الأنسجة على شريحة مجهرية.

لمنع سحق المقاطع النسيجية السميكة، ضع طبقة من شحم الفراغ (vacuum grease) بشكل مربع حول المقطع لإيجاد مساحة بين غطاء الشريحة والشريحة نفسها. انقل المقطع النسيجي إلى شريحة مجهرية. اضغط على حواف غطاء الشريحة بقوة لإنشاء سدادة محكمة.

بدلاً من ذلك، قم بنقل 1 µL من راتنج كروماتوغرافيا aros ذو حجم شبكي معروف إلى كل ركن من الأركان الأربعة حيث ستستقر شريحة التغطية، ثم ضع شريحة التغطية وأغلق الحواف بطلاء الأظافر قبل التصوير. في الصورة الأولى من مسح z-stack المجهري البؤري عبر مقطع عرضي من organ of Corti، تكون الخلايا الشعرية الداخلية، والخلايا الشعرية الداخلية المجاورة، والخلايا الشعرية الخارجية، وخلايا Deiters مرئية. عند صبغ النوى، تظهر الخلايا العمودية بوضوح من خلال صبغ الأجسام المضادة S 100 وتظهر باللون الأصفر. ومع تقدم مسح z-stack عبر المقطع بخطوات قدرها 3 µm، يمكن عد عدد الخلايا العمودية من خلال ملاحظة ظهور واختفاء نوياتها.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقطيع الأذن الداخلية باستخدام المقطاع الاهتزازي (vibrotome)، وإجراء الكيمياء النسيجية المناعية على هذه المقاطع، ثم تصويرها باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy). يضمن هذا الإجراء البسيط، القابل للتطبيق على أي جسم مضاد، أقصى قدر من الحفاظ على التنظيم الخلوي لعضو كورتي (organ of Corti).