Name: متساوي الكالوري المعايرة لقياس جزيء ضخم - يجند الانجذاب (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: تعلم تقنية المسح الحراري المتساوي لدراسة ارتباط الربيط بالجزيء الضخم في الأنظمة البيولوجية. تحدد هذه الطريقة الديناميكا الحرارية للارتباط بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل عن طريق منح NSF MCB - 0817827.

<ol><li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Anal. Biochem. 179, 131-137 (1989).</li>
<li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+and+differential+scanning+calorimetry+as+complementary+tools+to+investigate+the+energetics+of+biomolecular+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition.</a> J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S. A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein-protein+interactions+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry.</a> Methods Mol. Biol. 261, 35-54 (2004).</li>
<li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+value+of+c%3A+can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003).</li>
<li>Fukada, H., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enthalpy+and+heat+capacity+changes+for+the+proton+dissociation+of+various+buffer+components+in+0.1+M+potassium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Enthalpy and heat capacity changes for the proton dissociation of various buffer components in 0.1 M potassium chloride.</a> Proteins. 33, 159-166 (1998).</li>
<li>Houtman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+multisite+binary+and+ternary+protein+interactions+by+global+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+in+SEDPHAT%3A+application+to+adaptor+protein+complexes+in+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Studying multisite binary and ternary protein interactions by global analysis of isothermal titration calorimetry data in SEDPHAT: application to adaptor protein complexes in cell signaling.</a> Protein Sci. 16, 30-42 (2007).</li>
<li>Bradrick, T. D., Beechem, J. M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+binding+stoichiometries+and+cooperativity+are+observed+during+binary+and+ternary+complex+formation+in+the+single+active+pore+of+R67+dihydrofolate+reductase%2C+a+D2+symmetric+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein.</a> Biochemistry. 35, 11414-11424 (1996).</li>
<li>Shenoy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+and+multivalent+binding+between+cyanovirin-N+and+branched+oligomannosides%3A+calorimetric+and+NMR+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization.</a> Chem. Biol. 9, 1109-1118 (2002).</li>
<li>Chopra, S., Lynch, R., Kim, S. H., Jackson, M., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+viscosity+on+R67+dihydrofolate+reductase+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and viscosity on R67 dihydrofolate reductase catalysis.</a> Biochemistry. 45, 6596-6605 (2006).</li>
<li>Norris, A. L., Serpersu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Coenzyme+A+with+the+Aminoglycoside+Acetyltransferase+%283%29-IIIb+and+Thermodynamics+of+a+Ternary+System%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of Coenzyme A with the Aminoglycoside Acetyltransferase (3)-IIIb and Thermodynamics of a Ternary System.</a> Biochemistry. 49, 4036-4042 (2010).</li>
<li>Falconer, R. J., Penkova, A., Jelesarov, I., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2008%3A+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2008: applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 23, 395-413 (2010).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2005%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> J. Mol. Recognit. 20, 4-14 (2007).</li>
<li>Buurma, N. J., Haq, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+analysis+of+isothermal+titration+calorimetry+data+for+ligand-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Advances in the analysis of isothermal titration calorimetry data for ligand-DNA interactions.</a> Methods. 42, 162-172 (2007).</li>
<li>Salim, N. N., Feig, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry of RNA.</a> Methods. 47, 198-205 (2009).</li>
<li>De, M., You, C. C., Srivastava, S., Rotello, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+interactions+of+proteins+with+functionalized+nanoparticles%3A+a+thermodynamic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles: a thermodynamic study.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 10747-10753 (2007).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nat. Protoc. 1, 186-191 (2006).</li>
<li>Velazquez Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITC+in+the+post-genomic+era...%3F+Priceless%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">ITC in the post-genomic era...? Priceless.</a> Biophys. Chem. 115, 115-124 (2005).</li>
<li>Harries, D., Rau, D. C., Parsegian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solutes+probe+hydration+in+specific+association+of+cyclodextrin+and+adamantane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Solutes probe hydration in specific association of cyclodextrin and adamantane.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 2184-2190 (2005).</li>
<li>Chervenak, M. C., Toone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+measure+of+the+contribution+of+solvent+reorganization+to+the+enthalpy+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A direct measure of the contribution of solvent reorganization to the enthalpy of binding.</a> J. Am. Chem. Soc. 116, 10533-10539 (1994).</li>
<li>Taneva, S. G., Moro, F., Velazquez-Campoy, A., Muga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+nucleotide-induced+DnaK+conformational+states%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energetics of nucleotide-induced DnaK conformational states.</a> Biochemistry. 49, 1338-1345 (2010).</li>
<li>Jelesarov, I., Bosshard, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+ferredoxin+binding+to+ferredoxin%3ANADP%2B+reductase+and+the+role+of+water+at+the+complex+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface.</a> Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).</li>
<li>Burrows, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+monomer-dimer+equilibrium+of+interleukin-8+reveals+it+is+a+monomer+at+physiological+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration.</a> Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).</li>
<li>Baker, B. M., Murphy, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+linked+protonation+effects+in+protein+binding+reactions+using+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry.</a> Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد استخدم على نطاق واسع في دراسة مركز التجارة الدولية التفاعلات جزيء يجند ، 11 مع دراسات تبحث في يجند من البروتين ، 12 يجند الحمض النووي RNA - 13 و 14 جزيء الدراسات. يمكن حتى يمكن تشغيل المركز مع المواد الصلبة ، مثل النانوية ، التي تشكل معلقات موحد 15 وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام أنظمة الثلاثي ، حيث يرتبط بالفعل واحدة يجند للجزيء ومعاير ليجند الثانية ، لتحديد من الديناميكا الحرارية ، ل سبيل المثال ، يمكن ربط الركيزة لنظام انزيم العامل المساعد. 7 الدراسات أيضا أن يؤديها لجزيئات مع الانتماءات الملزمة عالية جدا من شأنها أن تتجاوز عادة الحد من الكشف عن مركز التجارة الدولية عن طريق إجراء فحوصات المنافسة ملزم مع يغاندس اضعف ملزمة (16). معلومات عن الربط ضعيف ويمكن أيضا أن يحصل عليها يغاندس المقايسات المنافسة (17). ويمكن استكشاف دور المياه في الربط عن طريق مركز التجارة الدولية ، جنبا إلى جنب مع 18 من الاعتماد على إعادة تنظيم المحتوى الحراري المذيبات (19). مؤخرا ، تم قياس التغيير متعلق بتكوين الديناميكا الحرارية من المتغيرات على DNAK الملزمة وسوف ADP ATP. يمكن دراسة 20 البروتين البروتين جمعية مركز التجارة الدولية ، مما أسفر عن معلومات حول المجمعات مغاير 21 فضلا عن الجمعيات ، وطي. آثار درجة الحرارة 22 على السخانة ملزمة تعطي السعة الحرارية للحدث ملزم. (2) عدد من البروتونات استيعابها أو الإفراج عنهم بناء على ملزمة ويمكن أيضا أن تحدد من التجارب التي أجريت في مخازن مختلفة من المحتوى الحراري للتأين 5 إذا أجريت دراسات إضافية في المركز قيم الحموضة المختلفة ، حينها يمكن للالباكاف الحمضية لمجموعة متورطة تحدد (23). لتلخيص ، وقياسات دقيقة للتركيز على جزيء ويجند أمر لا بد منه لإجراء تجربة مركز التجارة الدولية الجيدة. تركيزات عينة أيضا بحاجة إلى أن تكون ضمن النطاق المناسب للحصول على بيانات موثوقة. وينبغي توخي الحذر مع العازلة كشوائب جزيء صغير وعدم التطابق سوف يسبب الحموضة التحف في مخطط حراري.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> 1.7 مل أنابيب microcentrifuge </td><td> فيشر العلمية </td><td> 02-681-282 </td></tr><tr><td> 15 مل أنابيب الصقر </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14-959 - 49B </td></tr><tr><td> 2.5 مل هاميلتون حقنة </td><td> MicroCal </td><td> SYN161714 </td></tr></tbody></table>

متساوي الكالوري المعايرة لقياس جزيء ضخم - يجند الانجذاب

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

متساوي الكالوري المعايرة (ITC) هو أداة مفيدة لفهم الصورة الكاملة للالحرارية رد فعل ملزم. في العلوم البيولوجية ، وتفاعلات الجزيئات أساسية في فهم آلية عمل الخلايا. ويمكن تكييف الظروف التجريبية ، مثل العازلة ودرجة الحرارة ، ونظام الربط سيما التي تجري دراستها. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى تخطيط دقيق منذ يجند معينة ويتراوح تركيز جزيء ضرورية للحصول على بيانات مفيدة. تركيزات من جزيء ويجند حاجة إلى أن تحدد بدقة لنتائج موثوقة. الرعاية يحتاج أيضا إلى أن تؤخذ عند إعداد العينات والشوائب يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على التجربة. ويتم الحصول على عندما أجرى تجارب مركز التجارة الدولية ، جنبا إلى جنب مع الضوابط ، وبشكل صحيح ، والمعلومات المفيدة ملزمة ، مثل تقارب ، رياضيات الكيمياء والمحتوى الحراري. عن طريق تشغيل مزيد من التجارب المختلفة أو العازلة تحت ظروف درجات الحرارة ، ويمكن الحصول على معلومات أكثر تفصيلا حول هذا النظام. ويرد بروتوكول لإعداد الأساسية للتجربة مركز التجارة الدولية.

ويرد بروتوكول عام لاستخدام قياس الكالوري المعايرة متحاور لرصد ملزمة للديناميكا الحرارية مع النظم البيولوجية الانتماءات الملزمة معتدلة.

يعد قياس السعرات الحرارية بالمعايرة متساوية الحرارة (ITC) أداة مفيدة لفهم الصورة الديناميكية الحرارية الكاملة لتفاعل الارتباط. وفي المجالات البيولوجية...

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح تقنية عامة لدراسة ارتباط الليجاند بالجزيئات الكبيرة باستخدام قياس السعرات الحرارية بالمعايرة متساوية الحرارة، أو ITC. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير محاليل الليجاند والجزيئات الكبيرة بحيث تكون خالية من الشوائب ومتطابقة في كل من تكوين المحلول المنظم والرقم الهيدروجيني pH. بعد ذلك، يتم تحديد التركيزات النهائية لمحاليل الليجاند والجزيئات الكبيرة.يتم بعد ذلك ضبط معلمات تجربة ITC متبوعة بجمع البيانات. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تحليل البيانات ومطابقتها. وفي النهاية، يتم الحصول على النتائج التي توضح التفاعلات بين الليجاند والجزيئات الكبيرة من خلال التحليل الرسومي لبيانات المعايرة لتحديد معلمات الارتباط والمعلمات الديناميكية الحرارية.تتمثل الميزة الرئيسية لتقنية الارتباط هذه مقارنة بالطرق الحالية، مثل معايرات الامتصاص والفلورة، في إمكانية تحديد المحتوى الحراري (الإنثالبيا)، وبالتالي اعتلاج (إنتروبيا) الارتباط، من التجربة ذاتها. تبدأ عملية تحضير العينة بتحديد التركيزات المناسبة لكل من الجزيء الضخم والربيطة. وتتوفر في الإجراء المكتوب معلومات حول خطوة حاسمة يجب مراعاتها عند حساب هذه التركيزات للحصول على نتائج دقيقة لملاءمة بيانات معايرة السعرات الحرارية متساوية الحرارة (ITC).في هذا العرض التوضيحي، يتم استقصاء ارتباط العامل المساعد N-A-D-P-H بإنزيم dihydro folate reductase الكروموسومي الخاص ببكتيريا e coli. أولاً، يتم إعادة تكوين الجزيء الضخم المجفف بالتجميد في محلول منظم للوصول إلى التركيز المطلوب، ثم يُذاب الرابط في الحجم اللازم من المحلول المنظم. بعد ذلك، يتم التحقق من أن قيم pH لعينات الجزيء الضخم والرابط تقع ضمن نطاق زائد أو ناقص 0.05 pH unit من المحلول المنظم ومن بعضهما البعض، ثم تُطرد مركزياً محاليل dihydro folate reductase الكروموسومي و N-A-D-P-H في أنابيب طرد مركزي دقيقة لمدة خمس دقائق.عند سرعة تتراوح بين 8,000 إلى 14,000 RPM، ستؤدي هذه العملية إلى ترسيب أي جسيمات موجودة في المحلول، والتي قد تسبب ظهور شوائب في خط الأساس للمخطط الحراري لـ ITC. بعد عملية الطرد المركزي، تحقق بعناية من تركيزات محاليل الجزيئات الكبيرة والربيطة باستخدام مطيافية uves وسجل تركيزاتها الدقيقة.بعد ذلك، قم بتحضير الحجم المناسب من كل محلول ITC عن طريق تخفيف محاليل المخزون المعدّة من الجزيئات الكبيرة والربيطة إلى التركيزات التجريبية المطلوبة. وأخيرًا، قم بإزالة الغازات من العينات لتجنب ظهور تشويش في الإشارة ناتج عن فقاعات الهواء أو تحرر الغازات الذائبة أثناء عملية المعايرة قبل تحميل الجزيئات الكبيرة والربيطة في جهاز ITC. قم بتنظيف خلية العينة ومحقنة الحقن وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.بعد ذلك، اشطف خلية العينة مرتين أو ثلاث مرات باستخدام 1.8 milliliters من الماء المقطر بواسطة حقنة Hamilton. توخَّ الحذر عند التعامل مع الحقنة لأن طرفها الطويل ينثني بسهولة. ثم اشطف خلية العينة عدة مرات بنفس الحجم من المحلول المنظم.بمجرد تنظيف خلية العينة، قم بتعبئة 1.8 milliliters من محلول الجزيئات الكبيرة في الخلية. توقف عن إضافة العينة عند النقطة التي يظهر فيها المحلول خارج ساق الخلية، مع الحرص على تجنب تكون الفقاعات. قم بإزالة أي فقاعات هوائية باستخدام سرنجة Hamilton عن طريق تحريك الإبرة بلطف للأعلى والأسفل على جوانب الخلية للتخلص من الفقاعات الموجودة.اسحب المحقنة وقم بإزالة أي حجم زائد من البئر الموجود في الجزء العلوي من الخلية. بعد ذلك، املأ الخلية المرجعية بالماء المقطر. ثم قم بتوصيل محقنة بلاستيكية بمنفذ التعبئة الخاص بمحقنة الحقن باستخدام أنبوب توصيل.افتح منفذ التعبئة في وحدة تحكم VP viewer 2000. اشطف محقنة الحقن بالماء المقطر، ثم اشطفها بمحلول منظم. تأكد من تفريغ محقنة الحقن تماماً عن طريق سحب الهواء عبر النظام.ضع إبرة محقنة الحقن في محلول الربيطة واسحب المحلول إلى داخل المحقنة حتى تمتلئ تماماً. استمر في سحب حجم زائد قليلاً في المنفذ وفصل الأنابيب بعد إغلاق منفذ التعبئة فوراً. افصل الأنابيب وعملية تطهير المحقنة البلاستيكية وأعد تعبئة محقنة الحقن مرتين للتخلص من أي فقاعات هواء من المحقنة.أخرج سرنجة الحقن من محلول الربيطة وامسح أي قطرات موجودة على الجوانب باستخدام منديل كيميائي. كن حريصاً على عدم ملامسة طرف السرنجة للمنديل الكيميائي أو صدم السرنجة، لأن ذلك قد يؤدي إلى فقدان جزء من الحجم الموجود بداخلها. بعد ذلك، ضع سرنجة الحقن بعناية داخل خلية العينة.قم بضبط المعايير لتشغيل قياس السعرات الحرارية المتمايز (ITC) باستخدام برنامج V VP viewer 2000 المورد من شركة Micro Cal لأنظمة الارتباط. في حالة الإشارات الحرارية القوية، مثل نظام مختزل ثنائي هيدروفولات (DIHYDROFOLATE reductase) والـ N-A-D-P-H الصبغي، فإن استخدام عدد كبير من عمليات الحقن ذات الأحجام الصغيرة سيوفر نقاط بيانات أكثر لعملية الملاءمة. وعلى العكس من ذلك، بالنسبة للأنظمة التي تعطي إشارات حرارية ضعيفة، يفضل استخدام عدد قليل من عمليات الحقن ذات الأحجام الكبيرة.بالنسبة لأول عملية حقن أو عمليتين، اضبط حجم الحقن على 2 µL. سيتم التخلص من هذه الحقنات في النهاية لأنها قد تعطي نتائج مضللة بسبب الخلط بين محاليل الرابط والجزيئات الكبيرة. عند إدخال الوقت الفاصل بين عمليات الحقن، اترك عدة دقائق حتى يتوازن النظام ويعود إشارة الحرارة إلى خط الأساس.بعد ذلك، اختر درجة حرارة التجربة وأدخل سرعة تحريك المحقنة اللازمة لضمان المزج الكافي للرابط والجزيء الضخم أثناء المعايرة، ثم ابدأ التجربة بعد إعداد المعايير التجريبية. وبمجرد انتهاء التجربة، يجب أن تكون إشارة الحرارة النهائية قريبة من حالة التشبع. نظّف جهاز ITC وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة، وكرر عمليات المعايرة مرة أو مرتين إضافيتين على الأقل للحصول على بيانات قابلة للتكرار.أخيرًا، قم بإجراء تجربة ضابطة حيث يتم معايرة الرابط في محلول منظم داخل خلية العينة لتحديد حرارة التخفيف للرابط؛ ويمكن إجراء مطابقة البيانات بسهولة باستخدام وحدات الماكرو في أي برنامج لمطابقة البيانات. تم استخدام برنامج Origin seven الموفر من قبل micro Cal لتوضيح مطابقة البيانات هنا. للبدء، قم بتحميل ملف البيانات الأول.افحص المخطط الحراري الخام بحثاً عن أي علامة على وجود فقاعات هوائية أو شوائب أخرى في الإشارة، مثل وجود نتوءات في الخط القاعدي أو قمم في غياب نقطة الحقن. دوّن نقاط البيانات هذه حيث يجب إزالتها. بعد ذلك، حمّل بيانات التحكم في تخفيف الربيطة واطرحها من منحنى الامتصاص الحراري للارتباط في هذه المرحلة.قم بإزالة جميع نقاط البيانات الزائدة، بما في ذلك نقاط البيانات القليلة الأولى من عملية المعايرة حيث تظهر عادةً آثار التخفيف. ثم اختر نموذج ملاءمة البيانات. وبمجرد اختيار النموذج، يمكن إجراء ملاءمة للبيانات عن طريق إدخال تخمينات أولية يدويًا لمعاملات الملاءمة، بما في ذلك stoichiometry وenthalpy والألفة الرابطة.ومع ذلك، إذا كانت هناك معرفة مسبقة بأي من المعلمات من تجارب متعامدة، فيجب إدخال هذه القيم لأنها ستساعد في منع البيانات من الانحصار في نهايات صغرى محلية أثناء عملية الملاءمة. وبمجرد ملاءمة البيانات للتنقيط الأول، كرر خطوات تحليل البيانات لبقية متساويات الحرارة. بدلاً من ذلك، يمكن ملاءمة البيانات بشكل شامل باستخدام برنامج مثل said fat؛ ابدأ الملاءمة الشاملة عن طريق حفظ البيانات في origin كملف dot dat.بعد ذلك، قم باستيراد البيانات إلى البرنامج المذكور. اختر نموذجاً للملاءمة وقم بإجراء ملاءمة شاملة للبيانات، مع التبديل بين خيارات الملاءمة simplex و Mark HAR Leven حتى تصل قيمة مربع كاي (chi-squared) الشاملة إلى الحد الأدنى. يراقب إجراء ITC النموذجي الموضح في هذا الفيديو ارتباط N-A-D-P-H بإنزيم dehydro folate reductase الكروموسومي في بكتيريا e coli.يظهر الارتباط الطارد للحرارة لـ N-A-D-P-H بإنزيم de hydro folate reductase بوضوح في المخطط الحراري الخام حيث يتم تحرير الحرارة. ويشير انخفاض إشارات الحرارة مع كل حقنة متتالية إلى تشبع الارتباط، والذي يحدث خلال النصف الأول من عملية المعايرة. كما يُلاحظ نقاء المكونات والتطابق الجيد للمحاليل المنظمة من الجزء المشبع من المخطط، حيث تظهر فقط إشارات حرارية ضئيلة ناتجة عن حرارة تخفيف الليجاند.تمت ملاءمة البيانات لنموذج الموقع الواحد باستخدام برنامج origin للكشف عن إيزوثرم الارتباط. ثم تمت ملاءمة مجموعتين من البيانات لنموذج الموقع الواحد باستخدام الملاءمة المذكورة. وتشير القيم الصغيرة والنمط العشوائي للبواقي إلى أن المعاملات الثرموديناميكية معقولة. كما تم التحقق من صحة هذه المعاملات من خلال مقارنتها بقيم المراجع التي تم الحصول عليها بطرق متعامدة.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية دراسة ارتباط الربيطة بالجزيء الكبير باستخدام جهاز VP ITC من شركة micro، وذلك من خلال تحضير المحاليل بشكل صحيح، وضبط المعلمات التجريبية وتحليل البيانات.

isothermal-titration-calorimetry-for-measuring-macromolecule-ligand

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

مركز التجارة الدولية هو أداة قوية لدراسة الربط من يجند لمضيفه. في الأنظمة المعقدة ومع ذلك ، قد عدة نماذج تتناسب مع البيانات بشكل جيد على قدم المساواة. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر وسيلة لتوضيح النموذج المناسب ملزمة للنظم المعقدة واستخراج المعلمات الحرارية المقابلة.

جمع متغير تركيز الكالوري المعايرة متحاور مجموعات البيانات من أجل تحديد آليات ملزمة

يوضح هذا الفيديو كالوريمتر المسح التفاضلي - وهي تقنية لدراسة التفاعل بين الجزيء الحيوي والترابط. تتم دراسة ارتباط أبتامر الحمض النووي والترابط الحراري من خلال تطبيق دورات تسخين وتبريد متكررة على العينة والحصول على عمليات مسح للتحليل الديناميكي الحراري.

كالوريمتر المسح التفاضلي لدراسة تفاعل الترابط الحراري للحمض النووي

متساوي التدابير الكالوري المعايرة تدفق الحرارة المنطلقة أو الممتصة في التفاعلات الكيميائية. هذه الطريقة يمكن استخدامها لقياس انزيم الحفز. في هذه الورقة، وبروتوكول لإعداد مفيدة، يوصف عموما تجربة تشغيل، وتحليل البيانات، وتطبيقها على توصيف الأنزيمية اليوريا التحلل بواسطة جاك الفول اليورياز.

الساخنة البيولوجية الحفز: متساوي الكالوري المعايرة لوصف التفاعلات الإنزيمية

قياس فلورية المسح التفاضلي هي طريقة مستخدمة على نطاق واسع لفحص مكتبات الجزيئات الصغيرة للتفاعلات مع البروتينات. هنا ، نقدم طريقة مباشرة لتوسيع هذه التحليلات لتوفير تقدير لثابت التفكك بين جزيء صغير وشريكه البروتيني.

تحديد تفاعلات البروتين يجند عن طريق المسح الضوئي التفاضلية Fluorimetry

نقدم بروتوكول لتوصيف الجزيئية البيولوجية قابلة للطي وملزمة التفاعلات مع يغاندس ثيرمولابيلي باستخدام القياس فرق المسح السريع.

قياس الملامح الجزيئية البيولوجية DSC مع يغاندس ثيرمولابيلي لوصف سرعة قابلة للطي والربط التفاعلات

ويرد وصف بروتوكول مفصلة للقيام معايرة أليسا. وعلاوة على ذلك، يرد خوارزمية جديدة لتقييم معايرة اليساس والحصول على ثابت تفكك ملزمة ليجند القابلة للذوبان لمستقبل المعطل تداولها لوحة ميكروتيتير.

معايرة أليسا كأسلوب لتحديد ثابت تفكك مستقبلات يجند التفاعل

قياسات للمخدرات هدف المشاركة أمران أساسيان لتطوير العقاقير الفعالة والتحقق من صحة التحقيق الكيميائية. هنا، نحن تفاصيل بروتوكول لقياس الاشتباك المخدرات المستهدفة باستخدام التصوير عالية المحتوى في تكييف الميكروسكوبية المتوافقة المقايسة الخلوية التحول الحراري (سيتسا).

استخدام المحتوى العالي من التصوير لقياس الهدف المشاركة في خلايا ملتصقة

ويقاس الثبات الحراري لنشاط إنزيم سهولة بمعايرة متحاور القياس (ITC). معظم فحوصات الاستقرار البروتين المستخدمة في قياس البروتين التي تتكشف حاليا، ولكن لا توفر معلومات حول النشاط الأنزيمي. مركز التجارة الدولية يتيح التصميم مباشرة أثر التعديلات الإنزيم على الاستقرار نشاط الإنزيم.

قياس الاستقرار الانزيمية بالقياس متحاور المعايرة

يحصل الرحلان الحراري المجهري على ثوابت ربط بسرعة بتكلفة مادية منخفضة. إما الرحلان الحراري المجهري المسمى أو الخالي من التسمية متاح تجاريا. ومع ذلك ، فإن الرحلان الحراري الخالي من الملصقات غير قادر على تنوع قياسات التفاعل التي يمكن إجراؤها باستخدام ملصقات الفلورسنت. نحن نقدم بروتوكولا لقياسات الرحلان الحراري الموسومة.

استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

يصف هذا البروتوكول استخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) لتحليل حركية الارتباط والتفكك للربط بين أبتامر الحمض النووي والتتراسيكلين، بما في ذلك إعداد العينات، وتشغيل المعايير والعينات، وتفسير البيانات الناتجة.

تحديد الارتباط الديناميكي الحراري والحركي لأبتامر الحمض النووي والتتراسيكلين باستخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة

تعلم تقنية المسح الحراري المتساوي لدراسة ارتباط الربيط بالجزيء الضخم في الأنظمة البيولوجية. تحدد هذه الطريقة الديناميكا الحرارية للارتباط بدقة عالية.

متساوي الكالوري المعايرة لقياس جزيء ضخم - يجند الانجذاب

استكشف المزيد من الفيديوهات