نهج السريع إلى التصوير الإسفار عالية الدقة في الدماغ شرائح شبه سميكة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسهيل رؤية العصبونات الفلورية داخل شرائح الدماغ السميكة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تثبيت الدماغ في حامل سدادات aeros. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تقطيع الدماغ إلى شرائح سميكة باستخدام جهاز compressed tome.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إجراء الترويق البصري لشرائح الدماغ باستخدام تدرج من الجلسرين. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تثبيت شرائح الدماغ المروقة على شرائح زجاجية للتصوير الفلوري. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر تعبير البروتين الفلوري المراسل بدقة عالية في الخلايا العصبية داخل شرائح الدماغ السميكة، وذلك عبر المجهر الفلوري العاكس أو المجهر البؤري.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المقاطع الرقيقة، أو المجهر الفلوري المتسلسل، أو التصوير متعدد الفوتونات، في كونها أسرع بكثير، وأقل استهلاكاً للجهد، ولا تتطلب تقنيات مجهرية باهظة الثمن أو معقدة. للبدء، استرجع أنسجة دماغ الفأر التي خضعت للتثبيت بـ NC two عن طريق التروية القلبية، وتم تثبيتها لاحقاً لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، قم بتحضير محلول أغاروز بتركيز 2% عالي القوة ومنخفض نقطة التجلط في محلول PBS، وسخنه في الميكروويف حتى يذوب.

انقل الأغاروس المنصهر إلى أنبوب اختبار وضعه في كتلة تسخين بدرجة حرارة 40 degree Celsius لموازنة درجة الحرارة. وأثناء موازنة درجة حرارة الأغاروس، قم بلصق نسيج الدماغ المثبت على مكبس محقنة العينة. باستخدام غراء Sano Aate، اغمر النسيج المثبت في محلول sucrose PBS مشبع لتغليف سطح الدماغ، ثم اسحب المكبس إلى داخل مبيت المكبس. باستخدام الماصة، أضف الأغاروس الدافئ إلى المكبس بحيث يغطي نسيج الدماغ بالكامل مع التأكد من عدم إدخال أي فقاعات هوائية.

أخيرًا، قم بتثبيت محقنة العينة باستخدام كتلة تبريد لمدة دقيقة واحدة تقريبًا. لضبط الـ aros، قم بتركيب محقنة العينة التي تحتوي على أنسجة الدماغ المدمجة في الموضع المضغوط. قم بمحاذاة حافة الشفرة بدقة مع مخرج محقنة العينة، ثم املأ خزان المحلول المنظم بـ PBS.

قم بتدوير الميكرومتر. وبمجرد تحديد سمك الشريحة، تحرك للأمام لإخراج أنسجة الدماغ المضمنة من سرنجة العينة. ولإنتاج الشريحة الأولى، اضغط على زر البدء في وحدة التحكم.

كرر عملية تقديم النسيج المدمج والضغط على زر البدء لإنتاج العدد المطلوب من الشرائح. اجمع الشرائح باستخدام ماصة نقل وانقلها إلى قارورة استنشاق زجاجية مملوءة بـ PBS، ثم استخدم الماصة لسحب معظم الـ PBS من الشرائح المجمعة واستبداله بمحلول 10%glycerol في PBS. قم بهز القارورة برفق عند درجة حرارة أربع درجات Celsius على هزاز دوار مكتبي حتى تغوص الشرائح.

استمر في عملية التصفية التدريجية من خلال تكرار عملية الصب وإعادة الملء باستخدام محاليل glycerol بتركيزات 25% و50% ثم 75%. اسحب محلول glycerol بتركيز 75% باستخدام الماصة واستبدله بمحلول glycerol بتركيز 90%. احرص على عدم إدخال أي فقاعات هواء، ثم قم بعملية الموازنة عند درجة حرارة 4 °C مع التحريك اللطيف.

بعدما تم تصفية الشرائح بشكل كامل، لن تغوص بعد الآن، بل ستظهر طفوًا متعادلاً. باستخدام ملقط، قم بقص شريط لاصق مزدوج الوجه على شكل مستطيل مفتوح مع ترك حافة بمقدار 2 إلى 3 مليمتر ليتناسب مع المنطقة المرئية لشريحة مجهرية مقاس 25 × 75 مليمتر. قم بترتيب شرائح الدماغ داخل الحدود المحددة على الشريحة.

أنزل غطاء الشريحة بلطف فوق الشريط اللاصق. مع الحرص على عدم إدخال فقاعات هوائية وتطبيق ضغط لإحكام الإغلاق، اسحب أي كمية زائدة من الجلسرين، ثم أغلق حواف غطاء الشريحة بوضع طلاء أظافر شفاف. وبمجرد جفاف الختم، يمكن تخزين الشريحة في صندوق شرائح عند درجة حرارة 4 °C أو تصويرها.

استخدم المجهر الفلوري فوقي الإضاءة (epi fluorescent microscopy) على الفور. يمكن ملاحظة نمط تعبير ناقل فيروسي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز (enhanced GFP) في مقطع إكليلي بسماكة 200 micrometer من نسيج دماغ الفأر. هنا، يتم عرض المنطقة المظللة من الصورة الفلورية فوقية الإضاءة بدقة عالية باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy) للكشف عن العصبونات القشرية الفردية في الطبقة الخامسة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير شرائح دماغية سميكة ومثبتة للتصوير الفلوري السريع وعالي الدقة.