تحديد وتحليل الأسلاف محمر ماوس باستخدام CD71/TER119 التدفق cytometric الفحص

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد أسلاف الخلايا الحمراء مباشرة في الأنسجة التي تم حصادها حديثاً من الفئران. يتيح لنا ذلك دراسة خصائصها الجزيئية خلال الفترات التي يمر فيها نظام تكوين الكريات الحمراء في هذه الفئران بتغييرات. على سبيل المثال، أثناء التطور الجنيني أو أثناء الاستجابة للإجهاد الناجم عن نقص الأكسجين، يتم أولاً عزل النسيج المكون للدم من الكبد الجنيني للفأر أو الطحال أو نخاع العظم لدى البالغين، ثم يتم تفكيكه إلى معلق من الخلايا المفردة.

بعد ذلك، يتم وسم الخلايا بأجسام مضادة ضد علامات سطح الخلية CD 71 و TER 19، وأي علامات أخرى ذات أهمية، على سبيل المثال، لقياس بقاء الخلايا أو حالة الدورة الخلوية، ثم يتم تحليل معلق الخلايا الموُسم باستخدام محلل قياس التدفق الخلوي وتحديد مجموعات فرعية محددة من أرومات الكريات الحمراء في مراحل نضج متميزة. ويمكن تنقية هذه المجموعات الفرعية المحددة عن طريق فرز الخلايا. ولاحقاً، يمكن إجراء تحليل خلوي وجزيئي لكل مجموعة فرعية من مراحل نضج أرومات الكريات الحمراء.

تمنحنا القدرة على تحديد أرومات الكريات الحمراء في مراحل نضج محددة مباشرة في الأنسجة المكونة للدم والمعزولة حديثاً فرصة لدراسة هذه الخلايا في القشرة الفسيولوجية. لذا، تتيح لنا هذه الطريقة دراسة استجابة أرومات الكريات الحمراء بمختلف مراحل نضجها في الجسم الحي. فعندما تتعرض الفئران لمحفزات معينة، فإنها تسرع من معدل تكوين الكريات الحمراء.

على سبيل المثال، الظروف التي تسبب نقص الأكسجة والتي تحاكي المرتفعات العالية، أو حقن هرمون الإريثروبويتين. نحن نستخدم قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات لتحديد الخلايا أرومية الحمراء ضمن بيئة نسيجية معقدة، ودراسة إشارات البقاء وحالة الدورة الخلوية الخاصة بها في آن واحد. كما يمكننا فرز الخلايا أرومية الحمراء في مراحل نضجها المحددة مباشرة من الأنسجة الطازجة، واستكشاف مستويات التعبير الجيني، أو حالة الكروماتين، أو الوظائف الجزيئية الأخرى الخاصة بها.

تحدث عملية تكوين الكريات الحمراء النهائية في الفأر داخل الطحال ونخاع العظم في الفأر البالغ. ولذلك، سيتم استئصال هذه الأنسجة من فأر تم قتله رحيمًا. بعد قتل الفأر رحيمًا، يتم سحب الدم عن طريق ثقب القلب في أنابيب جمع الدم التي تحتوي على EDTA أو الهيبارين، وسيتم استخدام هذا الدم لاحقاً لحساب الهيماتوكريت، أو عدد الخلايا الشبكية، أو تحليل CBC.

ضع الطحال وعظم الفخذ المحصودين في أنابيب منفصلة تحتوي على محلول التلوين المنظم (staining Buffer) البارد. احتفظ بالأنسجة المحصودة على الثلج إذا لزم الأمر. قم بوزن الطحال.

من المرجح أن تظهر الفئران التي تمر باستجابة إجهاد لإنتاج كرات الدم الحمراء زيادة ملحوظة في وزن الطحال. بعد ذلك، يتم تحضير خلايا الطحال وخلايا نخاع العظم من الأنسجة المستخلصة وفقاً للإجراءات التي تم توضيحها سابقاً في جنين الفأر. وتحدث عملية إنتاج كرات الدم الحمراء النهائية في كبد الجنين بين اليومين الجنينيين 12.5 و 15.5.

يتم تحضير إناث الفئران الحوامل ذات الحمل المحدد زمنياً للحصول على خلايا الكبد الجنينية في الأيام من 12.5 إلى 14.5 من الحمل. يتم القتل الرحيم لإناث الفئران الحوامل المحددة زمنياً، وتُنقل القرون الرحمية إلى طبق بتري يحتوي على ثلج، وسط زراعة بارد أو محلول صبغ.

يلزم استخدام مجهر تشريحي لتشريح كبد الجنين في اليوم الجنيني 12.5 أو أصغر لإخراج الأجنة من الرحم. أولاً، يتم فصل كل خرزة عن القرن. ثم يتم استئصال جدار الرحم برفق لتحرير الجنين الموجود داخل كيسه السلوي.

قم بإزالة الغشاء السلوي برفق. يمثل كبد الجنين أكبر نسيج بطني أحمر اللون ويقع أسفل قلب أصغر بكثير. لتشريح كبد الجنين، استخدم الملاقط لتثبيت الجنين على جانبي الكبد وادفع الكبد برفق خارج البطن إلى الوسط الغذائي.

انقل الكبد برفق إلى أنبوب يحتوي على محلول صبغ طازج. وبعد تشريح جميع أكباد الأجنة ونقلها إلى أنبوب يحتوي على محلول صبغ طازج، قم بتفكيك الأكبد ميكانيكيًا عن طريق السحب والضخ بالمصّة، ثم قم بتصفية الخلايا المفككة من خلال مصفاة نايلون بمسامية 40 micron. اغسل الخلايا مرتين عن طريق الطرد المركزي، مع التخلص من الرائق وإعادة تعليق الخلايا في محلول الصبغ.

بعد الغسلة الثانية، صبغ الخلايا بصبغة tripan blue وعدّها باستخدام مقياس خلايا الدم (hemo cytometer). يحتوي الكبد الجنيني في المرحلة E 13.5 على حوالي 10⁷ خلية. أعد تعليق الخلايا بتركيز يتراوح بين 1 إلى 2 × 10⁶ خلية لكل عينة بحجم 200 µL لتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي (flow cytometric analysis).

لأغراض هذا البروتوكول المرئي، سيتم عرض صبغ الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي على خلايا الكبد الجنيني فقط. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير خليط مسبق لصبغ الأجسام المضادة الأولية يحتوي على ما يلي: IgG أرنب منقى لحجب مستقبلات FC في خلايا الفأر، وCD 71 FETR one 19 PE، وجسم مضاد موجه نحو بروتين سطح الخلية fast. امزج محلول الأجسام المضادة بلطف عن طريق قلب الأنبوب من مرتين إلى ثلاث مرات، ثم أضف 200 µL من الخليط المسبق لصبغ الأجسام المضادة الأولية إلى عينة خلايا الكبد الجنيني التي تم تحضيرها مسبقاً، وقم بالماصة صعوداً وهبوطاً بلطف لإعادة تعليق الخلايا.

بعد ذلك، قم بتحضير عينات الخلايا الضابطة الست هذه. عينة غير مصبوغة تُترك فيها الخلايا في محلول التصبغ لتحديد الفلورة الذاتية الخلفية للخلايا، ولون واحد لكل جسم مضاد أو لون مُستخدم في البروتوكول لتصحيح التداخل الطيفي بين القنوات، وهي في هذه التجربة TUR one 19 PE CD 71 fz fast، وbiotin وstreptavidin A PC، وضابط fluorescence minus one رقم سبعة A A DA لـ fast biotin، والذي يوفر الخلفية الحقيقية لتلك القناة حيث يتم تصبيغ الخلايا بجميع الألوان أو الأجسام المضادة الواردة في البروتوكول باستثناء fast biotin. قم بحضن العينة والضوابط ذات الصلة في صبغة الجسم المضاد الأولية على الثلج لمدة تتراوح من 45 دقيقة إلى ساعة واحدة في الظلام.

في نهاية فترة الحضن، اغسل الخلايا بإضافة ثلاثة milliliters من محلول التلوين المنظم إلى كل أنبوب عينة، ثم قم بالطرد المركزي لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق عند حوالي 400 ×g ودرجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، أضف strep avid في PC واحضن الأنابيب على الثلج لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة. وعند اكتمال فترة الحضن، اغسل الخلايا بنفس طريقة غسل صبغة الجسم المضاد الأولى.

أخيراً، أعد تعليق الخلايا في محلول الصبغ الذي يحتوي على صبغة DNA النفاذة للخلايا 7-AAD لاستبعاد الخلايا الميتة. وبذلك تصبح العينات الآن جاهزة لتحليل قياس التدفق الخلوي. إن الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو التحليل الصحيح لبوابات (gating) أحداث قياس التدفق الخلوي، مما يسمح بتحديد المجموعات الفرعية من أرومات الحمراء بشكل موثوق.

يتطلب الأمر إعداداً دقيقاً للجهاز وجميع عينات الضبط الصحيحة، وتعويضاً دقيقاً للتداخل الطيفي، ومن ثم إجراء عملية تحديد البوابات (gating) لاستبعاد الخلايا الميتة، والتكتلات، والأحداث الصغيرة جداً. وفي بداية تحليل البيانات، تُستخدم العينة غير المصبوغة وعينات الضبط أحادية اللون لضبط التعويض عن التداخل الطيفي لكل مجموعة من الألوان.

في هذا المثال، سنوضح كيفية تسرب الفلورة الخاصة بـ fit E إلى قناة PE، وكيفية تصحيح هذا التداخل الطيفي بعد عملية التعويض. أولاً، وباستخدام العينة الضابطة غير المصبوغة، نحدد منطقة موجبة لـ fit E وسالبة لـ PE. بعد ذلك، وباستخدام العينة الضابطة أحادية اللون لـ fit E، يمكننا معاينة التسرب الطيفي في قناة PE.

بعد إجراء التعويض الرقمي باستخدام برنامج FlowJo، يتم تقليل إشارة spillover fit E في قناة PE. وبمجرد إتمام التعويض، يمكن إزالة الخلايا الميتة والتجمعات والأحداث الصغيرة. يتم استبعاد التجمعات والمزدوجات الخلوية عن طريق رسم ارتفاع التشتت الأمامي (forward scatter height) مقابل مساحة التشتت الأمامي (forward scatter area) واختيار الأحداث الواقعة ضمن بوابة قطرية ضيقة.

يتم استبعاد الخلايا الميتة عن طريق اختيار الخلايا التي تكون سالبة لصبغة dapi، وهي صبغة للحمض النووي غير نفاذة للخلايا. كما تقوم بوابة الخلايا الحية السالبة لـ DAPI باستبعاد الأحداث الصغيرة جداً مثل النوى أو الحطام الخلوي، والتي تتميز بتشتت أمامي منخفض جداً. بعد ذلك، سنعرض استراتيجية تحديد البوابات لخلايا الكبد الجنيني.

تم وسم الخلايا المحصودة حديثاً بـ CD 71 TUR one 19، ومزيج من الأجسام المضادة الموسومة بـ ZI والموجهة ضد مؤشرات السلالة غير الحمراء. في هذا المثال، تم تعويض العينات بالفعل عن التداخل الطيفي، ومن ثم تم تحديد البوابات لاستبعاد التجمعات والخلايا الميتة والأحداث الصغيرة جداً. نستخدم عينة FMO التي تحتوي على جميع الألوان باستثناء صبغة fitzy الإيجابية للسلالة لرسم مخطط توزيع fitzy وتحديد بوابة الخلايا السلبية للسلالة، ومن ثم نطبق هذه البوابة على عينة خلايا الكبد الجنيني التي صُبغت بمؤشرات السلالة المقترنة بـ ZI.

يتم اختيار الخلايا سالبة السلالة (Lineage negative cells) وتمثيلها بيانياً بحيث يكون CD 71 على المحور Y و TER one 19 على المحور X، وتصبح الخلايا الآن جاهزة للتقسيم إلى مجموعات فرعية من S zero إلى S five. تحتوي المجموعة الفرعية S zero المستنفدة من السلالة (Lin depleted) بشكل كبير على خلايا ذات قدرة CFUE قبل بدء الاعتماد على EPO.

تحتوي المجموعة الفرعية S one على خلايا CFUE المعتمدة على EPO والتي تكون في الغالب في طور S من الدورة الخلوية. أما خلايا المجموعة الفرعية S two فقد فقدت قدرتها على تكوين المستعمرات وبدأت في التعبير عن الهيموغلوبين، بينما تكون خلايا المجموعة الفرعية S3 في الغالب أرومات حمراء قاعدية، وتحتوي المجموعتان الفرعيتان S four و S five على أرومات حمراء متأخرة. يظهر هنا استراتيجية التحليل بعد الحصول على البيانات من خلايا الطحال التي تمت معالجتها ووسمها بأجسام مضادة موجهة ضد CD 71 و TER one 19، بالإضافة إلى مدرج تكراري لمستقبل الموت.

يُظهر المخطط الأول جميع الأحداث المكتسبة حيث تمثل البوابة القطرية الأحداث التي من المرجح أن تكون خلايا مفردة، مع استبعاد المزدوجات أو التجمعات الأكبر. يتم إجراء مزيد من التحليل للخلايا الموجودة في هذه البوابة في المدرج التكراري الثاني هنا. ويتم استبعاد الأحداث الصغيرة جداً والتي يُرجح أن تكون نوى أو حطاماً خلوياً.

تظهر الخلايا التي تم اختيارها بواسطة البوابة في المدرج التكراري الثالث، حيث تم استبعاد الخلايا الموجبة لـ DAPI، والتي يُرجح أنها خلايا موت مبرمج نفاذة غشائياً، من التحليلات اللاحقة. يوضح المدرج التكراري الرابع المجموعة الناتجة من خلايا الطحال الحيوية. تحتوي البوابة pro eGate على خلايا CD 71 high TER one 19 Intermediate، بينما يتم تحليل خلايا tur R one 19 high بشكل أكبر في المدرج التكراري الخامس.

هنا، يتم تقسيم الخلايا ذات التعبير العالي لـ CD 71 إلى خلايا ذات مساحة كبيرة أقل نضجاً، وهي الأرثرو بلاستات A، وأرثرو بلاستات A B أصغر حجماً وأكثر نضجاً. أما المجموعة الأكثر نضجاً من الأرثرو بلاستات فهي ARI C. ويمكن قياس تعبير بروتينات سطح الخلية في آن واحد لكل مجموعة من هذه المجموعات عن طريق إضافة الأجسام المضادة ذات الصلة في نفس وقت إضافة TER R 19 و CD 71. ويظهر مخطط التوزيع التكراري للتلوين 6 تعبير مستقبل الموت fast على سطح الخلية، وتحديداً في المجموعة الفرعية A في الفئران في الحالة الأساسية والفئران التي حُقنت بجرعة واحدة من E ppo.

تشير النتائج إلى أن EPO يثبط التعبير السريع في هذه المنطقة. كما يمكن قياس التعبير الحي (in vivo) للبروتينات داخل الخلوية أو حالة الدورة الخلوية لمجموعة من الخلايا في كل مجموعة فرعية. وفي هذا التحليل النموذجي للدورة الخلوية، حُقنت الفئران بـ BRDU عن طريق الحقن داخل الصفاق، ثم جُمع نخاع العظم بعد مرور 30 إلى 60 دقيقة.

بالإضافة إلى صبغ الخلايا لـ CD 71 و TER one 19، تم صبغ الخلايا للكشف عن دمج BRDU في حمضها النووي DNA المتضاعف؛ حيث تكون الخلايا الموجبة لـ BRDU في طور S من الدورة الخلوية. أما الخلايا في الطور البيني فتكون سالبة لـ BRDU ويمكن تحليلها إلى طوري G one أو G two M. وباستخدام DNAD seven A A D، يمكن فرز الخلايا من كل من المجموعات الفرعية PRO E area A A B و A EC.

تظهر هنا في تحضيرات الخلايا التي توضح النضج المتتابع مع تناقص حجم الخلية وتكثف النواة وزيادة اللون البني الذي يعكس تعبير hemoglobin. وأخيراً، يظهر هنا تحليل ممثل لدورة الخلية للمجموعة الفرعية S3 في الكبد الجنيني في المرحلة E 13.5. وقد حُقنت الفئران الحوامل بـ BRDU.

تم حصاد أكباد الأجنة بعد 30 إلى 60 دقيقة، ثم ثُبتت ونُفذت وصُبغت بأجسام مضادة ضد CD 71 و TER one 19 و BRDU. وتم تحليل حالة الدورة الخلوية لخلايا S3 حيث تكون خلايا طور S موجبة لـ BRDU، كما تم قياس محتوى DNA عن طريق الصبغ بصبغة DNA seven A a d.

يتيح النهج السيتومتري الذي نصفه الاستقصاء المتزامن لوظائف خلوية مثل تعبير علامات سطح الخلية والبروتينات الأخرى، وبقاء الخلية، وتأشير الخلية باستخدام أجسام مضادة محددة لـ fosso، وحالة الدورة الخلوية. وهو يسمح لنا بالتالي بدراسة الاستجابات الجزيئية للخلايا الحمراء البدائية (erythroblasts)، وهي مرحلة نضج مختلفة، تجاه مجموعة واسعة من المحفزات أو تأثير الطفرات الجينية. وتجدر الإشارة إلى أن مجموعات النضج في قياس التدفق السيتومتري يتم تحديدها بناءً على تعبير علامات سطح الخلية والتشتت الأمامي.

وجدنا أن الخلايا في كل مجموعة فرعية تتوافق بشكل عام مع مرحلة مماثلة من شكل أرومات الكريات الحمراء في مجموعة متنوعة من نماذج الفئران. ومع ذلك، نوصي بالتحقق من ذلك عند فحص نموذج فأر جديد. يمكن أيضًا فرز الخلايا من كل مجموعة فرعية لإجراء تحليل RNA أو تحليل الترانسكريبتوم من خلال فرز الخلايا وفحص شكلها؛ ويجب أن تستخدم تجارب الفرز ضغوط فرز منخفضة وفوهات واسعة لتقليل إجهاد القص على الخلايا.

نوصي أيضاً بالتحقق من نقاوة الخلايا وحيويتها بعد كل تجربة فرز. وأخيراً، عند اكتشاف تغير في تردد مجموعة فرعية معينة، من المهم تحديد ما إذا كان هذا ناتجاً عن تغير حقيقي في عدد الخلايا في تلك المجموعة الفرعية أو بسبب تغيرات في مجموعات فرعية أخرى. لذلك، بالإضافة إلى قياس ترددات المجموعات الفرعية، من الضروري دائماً قياس العدد المطلق للخلايا في كل مجموعة فرعية أيضاً.