تحديد وتحليل الأسلاف محمر ماوس باستخدام CD71/TER119 التدفق cytometric الفحص

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد سلائف الخلايا الحمراء مباشرة في الأنسجة التي تم حصادها حديثا في الفئران. هذا يسمح لنا بدراسة خصائصها الجزيئية خلال الأوقات التي يتعرض فيها نظام تكون الكريات الحمراء في هذه الفئران للتغيير. على سبيل المثال ، أثناء التطور الجنيني أو أثناء الاستجابة للإجهاد الناجم عن نقص التأكسج ، يتم عزل الأنسجة المكونة للدم الأولى من كبد الجنين الفأر أو الطحال البالغ أو نخاع العظم وفصلها في معلق خلية واحدة.

يتم تصنيف الخلايا التالية بأجسام مضادة ضد علامات سطح الخلية CD 71 و TER one 19 ، ومع أي علامات أخرى ذات أهمية ، على سبيل المثال ، لقياس بقاء الخلية أو حالة دورة الخلية ، يتم بعد ذلك تحليل تعليق الخلية المسمى باستخدام محلل قياس التدفق الخلوي ويتم تحديد مجموعات فرعية محددة من الأرومات الحمراء في مراحل مميزة من النضج. يمكن تنقية هذه المجموعات الفرعية المحددة عن طريق فرز الخلايا. بعد ذلك ، يمكن إجراء التحليل الخلوي والجزيئي لكل مجموعة فرعية من نضوج الأرومات الحمراء.

تمنحنا القدرة على تحديد الأرومة الحمراء في مراحل نضج محددة مباشرة في الأنسجة المكونة للدم المعزولة حديثا الفرصة لدراسة الخلايا في القشرة الفسيولوجية. لذلك تسمح لنا هذه الطريقة بدراسة الخلايا الحمراء العالية لمراحل النضج المختلفة ، والاستجابة في الجسم الحي. عندما تتعرض الفئران للمنبهات ، فإنها تسرع من الصندوق المكونة للكريات الحمراء.

على سبيل المثال ، حالات نقص الأكسجين التي تحاكي الارتفاعات العالية أو حقن هرمون الإريثروبويتين. نستخدم قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات لتحديد الشفرات داخل بيئة الأنسجة المعقدة ودراسة بقاء الإشارات وحالة دورة الخلية في نفس الوقت. يمكننا أيضا فرز أرومات الكريات الحمراء مراحل نضجها المحددة مباشرة من الأنسجة الطازجة واستكشاف مستويات التعبير الجيني أو حالة الكروماتين أو الوظائف الجزيئية الأخرى.

تكون الكريات الحمراء النهائي للفأر في الطحال ونخاع العظام للفأر البالغ. لذلك ، سيتم حصاد هذه الأنسجة من فأر قتل رحيم. بعد القتل الرحيم للفأر ، وسحب الدم عن طريق ثقب القلب في أنابيب جمع الدم EDTA أو الهيبارين ، سيتم استخدام هذا الدم لاحقا لتعداد الهيماتوكريت أو عدد الخلايا الشبكية أو تحليل CBC.

ضع الطحال وعظم الفخذ المحصودين في أنابيب منفصلة تحتوي على تلطيخ بارد. مخزن مؤقت. احتفظ بالأنسجة المحصودة على الجليد إذا رغبت في ذلك. وزن الطحال.

المرجح أن تظهر الفئران التي تخضع لاستجابة الإجهاد المكونة للكريات الحمراء زيادة كبيرة في وزن الطحال. بعد ذلك ، يتم تحضير خلايا الطحال وخلايا نخاع العظم من الأنسجة المحصودة من خلال الإجراءات الموضحة سابقا في جنين الفأر. يحدث تكون الكريات الحمراء النهائي في كبد الجنين بين الأيام الجنينية 12.5 و 15.5.

يتم تحضير إناث الفئران الحامل في الوقت المناسب للحصول على خلايا كبد الجنين في الأيام من 12.5 إلى 14.5 من الحمل. يتم قتل الفئران الحامل الموقوتة وإزالة قرون الرحم في طبق بتري يحتوي على الثلج. وسط الثقافة الباردة أو المخزن المؤقت للتلطيخ.

مطلوب مجهر تشريح لتشريح كبد الجنين من اليوم الجنيني 12.5 أو أقل لإزالة الأجنة من الرحم. أولا افصل كل حبة بعيدا عن القرن. ثم استئصال جدار الرحم برفق لتحرير الجنين الموجود داخل الكيس الأمنيوسي.

قشر الغشاء الأمنيوسي برفق. كبد الجنين هو أكبر نسيج بطني أحمر يقع تحت قلب أصغر بكثير. لتشريح كبد الجنين، استخدم الملقط لشل حركة الجنين على جانبي الكبد ودفع الكبد برفق خارج البطن إلى الوسط.

نقل الكبد برفق إلى أنبوب يحتوي على عازلة تلطيخ جديدة. بعد كل شيء ، تم تشريح كبد الجنين ونقله إلى أنبوب يحتوي على تلطيخ جديد. قم بفصل الكبد ميكانيكيا عن طريق سحب العينات ، ثم قم بتصفية الخلايا المنفصلة من خلال خلايا غسيل شبكية من النايلون 40 ميكرون مرتين عن طريق الطرد المركزي ، والتخلص من المادة الطافية وتعليق الريسوس في مخزن مؤقت للتلطيخ.

بعد الغسيل الثاني ، قم بتلطيخ الخلايا باللون الأزرق التراني وعدها باستخدام مقياس الخلوي الدموي. يحتوي كبد الجنين عند E 13.5 على حوالي 10 إلى السابع. تقوم الخلايا بإعادة تعليق الخلايا في مرة إلى مرتين 10 إلى الخلايا السادسة لكل عينة 200 ميكرولتر لتحليل قياس التدفق الخلوي.

لأغراض بروتوكول الفيديو هذا ، سيتم عرض تلطيخ الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي على خلايا الكبد الجنينية فقط. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد خلطة أولية لتلوين الأجسام المضادة تحتوي على ما يلي ، أرنب منقى IgG لمنع مستقبلات FC في خلايا الفأر CD 71 FETR واحد 19 PE وجسم مضاد موجه إلى بروتين سطح الخلية بسرعة. امزج محلول الجسم المضاد برفق عن طريق قلب الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات ، وأضف 200 ميكرولتر من تلطيخ الجسم المضاد الأساسي الممزوج مسبقا إلى عينة خلايا كبد الجنين المعدة مسبقا والماصة لأعلى ولأسفل برفق لإعادة تعليق الخلايا.

بعد ذلك ، قم بإعداد عينات خلايا التحكم الست هذه. عينة غير ملوثة تترك فيها الخلايا في مخزن مؤقت للتلطيخ لتوفير التألق الذاتي للخلايا ، لون واحد لكل جسم مضاد أو لون مستخدم في البروتوكول لتصحيح التداخل الطيفي بين القنوات ، والتي في هذه التجربة هي TUR واحد 19 PE CD 71 fz سريع ، البيوتين والستربتافيدين A PC وسبعة مضان A A DA ناقص تحكم واحد للبيوتين السريع ، والذي يوفر الخلفية الحقيقية لتلك القناة حيث يتم تلطيخ الخلايا بجميع الألوان أو الأجسام المضادة في البروتوكول باستثناء البيوتين السريع. احتضان العينة والضوابط ذات الصلة في بقعة الجسم المضاد الأساسي على الجليد لمدة 45 دقيقة إلى ساعة واحدة في الظلام.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا بإضافة ثلاثة ملليلتر من محلول التلوين إلى كل أنبوب عينة وقم بالدوران لمدة ثلاث إلى خمس دقائق بحوالي 400 ضعف الجاذبية عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بتطبيق البكتيريا العقدية في جهاز كمبيوتر واحتضان الأنابيب على الجليد لمدة 30 إلى 45 دقيقة. عند الانتهاء من الحضانة ، اغسل الخلايا كما هو الحال بالنسبة لصبغة الجسم المضاد الأولى.

أخيرا ، قم بإعادة تعليق الخلايا في محلول تلطيخ يحتوي على الخلية غير المنفذة ، وصبغ الحمض النووي سبعة أ د لاستبعاد الخلايا الميتة. العينات جاهزة الآن لتحليل قياس التدفق الخلوي. أصعب جانب في هذا الإجراء هو تحليل البوابات الصحيحة لأحداث التدفق الخلوي مما يسمح بتحديد موثوق للمجموعات الفرعية لأرومة الحمراء.

يتطلب إعداد آلة دقيقة لجميع عينات التحكم الصحيحة ، والتعويض الدقيق للتداخل الطيفي والبوابات اللاحقة التي تستبعد الخلايا الميتة والركام والأحداث الصغيرة جدا. في بداية تحليل البيانات. يتم استخدام العينة غير الملوثة وعينات التحكم في اللون الفردي لإعداد تعويض التداخل الطيفي لكل مجموعة ألوان.

في هذا المثال ، سنوضح كيف تناسب انسكابات التألق e في قناة PE وكيف يتم تصحيح هذا التداخل الطيفي بعد التعويض. أولا ، باستخدام عنصر التحكم غير الملوثة ، نحدد منطقة إيجابية E ومنطقة سلبية PE. بعد ذلك ، باستخدام عنصر التحكم في اللون الفردي المناسب E ، يمكننا تصور الامتداد الطيفي في قناة PE.

بعد التعويض الرقمي باستخدام برنامج FlowJo، يتم تقليل إشارة E الملائمة للامتداد في قناة PE. بمجرد تعويض الخلايا الميتة ، يمكن إزالة الركام والأحداث الصغيرة. تتم إزالة التجميعات ومزدوجات الخلايا عن طريق رسم ارتفاع التشتت الأمامي مقابل منطقة التشتت الأمامية وتحديد الأحداث داخل بوابة قطرية ضيقة.

تتم إزالة الخلايا الميتة عن طريق اختيار الخلايا السالبة لموت الحمض النووي غير المنفذ لخلية دابي. تستبعد بوابة الخلية السالبة القابلة للحياة DAPI أيضا الأحداث الصغيرة جدا مثل النوى أو الحطام ، والتي لها تشتت أمامي منخفض جدا. بعد ذلك ، سنعرض استراتيجية البوابات لخلايا كبد الجنين.

تم تصنيف الخلايا التي تم حصادها حديثا ل CD 71 TUR one 19 ، ومزيج من الأجسام المضادة المسماة ZI الموجهة إلى علامات النسب غير الحمراء. في هذا المثال ، تم بالفعل تعويض العينات عن التداخل الطيفي ثم تم تسييلها لاستبعاد الخلايا الميتة المجاميع والأحداث الصغيرة جدا. نستخدم عينة FMO التي تحتوي على جميع الألوان باستثناء صبغة النسب الإيجابية لرسم رسم رسم بياني متناسب وتحديد بوابة الخلية السلبية للنسب ، ثم نطبق هذه البوابة على عينة خلية الكبد الجنينية التي تم تلطيخها بعلامات النسب المترافقة ZI.

يتم تحديد الخلايا السالبة للنسب ورسمها باستخدام CD 71 على المحور Y و TER واحد 19. على المحور A ، أصبحت الخلايا جاهزة الآن للتقسيم إلى مجموعات فرعية من S صفر إلى S خمسة. تحتوي المجموعة الفرعية Lin المستنفدة S صفر إلى حد كبير على خلايا ذات إمكانات CFUE قبل بداية الاعتماد على EPO.

تحتوي المجموعة الفرعية S واحدة على خلايا CFUE المعتمدة على EPO إلى حد كبير في المرحلة S من دورة الخلية. فقدت خلايا المجموعة الفرعية S إمكانات تكوين المستعمرة وبدأت في التعبير عن الهيموجلوبين S3 ، والخلايا الفرعية هي إلى حد كبير أرومات الكريات الحمراء القاعدية ، S أربعة و S ، تحتوي خمس مجموعات فرعية على بانومات حمراء متأخرة. تظهر هنا استراتيجية التحليل التي تتبع الحصول على البيانات من خلايا الطحال التي تمت معالجتها وتصنيفها بالأجسام المضادة الموجهة إلى CD 71 و TER one 19 ، بالإضافة إلى الرسم البياني السريع لمستقبلات الموت.

يظهر أحدهما جميع الأحداث المكتسبة حيث تمثل البوابة القطرية الأحداث التي من المحتمل أن تكون خلايا مفردة ، باستثناء المضاعفات أو المجاميع الأكبر. يتم تحليل الخلايا الموجودة في هذه البوابة بشكل أكبر في الرسم البياني الثاني هنا. الأحداث الصغيرة جدا ، من المحتمل أن يتم استبعاد النوى أو الحطام.

تظهر الخلايا المسورة في الرسم البياني الثالث حيث يتم استبعاد الخلايا الموجبة DAPI التي من المحتمل أن تكون خلايا موت الخلايا المبرمج القابلة للاختراق بالغشاء من مزيد من التحليل. يوضح الرسم البياني الرابع السكان الناتجين لخلايا الطحال القابلة للحياة. يحتوي pro eGate على قرص مضغوط 71 مرتفع TER واحد 19 خلية وسيطة tur R واحدة يتم تحليل 19 خلية عالية في الرسم البياني الخامس.

هنا ، تنقسم الخلايا العالية CD 71 إلى منطقة كبيرة أقل نضجا ، وأرومات حمراء وأرومات حمراء أصغر وأكثر نضجا من A B. المجموعة الفرعية الأكثر نضجا للأرومة الحمراء هي ARI C.يمكن قياس التعبير عن بروتينات سطح الخلية في وقت واحد لكل مجموعة من هذه المجموعات الفرعية عن طريق إضافة الأجسام المضادة ذات الصلة في نفس الوقت مثل TER R one 19 و CD 71. يظهر تلطيخ الرسم البياني السادس التعبير عن سطح الخلية لمستقبلات الموت بسرعة ، وتحديدا في المنطقة ، ومجموعة فرعية في الفئران في الحالة القاعدية والفئران التي تم حقنها بجرعة واحدة من E ppo.

تشير النتائج إلى أن المكتب الأوروبي للبراءات يثبط التعبير السريع في المنطقة. يمكن أيضا قياس تعبير السكان في الجسم الحي عن البروتينات داخل الخلايا أو حالة دورة الخلية للخلايا في كل مجموعة فرعية. في هذا التحليل التمثيلي لدورة الخلية ، تم حقن الفئران داخل الصفاق باستخدام BRDU وتم حصاد نخاع العظم بعد 30 إلى 60 دقيقة.

بالإضافة إلى تلطيخها ل CD 71 و TER one 19 ، تم تلطيخ الخلايا لدمج BRDU في الخلايا الإيجابية D-N-A-B-R-D-U المتماثلة في المرحلة S من الدورة. خلايا الواجهة هي BRDU سالبة ويمكن حلها إلى G واحد أو G مرحلتين M. باستخدام DNAD ، يمكن فرز سبع خلايا A A D من كل مجموعة فرعية من منطقة PRO E A و A و B و A EC.

هنا يتم عرضها في مستحضرات السيتوزين التي تظهر النضج المتسلسل مع تناقص حجم الخلية والتكثيف النووي وزيادة اللون البني مما يعكس تعبير الهيموجلوبين. أخيرا ، يظهر هنا تحليل تمثيلي لدورة الخلية للمجموعة الفرعية S3 في كبد الجنين E 13.5. تم حقن الفئران الحامل ب BRDU.

تم حصاد كبد الجنين بعد 30 إلى 60 دقيقة من التجعيد الثابت وتلطيخه بالأجسام المضادة ضد CD 71 و TER one 19 و BRDU. يتم تحليل حالة دورة الخلية لخلايا S3 حيث توجد خلايا الطور S. يتم قياس محتوى BRDU الإيجابي ومحتوى الحمض النووي عن طريق تلطيخ صبغة الحمض النووي سبعة A a d.

نهج القياس الخلوي الذي نصفه بالتحقيق المتزامن للوظائف الخلوية مثل التعبير عن علامات سطح الخلية والبروتينات الأخرى ، وإشارات خلية بقاء الخلية باستخدام الأجسام المضادة المحددة للحفرة وحالة دورة الخلية. لذلك يسمح لنا بالتحقيق في الاستجابات الجزيئية للأرومات الحمراء ، وهي مرحلة نضج مختلفة لمجموعة واسعة من المحفزات أو تأثير الطفرات الجينية. وتجدر الإشارة إلى أن المجموعات الفرعية لنضج التدفق الخلوي محددة من حيث تعبير علامة سطح الخلية والتشتت الأمامي.

وجدنا أنه بشكل عام ، تتوافق الخلايا في كل مجموعة فرعية مع مرحلة الأرومة الحمراء المورفولوجية المماثلة في مجموعة متنوعة من نماذج الفئران. ومع ذلك ، نوصي بالتحقق من ذلك عند فحص نموذج ماوس جديد. من خلال فرز الخلايا من كل مجموعة فرعية وفحص مورفولوجيتها ، يمكن أيضا فرز الخلايا من كل مجموعة فرعية لتحليل الحمض النووي الريبي أو النسخ ، واختبار الفرز ، واستخدام ضغوط فرز منخفضة وأنوف واسعة من أجل تقليل الضغط الهائل على الخلايا.

نوصي أيضا بالتحقق من نقاء الخلية وقابليتها للحياة بعد كل تجربة فرز. أخيرا ، عند اكتشاف تغيير في تكرار مجموعة فرعية معينة ، من المهم تحديد ما إذا كان هذا بسبب تغيير حقيقي في عدد الخلايا في تلك المجموعة الفرعية أو ما إذا كان بسبب تغييرات في مجموعات فرعية أخرى. لذلك ، بالإضافة إلى قياس ترددات المجموعة الفرعية ، من الضروري دائما قياس العدد المطلق للخلايا في كل مجموعة فرعية.