تنبيغ من خلايا الإنسان مع البوليمر المعقد Ecotropic الفيروسة البطيئة للسلامة الأحيائية المحسن

الهدف العام من التجربة التالية هو إدخال الجينات المسرطنة أو جينات أخرى قد تكون خطيرة في الخلايا البشرية باستخدام الفيروسات البطيئة ذات الميول الصدوية (echo tropic lentivirus). ويتم تحقيق ذلك عن طريق إنتاج فيروسات بطيئة شاملة الميول (pantropic lentivirus)، ترمز لمستقبل الفيروسات الارتجاعية للفئران، بالإضافة إلى فيروسات بطيئة ذات ميول صدوية ترمز للجين المستهدف؛ حيث يتم نقل مستقبل الفيروسات الارتجاعية للفئران إلى الخلايا، مما يجعلها قابلة للعدوى بالفيروسات ذات الميول الصدوية. بعد ذلك، تُنقل الخلايا بواسطة الفيروسات ذات الميول الصدوية من أجل إدخال الجين المسرطن باستخدام عملية تعقيد البوليمر مع poly brain وكبريتات الكوندرويتين لتعزيز كفاءة النقل. وتُظهر النتائج التي تم الحصول عليها حدوث نقل انتقائي للخلايا البشرية باستخدام الفيروسات البطيئة ذات الميول الصدوية بناءً على الفحص المجهري الفلوري وتقنية FACS.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الموجودة، مثل ترانسدكشن الفيروسات القهقرية غاما، في قدرة الجسيمات الفيروسية البطيئة على نقل المادة الوراثية بفعالية أكبر إلى أنواع عديدة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا غير المنقسمة مثل الخلايا الجذعية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال أبحاث السرطان والخلايا الجذعية، مثل فهم وظيفة الجينات الورمية المحتملة. قبل البدء في هذا الإجراء، استشر مسؤول السلامة في مؤسستك واتبع إرشادات السلامة الموصى بها.

ابدأ بمستنبت من خلايا 2 9 3 T السليمة سريعة النمو أثناء العمل داخل غطاء زراعة الأنسجة. وفي ظل ظروف معقمة، قم بإعادة تعليق 5 × 10⁶ من خلايا 2 9 3 T في 10 milliliters من وسط 2 9 3 T الخالي من المضادات الحيوية. انقل معلق الخلايا باستخدام الماصة إلى طبق زراعة أنسجة بقطر 10 centimeter، ثم حضن الطبق طوال الليل في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 °C و 5% carbon dioxide.

في اليوم التالي، ابدأ عملية عفن الخلية (transfection) في وقت متأخر من بعد الظهيرة. أولاً، اجمع كمية محددة من Optum وبلازميدات التغليف والمغلف (transfer packaging and envelope plasmids) واتركها حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم اسحب 375 µL من Optum باستخدام الماصة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق، وأضف بعد ذلك 25 µL من كاشف FUgene HD transfection reagent. تأكد من سحب كاشف FUgene بالماصة مباشرة في الوسط بحيث لا يلامس جدار الأنبوب.

بعد ذلك، في أنبوب طرد مركزي صغير ثانٍ، اخلط 5 µg من بلازميد النقل، و3.75 µg من بلازميد التعبئة، و1.25 µg من بلازميد الغلاف في الكمية المطلوبة من Optum لرفع الحجم إلى 100 µL. ثم أضف Optum Fuji المخلوط إلى الأنبوب الذي يحتوي على مزيج البلازميد، واحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 20 و30 دقيقة. وخلال الدقائق القليلة الأخيرة من فترة الحضن، اسحب الوسط برفق شديد من الطبق الذي يحتوي على خلايا 2 9 3 T واستبدله بـ 10 mL من وسط 2 9 3 T حديث وخالٍ من المضادات الحيوية.

أخيرًا، أضف خليط بلازميد جين FU قطرة بقطرة إلى الوسط الغذائي في الطبق الذي قطره 10 سنتيمتر. ضع الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة مضبوطة على 37 °C و5% carbon dioxide واتركه في الحضانة طوال الليل. في اليوم التالي، اسحب الوسط الغذائي من الطبق بعناية شديدة واستبدله بوسط 2 9 3 T طازج وخالٍ من المضادات الحيوية.

بعد ذلك، أعد الطبق إلى حاضنة زراعة الأنسجة واتركه للحضن لمدة يومين إضافيين؛ وبعد مرور ثلاثة أيام على عملية عفن الخلايا (transfection)، اشفط الوسط المحتوي على الفيروس من الطبق وقم بترشيحه باستخدام مرشح بمسامية 0.45 micron منخفض الارتباط بالبروتين. بعد عملية الترشيح، قم بإجراء تخفيفات تسلسلية لفيروس تحكم فلوري في وسط طازج خالٍ من المضادات الحيوية يحتوي على 6 µg/mL من polybrene، واستخدم هذه التخفيفات لنقل الجينات (transduce) إلى خلايا الخط الخلوي المناسب. في طبق يحتوي على 24 بئراً، قم بتغيير الوسط في اليوم التالي إلى وسط طازج خالٍ من المضادات الحيوية، ثم استمر في الحضن لمدة يومين إضافيين للسماح للخلايا بالتعبير عن البروتين الفلوري.

استخدم الحقائق لتحديد كسر الخلايا التي تم نقل الجينات إليها لكل تخفيف فيروسي. ثم احسب العيار بوحدات التحويل لكل مللي لتر بناءً على التخفيفات التي تعطي نسبة نقل أقل من 15% لتقليل أحداث النقل المتعدد. ويُفترض أن يكون عيار الفيروسات العدسية الأخرى غير الفلورية التي تم إنتاجها بالتوازي مشابهاً لعيار الفيروس الفلوري.

لنقل الجينات إلى الخلايا المستهدفة، ابدأ باختيار تعدد عدوى أكبر من اثنين لضمان نقل الجينات إلى معظم الخلايا. أولاً، قم بتخفيف السائل الطافي الفيروسي إلى تعدد العدوى المطلوب في وسط زراعي كامل وطازج، مضافاً إليه 6 µg/mL من polybrene ليصل الحجم النهائي إلى 1 mL.

قم بشفط الوسط من طبق قطر 35 مليمتر يحتوي على الخلايا المستهدفة، ثم أضف 1 مل من الرائق الفيروسي المخفف. يتم التحضين في حضانة زراعة الأنسجة لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة للسماح بالتعبير الكافي عن مستقبل SLC7A1 إذا لزم الأمر. استخدم الاختيار بالمضادات الحيوية باستخدام blasticidin لاختيار الخلايا التي تم نقل الجينات إليها بشكل مستقر وتعبر عن SLC7A1 وفقاً للتعليمات الواردة في الإجراء المكتوب.

لبدء تحديد السُميّة، قم بتحضير محلول مخزون من كوندرويتين سلفات بتركيز 20 mg/mL ومحلول مخزون من Poly brain بتركيز 20 mg/mL في الماء، ثم قم بترشيحهما باستخدام مرشح معقم. يمكن تخزين المحاليل المخزونة الفائضة عند درجة حرارة -20 °C حتى وقت الحاجة إليها.

بعد ذلك، حدد عدد مزارع الخلايا في أطباق ذات 96 بئراً والمطلوبة لتقدير سمية المعقد البوليمري بدقة. وباستخدام مقايسة MTT، يجب اختبار ستة تركيزات على الأقل من كبريتات الكوندرويتين وpoly green في ثلاث مكررات. بالإضافة إلى ذلك، يجب تضمين خلايا غير مختزلة وخلايا منمّاة في وسط خالٍ من المصل.

يجب تضمين الوسط الغذائي لتوفير خط أساس للخلايا السليمة وللتحكم في توقف النمو على التوالي. بمجرد تحديد عدد الآبار المطلوبة، يتم توزيع 5,000 من الخلايا المستهدفة في كل بئر من طبق بـ 96 بئراً، وبالتوازي يتم توزيع الخلايا في طبق بـ 24 بئراً لإجراء تحليل مجهري أو تحليل قائم على الحقائق لكفاءة ترنسدكشن في كل حالة تجريبية، مع ترك مجموعتي الخلايا لتنمو طوال الليل. في اليوم التالي، يتم إضافة جزء من المحلول المخزون لـ chondroitin sulfate وجزء من المحلول المخزون لـ poly brain.

ثم قم بتخفيف الفيروس الذي يشفر GFP في وسط خالي من المضادات الحيوية يحتوي على 6 µg/mL من poly brain حتى تصل تعددية العدوى إلى درجة كافية لنقل العدوى إلى ما يقرب من 10 إلى 50% من الخلايا المستهدفة لكل بئر. تأكد من توفر كمية كافية من الفيروس المخفف لكل حالة اختبار بالإضافة إلى آبار التحكم في كل طبق. قم بتمييز مجموعة من الأنابيب بكل تركيز من chondroitin sulfate وبوليمر poly green المراد اختباره.

بعد ذلك، يتم توزيع كميات متساوية من المعلق الفيروسي لكل حالة في ثلاث مكررات داخل الأنابيب. ثم، يتم سحب الحجم المطلوب من المحلول المخزني لـ chondroitin sulfate و poly brain بالماصة لإكمال تركيزات الاختبار في كل أنبوب على التوالي. ومباشرة بعد إضافة chondroitin sulfate و poly green، يتم هز الأنبوب بخفة للمزج.

اترك خلائط الفيروس مع كبريتات الكوندرويتين بولي جرين لتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قد يصبح الخليط عكراً نتيجة تكون الرواسب الفيروسية. بعد انتهاء فترة التحضن، قم بسحب الوسط من آبار صفيحة الـ 96 بئراً.

ثم أضف خليط الفيروس وكبريتات الكوندرويتين واللون الأخضر متعدد الألوان إلى الآبار حسب المخطط. وكذلك قم بنقل وسائط التحكم والوسائط الخالية من المصل إلى الآبار المناسبة باستخدام الماصة. كرر العملية بالنسبة للصفيحة ذات الـ 24 بئراً، ثم حضّنها طوال الليل في حاضنة الزرع النسيجي.

بعد ذلك، قم بشفط الوسط المحتوي على الفيروس من الأطباق واستبدله بوسط جديد. أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة. بعد مرور 48 ساعة، قم بإخراج الطبق ذو الـ 24 بئراً واستخدم تقنية FACS لتحليل كفاءة ترنسدكشن لكل تركيز من كبريتات الكوندرويتين والـ poly brain.

في اليوم التالي، يتم سحب الوسط من جميع آبار طبق الـ 96 بئر واستبداله بـ 100 µL من محلول MTT، ثم تُحضن العينات لمدة ثلاث ساعات في حاضنة رطبة للسماح باختزال MTT داخل الميتوكوندريا في الخلايا النشطة أيضياً. وبعد مرور ثلاث ساعات، يتم سحب محلول MTT واستبداله بـ 200 µL من محلول المذيب.

يُحضن الطبق لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو حتى يتكون MTT الأرجواني بالكامل وتذوب الرواسب. تُقرأ الامتصاصية باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة عند 570 نانومتر، مع طرح قراءة الخلفية عند 690 نانومتر. سيعطي التركيز الأمثل للبوليمر أقصى تعزيز لعملية ترانسدكشن (transduction) وفقاً للحقائق، مع أقل تأثير على النشاط الأيضي كما هو محدد بواسطة MTT لـ hdfs.

100 µg/mL من كوندرويتين سلفات. تركيز بوليمر Poly brain هو التركيز الأمثل وفقاً لما تم تحديده بهذه الطريقة. أولاً، قم بتحضير كمية كافية من خليط Poly green الفيروسي surnatant مع كوندرويتين سلفات بتركيز 100 µg/mL لنقل العدوى إلى العدد المطلوب من أطباق قطرها 35 ملم التي تحتوي على خلايا HDF المعبرة عن مستقبل SLC7A1. قم بحضن الخليط لمدة خمس دقائق للسماح بتكوين معقدات البوليمر.

بعد ذلك، يتم سحب الوسط من الخلايا المستقبلة التي تعبر عن الخلايا المستهدفة واستبداله بالمزيج الفيروسي، ثم تُحضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و5% carbon dioxide بعد إزالة المزيج الفيروسي. تُغسل أسطح الخلايا مرتين باستخدام PBS للمساعدة في إزالة المعقدات الفيروسية. ليس من الضروري الإزالة الكاملة، حيث لم تُلاحظ أي آثار سلبية على صحة الخلايا نتيجة لبقاء المعقدات البوليمرية المتبقية.

توضح صورة المجهر الفلوري هذه حدوث ترنسدكشن كافٍ لخلايا الساركوما البشرية التي تعبر بشكل مستقر عن SLC7A1 باستخدام فيروس تروبيك، وذلك عند استخدام ناقلات تحكم فلورية لمراقبة كفاءة الترنسدكشن. ويظهر القياس الكمي للفلورة باستخدام تحليل FACS أن كفاءة الترنسدكشن تزيد عن 90%. وبوجه عام، تكون معدلات الترنسدكشن في خلايا HDFS أقل لأن الخلايا لم يتم استزراعها أو اختيارها للتعبير عن المستقبلات؛ حيث تكون عيارات الفيروسات اللنتيفيروسية التروبيك عموماً من 10 إلى 20% من الفيروسات شبه النمطية VSV التي قيست على S-L-C-H-S-C. ويسمح اختبار حيوية MTT بالكشف الحساس عن توقف النمو في الخلايا المستهدفة كما هو موضح هنا، عند الترنسدكشن باستخدام الفيروس بالإضافة إلى تركيزات من كوندرويتين سلفات.

لا يوجد تأثير لـ Poly brain بتركيز يصل إلى 800 micrograms per milliliter على عملية التمثيل الغذائي لخلايا HDF. يُظهر تحليل Fax لخلايا HDFs التي تم نقل الجينات إليها باستخدام الفيروس مع تركيزات مختلفة من كوندرويتين سلفات أن Poly green يُعزز من عملية نقل الجينات مقارنةً باستخدام poly green وحده.

يحدث أقصى تعزيز عند 100 µg/mL. وتكون قيم كبريتات الكوندرويتين في الدماغ أقل بعدة أضعاف من القيم المبلغ عنها سابقاً. لذا، من المهم تحسين الظروف لأي نوع من الخلايا عند تعقيدها مع كبريتات الكوندرويتين.

يعزز الـ Poly brain العيار الملحوظ، بنحو ثلاثة أضعاف في S-L-C-H-S-C. وعملياً، يؤدي هذا إلى تأثير أكبر على كفاءة نقل الجينات عند التركيزات الفيروسية المنخفضة مقارنة بالتركيزات الأعلى، وهو ما يرجع على الأرجح إلى وجود خلايا متعددة منقول إليها الجينات وتشبع المستقبلات عند التركيزات الفيروسية الأعلى. ويعد النقل باستخدام الفيروس الموجه (tropic virus) نوعياً للخلايا التي تعبر عن مستقبل الفيروس القهقري العصبي.

عند نقل الفيروسات الموجهة إلى خلايا بشرية غير معدلة، لم يُلاحظ وجود فلورة تتجاوز الخلفية غير المختزلة عند الفحص المجهري بواسطة تحليل fax. ولا تظهر خلايا HDFS أي عملية نقل في غياب المستقبل، بينما يؤدي النقل المسبق مع المستقبل إلى ظهور خلايا مفلورة. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التحقق من أن الفيروس لن يقوم بنقل المادة الوراثية إلى الخلايا البشرية المعدلة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الفيروس البطيء الموجه (tropic lentivirus) لنقل الجينات التي قد تكون خطرة إلى الخلايا البشرية، بما في ذلك استخدام التعقيد البوليمري (polymer complexation) لتعزيز عملية التنقيل (transduction).