تقييم التنمية وظيفة الغدة الثديية في نماذج الماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم تطور الغدد الثديية في الفئران من النوع البري والفئران الطافرة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح الفأر للكشف عن الغدد الثديية. بعد ذلك، يتم حصاد الغدد الثديية بشكل صحيح وفردها على شرائح زجاجية، calm lum.

يُستخدم التلوين بعد ذلك لتحليل مدى تطور الظهارة. وأخيرًا، يتم إجراء تحليل لانقباضات الخلايا العضلية الظهارية عند التعرض للأوكسيتوسين، INEA J. وفي النهاية، ستكشف النتائج التي تم الحصول عليها عما إذا كانت قنوات الغدة الثديية والحويصلات قد تشكلت بشكل صحيح، وعما إذا كان يمكن تحفيز الظهارة العضلية للانقباض وطرد الحليب عند التعرض للأوكسيتوسين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بتطور الغدة الثديية وتمايزها، مثل تأثير الطفرة الجينية أو التعطيل الجيني على مورفولوجيا الغدة الثديية ووظيفتها.

يضمن العرض المرئي لهذه الطريقة التشريح السليم للغدة الثديية، حيث يتطلب كل من التثبيت في الفتحات والمقايسة المعتمدة على الأوكسيتوسين غدداً ثديية مُعدة جيداً. قد يؤدي التشريح غير الدقيق للغدة إلى غياب بعض القنوات الظهارية أو وجود أنسجة غريبة مثل الجلد أو الأنسجة العضلية. قبل يوم واحد على الأقل من التشريح، قم بتحضير محلول CalMin alum عن طريق إذابة 1 g من CalMin و 2.5 g من كبريتات ألومنيوم البوتاسيوم في 500 mL من الماء المقطر.

اغلِ المحلول لمدة 20 دقيقة في دورق سعة لتر واحد، ثم اضبط الحجم النهائي إلى 500 milliliters بالماء. قم بترشيح المحلول باستخدام ورقة watman وأضف بضع حبيبات من thiol كمادة حافظة. بعد ذلك، احفظ المحلول في الثلاجة بعد عملية الصبغ.

يمكن صب محلول ألوم الكربون مرة أخرى في زجاجة المخزون وإعادة استخدامه عدة مرات على مدار عدة أسابيع. قم بتحضير محلول جديد عندما يصبح اللون باهتًا. لبدء تشريح الغدة الذاكرة، يتم التضحية بالفأر باستخدام الاستنشاق بـ carbon dioxide.

تجنب خلع الفقرات العنقية قدر الإمكان لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الأوعية الدموية الرئيسية في الرقبة وينتج عنه تراكم الدم حول الغدة الثدية، مما يجعل تشريحها على رغوة البوليسترين الملفوفة بورق القصدير أكثر صعوبة. ضع الفأر على ظهره وبسط أطرافه الأربعة.

قم بتثبيت جميع الأطراف الأربعة بإحكام باستخدام إبر من قياس 16 إلى 20. رش الفأر بسخاء بـ 70% ethanol باستخدام الملاقط. اسحب جلد البطن عند الخط الناصف وأجرِ شقاً صغيراً باستخدام مقص حاد بدءاً من مكان الشق.

قم بقص الجلد وصولاً إلى رقبة الحيوان مع تجنب ثقب التجويفين البطني أو الصدري. قص الجلد على القوائم الأمامية وصولاً إلى الشق الوسطي ليتشكل شكل Y. قم بقص الجلد على الأطراف الخلفية بنفس الطريقة.

باستخدام ملاقط إرقاء الدم، قم بتقشير جلد البطن والصدر بلطف إلى جانب الفأر إذا لزم الأمر. ثم قم بقطع النسيج الضام بلطف.

قم بتثبيت الجلد على رغوة البوليسترين باستخدام إبر من مقاس 16 إلى 20، مع كشف الغدد الثديية الملتصقة بالجانب السفلي من الجلد. قم بتشريح غدة واحدة في كل مرة باستخدام الملاقط. ارفع الغدة الثديية المستهدفة برفق واقطع ما بين الغدة والجلد باستخدام مقص صغير حاد، بدءاً من الخارج باتجاه العمود الفقري للحيوان.

تأكد من القطع بعناية لضمان عدم بقاء أي قطع من الجلد أو العضلات على الغدة. يمكن إزالة جميع الغدد الثديية باستخدام هذا البروتوكول، ولكن الغدد الثديية البطنية رقم 4 هي الأفضل لعملية التثبيت الكامل (whole mounting). بعد استئصال الغدة الثديية من الفأر، افردها مباشرة على شريحة زجاجية.

حاول بسطها قدر الإمكان. فمن خلال الحفاظ على شكل الغدة الأصلي في مكانها، ستلتصق بالشريحة بشكل جيد. وعندما يتم تمديدها بشكل صحيح داخل خزانة استخلاص الغازات، يتم تثبيت الغدة عن طريق غمر الشريحة في وعاء يحتوي على car noise.

يُوضع النسيج في المادة المثبتة لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. وبدلاً من ذلك، يمكن تثبيت الغدة طوال الليل في درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، يُغسل النسيج بـ 70% ethanol لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك، أعد ترطيبها تدريجياً في الماء عن طريق إزالة نصف محلول الإيثانول من الوعاء واستبداله بماء مقطر مرتين. قم بالتحضين لمدة خمس دقائق. كرر العملية ثلاث مرات، ثم اشطفها بماء مقطر مرتين لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، تُصبغ الغدة في محلول ألومنيوم الكربون طوال الليل في درجة حرارة الغرفة، وفي اليوم التالي، يُزال صبغ ألومنيوم الكربون لإعادة استخدامه، ثم يتم تجفيف النسيج المصبوغ تدريجياً من خلال حمامات إيثانول متسلسلة لمدة خمس دقائق لكل منها. ثم يتم ترويق النسيج في الزايلين طوال الليل، وبعد الترويق، تُغمر الغدة الثديية في ميثيل ساليسيلات، مع إبقاء ميثيل ساليسيلات في خزانة استخلاص الغازات حتى تصبح الصور جاهزة للالتقاط. يمكن قياس تطور الغدة الثديية عن طريق عد عدد التفرعات أو الفروع الجانبية على طول أجزاء من القنوات، أو يمكن تقييم طول القنوات الأولية أو نسبة مساحة النسيج الظهاري إلى النسيج الدهني.

يتضمن مقايسة ثانية تُستخدم لتقييم تطور الغدة الثديية ووظيفتها تعريض الغدة للأوكسيتوسين وتقييم قذف الحليب في القنوات الظهارية. ولإجراء هذه المقايسة، يجب فطام الجراء التي تغذت حديثاً عن الأم وإبقاء الأم في عزلة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، يتم تضحية الأم وكشف الغدد الثديية كما هو موضح في عملية تشريح الغدة الثديية.

ومع ذلك، اتركها داخل الحيوان. ابدأ المقايسة باستخدام ماصة نقل لتقطير من ثلاثة إلى خمسة ملليلترات من إما PBS أو محلول الأوكسيتوسين بشكل متساوٍ مباشرة على الغدة الثديية المستهدفة. لهذا الإجراء، يُنصح باستخدام الغدد الصدرية، مع استخدام جانب واحد كمجموعة ضابطة والجانب الآخر لاختبار قذف الحليب.

قم بتحضين الغدد لمدة دقيقة واحدة ثم قم بإزالة المحاليل عن طريق شفطها بعناية باستخدام ماصة نقل، وراقب دخول الحليب إلى القنوات عن طريق تسجيل فيديو أو التقاط صور قبل وبعد التعرض لـ PBS أو الأوكسيتوسين. فيما يلي أمثلة على ذاكرة الفأر. يمكن ملاحظة ظهارة القنوات في تركيبات الغدة الكاملة (المشار إليها بالأسهم)، والعقدة الليمفاوية (المشار إليها برأس السهم) بسهولة في غدة ثدية كاملة مفرودة بشكل جيد.

قد تنفصل الغدة الثديية غير المفرودة جيداً عن الشريحة وتنهار، مما يجعلها غير صالحة للاستخدام. كما يمكن أن تفتقر الغدة الثديية المستأصلة بشكل غير صحيح إلى بعض الأجزاء، أو قد تظل بها قطع من العضلات أو الجلد. ويمكن ملاحظة قذف الحليب الناجم عن الأوكسيتوسين في بط الأنسجة الطلائية بعد التعرض للأوكسيتوسين.

ومع ذلك، إذا كانت القنوات ممتلئة بالفعل بالحليب في بداية المقايسة نتيجة لفترة كمون طويلة بشكل غير مناسب بعد آخر عملية رضاعة للجراء، فسيكون من الصعب ملاحظة المزيد من تراكم الحليب في القنوات بعد التعرض للأوكسيتوسين. وبدلاً من ذلك، فإن فترة الكمون القصيرة بعد رضاعة الجراء ستمنع تراكم كمية كافية من الحليب في الحويصلات لتمكين ملاحظتها بشكل صحيح في القنوات بعد التعرض للأوكسيتوسين عقب تشريح الغدد الثديية. وبدلاً من التثبيت الكامل أو تقييم طرد الحليب الناجم عن الأوكسيتوسين، يمكن تجميد الغدد الثديية، وعمل مقاطع تجميدية لها، ووسمها مناعياً لأي عدد من البروتينات المقيمة في الغدد الثديية.

أو بدلاً من ذلك، يمكن إذابة الغدد باستخدام القلويات وتحضيرها لتحليل لطخة ويسترن. وقد سمح هذان التقييمان معاً بمعالجة أسئلة جوهرية تتعلق بتطور الغدد وتمايزها ووظيفتها في أي عدد من نماذج الفئران التي تم هندستها لتفتقر إلى جينات رئيسية أو تحمل طفرات جينية.