تسلسل الدقيقة البكتيرية في الدم المحيطي : لدينا تجربة مع المرضى المصابين بفيروس الإيدز

تسلسل الميكروبيدات البكتيرية التي تنتقل في الدم المحيطي. من خلال خبرتنا مع المرضى المصابين بفيروس HIV، أنا جونيور مارتي، وأعمل كأستاذ مساعد في عيادة الأمراض المعدية والطب الاستوائي بجامعة ميلانو في إيطاليا. وسنعرض لكم الآن تجارب حول كيفية الكشف عن الحمض النووي البكتيري وتسلسله من الدم المحيطي للمرضى المصابين بفيروس HIV.

يُستعمر الجهاز الهضمي السليم بمجموعة متنوعة وكبيرة من الميكروبات المتعايشة التي تؤثر على تطور الجهاز المناعي الخلطي والخلوي. وتكون الميكروبيوتا محمية من الجهاز المناعي عبر حاجز مخاطي قوي، إلا أن تغيرات في الجهاز الهضمي تحدث عقب عدة حالات سريرية مثل العدوى، والعلاج بالمضادات الحيوية، ومضاعفات ما بعد الجراحة، وكذلك لدى المرضى المصابين بالسرطان، والتهاب البنكرياس، وسوء التغذية.

تؤدي عدوى HIV إلى حدوث خرق في الحاجز المعدي المعوي مع فشل تدريجي في المناعة المخاطية وتسرب النواتج الحيوية البكتيرية إلى الدورة الدموية الجهازية، مثل lipopolysaccharide وشظايا DNA البكتيرية، مما يساهم في التنشيط المناعي الجهازي، وهو ما يوضح المراحل التجريبية للكشف عن DNA البكتيري وتسلسله. ستحضر Camilla ti، زميلة الأمراض المعدية، وEsther، طالبة الدكتوراه، وju MariaI، زميلة ما بعد الدكتوراه، وجميعهم من عيادة الأمراض المعدية والطب المداري بجامعة ميلانو، حيث يتواجد هؤلاء المرضى المصابون بعدوى HIV في الدم المحيطي. تهدف تجربتنا إلى تحديد الأنواع البكتيرية في عينات الدم المحيطي من المرضى المصابين بعدوى HIV.

سنستخدم دمًا كاملاً من كل من الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية والأشخاص الأصحاء، نظرًا لأن الأفراد الأصحاء يتمتعون بتوازن معوي طبيعي. ولا نتوقع رؤية ميكروفلورا منتقلة لدى هؤلاء المرضى. سيتم جمع الدم الكامل من المرضى يليه فصل البلازما.

سيتم بعد ذلك استخراج الحمض النووي DNA لإجراء تفاعل PCR واسع النطاق لجين PCIC 16 s الريبوسومي. وعقب الحصول على ناتج PCR، سيتم إجراء عمليات التنقية والاستنساخ وتحليل التسلسل. وتتمثل الخطوة الأولى من تجربتنا في جمع الدم عن طريق سحب الوريد، يليه فصل البلازما.

يُسحب دم كامل، بكمية تقارب 9 mL، في أنابيب تحتوي على EDTA. توضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي بسرعة 2000 RPM لمدة 10 دقائق. يتيح الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة فصل البلازما.

سيتم الآن استخلاص الـ DNA من عينات البلازما الخاصة بنا. قم بتطهير غطاء السلامة البيولوجية والمصوبات والمواد اللازمة للتجربة بشكل كافٍ لضمان التعقيم، مع وضع جميع المواد تحت أشعة UV لمدة 30 دقيقة على الأقل. أطفئ أشعة UV، وامسح القفازات بمطهر، وانقع بعض المناشف الورقية في الإيثانول وضعها تحت غطاء السلامة لاستخدامها في كل مرة يتم فيها التخلص من رأس المصوبة. وأثناء إجراء عملية استخلاص الـ DNA، امسح المصوبة باستخدام المناشف الورقية المبللة.

أنت الآن مستعد لاستخلاص الحمض النووي (DNA). يتم استخلاص الـ DNA باستخدام عدة تجارية، مع اتباع تعليمات الشركة المصنعة. وباختصار، يتم وضع 350 µL من البلازما في أنبوبين من نوع eend orph سعة 2 mL.

يُستخدم الماء عالي النقاء كعينة ضابطة سالبة. يُضاف 10 µL من الليزوزوم بتركيز نهائي قدره 1 mg/mL إلى العينات. ثم تُحضن العينات لمدة 30 دقيقة.

عند درجة حرارة 37 °C، يُضاف المحلول A والكلوروفورم والمحلول B إلى العينات وفقاً للتعليمات بعد عملية الطرد المركزي. ستظهر ثلاث طبقات منفصلة. يتم جمع الطبقة العلوية وإضافتها إلى إيثانول بارد، مما يسمح بترسيب DNA، ثم يُقاس تركيز DNA باستخدام جهاز مطياف الضوء.

تتمثل الخطوة التالية في إجراء تفاعل PCR واسع النطاق لتضخيم الجين الريبوسومي 16 s لـ PRIC في غرفة مخصصة. يتم تحضير خليط PCR باستخدام هذه الكواشف. ثم يتم تدوير خليط PCR لمدة 30 دقيقة عند 500 G في درجة حرارة أربع درجات مئوية، وذلك لتجنب التلوث المحتمل بإنزيم البوليميراز البكتيري.

يتم بعد ذلك تقسيم خليط PCR إلى حصص متساوية، وذلك وفقاً لعدد العينات المراد تضخيمها. تذكر تخصيص حصص لعناصر التحكم في التفاعل السلبية والإيجابية.

يتم برمجة التدوير الحراري (THERMOCYCLING) وفقًا للشروط التالية: 94 °C لمدة خمس دقائق، ثم 94 °C و 55 °C و 72 °C لمدة دقيقة واحدة لكل دورة ولمدة 40 دورة، وأخيرًا 72 °C لمدة 10 دقائق. يبلغ متوسط المدة ثلاث ساعات.

يتم تصور نواتج تفاعل PCR على هلام AGROS بتركيز 2%. يظهر هذا الهلام بتركيز 2% من agros نواتج تفاعل PCR. يحتوي المسار الأول على سلم الحمض النووي بحجم 100 زوج قاعدي.

المسار الثاني، ضابط موجب لتفاعل PCR. ويحتوي المسار الثالث على ضابط سالب لتفاعل PCR. بينما يظهر المسار الرابع عينات من مريض مصاب بفيروس HIV، ويحتوي المسار الخامس على مسار الماء.

تظهر الحارة السادسة عينات من فرد سليم وتفاعل PCR سلبي. وتحتوي الحارة السابعة على الماء. والخطوة التالية هي التحقق من الـ PCR.

يتم تنقية نواتج PCR باستخدام طقم تجاري، وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وتُستخدم العديد من الأعمدة التي تحتوي على مرشحات في هذه الخطوة. كما تُسجَّل نتائج PCR في ورقة عمل.

سوف ننتقل الآن إلى عملية الاستنساخ باستخدام تقنية الفحص الأزرق والأبيض، وهي تقنية جزيئية تتيح الكشف عن نجاح عملية ربط DNA داخل ناقل. يتم تحويل الناقل إلى خلايا بكتيرية مؤهلة.

تُنمّى الخلايا المختصة في وجود xal. إذا نجحت عملية الربط، ستكون المستعمرة البكتيرية بيضاء اللون. أما إذا لم تنجح، فستكون المستعمرة زرقاء.

يُستخدم Xal لتحديد ما إذا كانت الخلية تعبر عن إنزيم beta galacto aase ولتصوير عملية تحول مستعمرات e coli، حيث يحفز IPTG التعبير عن beta galacto. aase. يتم توزيع Xal و IPTG عن طريق تدوير الأطباق التي تحتوي على ampicillin. ويتم تحضير خليط استنساخ يحتوي على نواتج PCR و SALT و ناقل استنساخ وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

توضع خلايا E coli على الثلج. يُضاف بعد ذلك خليط الاستنساخ إلى الخلايا، والتي تُحضن لاحقاً في أطباق بعد تعرضها للصدمة الحرارية طوال الليل عند 37 درجة Celsius. وبعد التحضين، تنمو مستعمرات بيضاء وزرقاء على الأطباق.

تعتبر المستعمرات البيضاء إيجابية لمنتجات PCR. بينما تعتبر المستعمرات الزرقاء سلبية لعملية إدخال منتج PCR. يتم اختيار 10 مستعمرات بيضاء ومستعمرة زرقاء واحدة.

توضع كل مستعمرة في 2 mL من وسط نمو LB السائل. تُحضن المستعمرات في وسط مضاف إليه الأمبيسيلين طوال الليل عند 37 °C. وبعد الحضانة، تُستخدم المستعمرات التي نمت طوال الليل لاستخلاص البلازميد باستخدام طقم استخلاص مصغر (mini prep kit) تجاري.

تُستخدم الأعمدة الصغيرة التي تحتوي على مرشحات في هذه الخطوة. بعد استخلاص البلازميد، يتم تصوير البلازميدات على هلام AROS بتركيز 0.7%. هذا هلام AROS بتركيز 0.7% يوضح نواتج التحضير المصغر (mini prep). يحتوي المسار الأول على سلم جزيئي بمقياس 1 كيلو قاعدة.

يحتوي المسار الثاني على مستعمرة التحكم الزرقاء. بينما تحتوي المسارات من الثالث إلى الثاني عشر على مستعمرات بيضاء. يتم تسجيل النتائج في ورقة عمل، ثم تليها خطوة تحديد التسلسل، حيث يتم تضخيم البلازميدات.

يتم تحضير خليط باستخدام هذه الكواشف. يُقسم خليط PCR إلى أجزاء متساوية وفقاً لعدد العينات التي تتطلب التضخيم. تُبرمج الدورة الحرارية وفقاً للشروط التالية: 96 °C لمدة دقيقة واحدة، و96 °C لمدة 10 seconds، و50 °C لمدة خمس ثوانٍ، و60 °C لمدة أربع دقائق.

لمدة 25 دورة. يبلغ متوسط المدة ساعة واحدة تقريباً. بعد التضخيم، يتم تنقية نواتج PCR باستخدام أعمدة تحتوي على مرشحات.

يتم تحميل النواتج المنقاة على لوحة، والتي توضع بعد ذلك في جهاز تسلسل الحمض النووي. وبمجرد الحصول على تسلسل مُحدد، يتم إدخاله في برنامج blast لتحديد الأنواع البكتيرية من كل مستعمرة. وتعتبر المستعمرات التي تظهر تسلسلاً بمتماثلة تتراوح بين 98%to 100% موجبة.

هذا مثال على التسلسل البكتيري في بلازما شخص واحد مصاب بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV). تُظهر نتائجنا أن الانتقال الميكروبي في مرض نقص المناعة البشرية يتضمن فلورا متعددة الميكروبات. لقد أثبتنا بموجب ذلك أن المرضى المصابين بفيروس HIV يظهرون ميكروفلورا ميكروبية متعددة الميكروبات بنسبة عالية في الدورة الدموية الجهازية.

كان الحمض النووي البكتيري في الدم المحيطي أقل من حد الكشف لدى الأفراد الأصحاء السلبيين لفيروس نقص المناعة البشرية، وهو ما قد يعكس سلامة الجهاز الهضمي. يركز بحثنا حالياً على فهم واستقصاء الدور المحتمل للميكروبيوتا في الدم المحيطي، في تهيئة الإمراض المناعي لفيروس نقص المناعة البشرية، وربما في الاستجابة للعلاج.