شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحويل خلايا الخميرة بمكتبة مصفوفة من الحمض النووي للبلازما. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة كمية مناسبة من خلايا الخميرة أولا. ثم تتم معالجة خلايا الخميرة بخلات الليثيوم لجعلها مؤهلة لتحويل الحمض النووي.

بعد ذلك ، قم بتحويل الخلايا الإلكترونية المختصة عن طريق مزجها مع الحمض النووي. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي اختيار المحولات وتحليلها. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح تأثيرات الحمض النووي للبلازما على الأنماط الظاهرية للخميرة من خلال فحوصات اكتشاف الخميرة و / أو الفحص المجهري.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على البروتوكولات الحالية ، مثل تحولات الخميرة القياسية ، هي أنها تسمح بتحويل عدد كبير من البلازميدات المختلفة إلى خلايا خميرة بطريقة آلية. تم تصميم بروتوكول تحويل الخميرة عالي الإنتاجية هذا ل 10 96 لوحة بئر ، ولكن يمكن توسيع نطاقه أو تقليله وفقا لذلك. بالنسبة للتجارب على نطاق واسع ، فإن مفتاح النجاح هو الحفاظ على تنظيم جميع الألواح والكواشف.

بمجرد إجراء التجربة لتجنب الارتباك ، سيتم استخدام معالج سائل اللوحة السريعة biobot في هذا البروتوكول لبدء الاقتباس ، من خمسة إلى 10 ميكرولترات من الحمض النووي للبلازما من مكتبة بلازميد الخميرة المصفوفة في كل بئر من الجولة. أسفل 96 لوحة بئر. ضع 96 لوحا مكشوفا داخل غطاء دخان نظيف طوال الليل حتى يجف.

بعد ذلك ، قم بتلقيح 200 مل من سكر العنب أو ببتيد الخميرة أو وسائط YPD بسلالة استعلام في قارورة Lin Meyer المحيرة سعة 500 مل ، تحتضن بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز في صباح اليوم التالي. قم بتخفيف سلالة الاستعلام إلى OD 600 من 0.1 في لترين من وسائط YPD لتحقيق النمو الأمثل. تنمو ما يصل إلى لتر واحد في قوارير محيرة منفصلة سعة 2.8 لتر.

هز القوارير لمدة أربع إلى ست ساعات عند 30 درجة مئوية حتى تصل الثقافات إلى OD 600 من 0.8 إلى 1.0. عندما تصل ثقافة الخميرة إلى OD 600 من 0.8 إلى 1.0 ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. املأ أربعة أنابيب مخروطية سعة 225 مليلتر يمكن التخلص منها بالثقافة ، وقم بتدوير 3000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي على الطاولة.

اسكب المادة الطافية S من كل أنبوب. أضف المزيد من الثقافة إلى نفس الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى ، وكرر ذلك حسب الضرورة حتى يتم حصاد جميع الخلايا. اغسل كل حبيبات خلية في 50 مل من الماء المقطر الأوتوكلاف وإنفاق Resus عن طريق الدوامة.

اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي واحد مائتين وخمسة وعشرين مليلتر وتدور بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية S ، اغسل الخلايا في مائة مل من محلول أسيتات الليثيوم. تدور مرة أخرى بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة SNA وأعد تعليق حبيبات الخلية في 70 مل من محلول أسيتات الليثيوم. دوامة بسرعة عالية لمدة 30 ثانية تقريبا حتى يتم تعليق الحبيبات تماما. احتضن مع الرج على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، أضف بيتا مي كابتو إيثانول إلى 0.1 مولار مع الاهتزاز عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، أضف ملليلترين من الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون المسلوق والمبرد إلى خليط الخلية. صب خليط الخلية في صفيحة بئر واحدة قابلة للتعقيم، ثم قم بإزالة أي راسب يتشكل لأن ذلك قد يتداخل مع سحب العينات في اتجاه المصب.

باستخدام لوحة الروبوت الحيوي السريعة ، قم بنقل 50 ميكرولترا من خليط الخلية لكل بئر من الأربعة المعدة مسبقا. 96 لوحة بئر تحتوي على الحمض النووي للبلازما لا تختلط. احتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة دون اهتزاز أثناء احتضان الخلايا.

تحضير 200 مل من محلول أسيتات الليثيوم PEG DMSO. امزج 160 مل من 50٪ PEG 33 و 50 20 مل من DMSO و 20 مل من أسيتات الليثيوم المولية الواحدة. من المهم أن يتم تحضير هذا المحلول قبل الاستخدام مباشرة.

أضف 125 ميكرولترا من محلول PEG ليثيوم أسيتات DMSO لكل منها. تخلط جيدا عن طريق شفط وتوزيع تعليق الخلية ثماني مرات. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة دون رج.

بعد ذلك ، صدمة حرارية للخلايا عند 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حاضنة جافة ، لا تكدس الألواح بعد الصدمة الحرارية ، قم بتدوير الألواح باستخدام محولات الطرد المركزي لاستيعاب 96 لوحة بئر. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة محلول PEG عن طريق قلب الألواح فوق دلو النفايات. ثم امسح الألواح المقلوبة على مناشف ورقية.

لإزالة السائل المتبقي ، ستبقى الخلايا في قاع الآبار. شطف الخلايا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسائط إلى كل منها. حسنا ، قم بتدوير اللوحات مرة أخرى.

قم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلبها فوق دلو النفايات والنشاف على المناشف الورقية. أضف 200 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسائط إلى كل بئر مع احتضان صفيحة سريعة عند 30 درجة مئوية لمدة يومين دون اهتزاز. بعد يومين ، يجب أن تبدأ مستعمرات صغيرة من الخلايا في التكون في الجزء السفلي من كل منها بنجاح.

حسنا ، للتحضير لمقايسة الرش ، قم أولا بتوزيع 200 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسائط القائمة على OSE في كل بئر من شقة جديدة. أسفل 96 لوحة البئر. مقبل. امزج كل بئر من لوحة التحويل عن طريق شفط تعليق الخلية وتوزيعه ثماني مرات باستخدام لوحة سريعة.

بتلقيح كل بئر من صفيحة الرافينوز بخمسة ميكرولترات من خليط الخلية من لوحة التحويل ، واحتضن عند 30 درجة مئوية لمدة يوم واحد. في اليوم التالي. يجب أن تكون المستعمرات الصغيرة موجودة في الجزء السفلي من كل منها.

قم بإجراء اختبار الإكتشاف بشكل جيد في غطاء المحرك ، وقم بتعقيم 96 مسمار أو مكرر أو مضرب عن طريق الاشتعال. امزج المستعمرات مع frogger ثم اكتشف المستعمرات على ألواح وسائط انتقائية. بعد الإكتشاف ، اترك الألواح تجف في الغطاء لمدة خمس إلى 10 دقائق.

احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. يظهر هنا نتائج تمثيلية لبلازميد الخميرة على شاشة التعبير لتحديد مثبطات ومعززات TDP 43. TDP 43 هو بروتين بشري متورط في التسبب في التصلب الجانبي العضلي أو مرض لو جيريج الذي يعبر عن TDP 43 في خلايا الخميرة يؤدي إلى التراكم والسمية الخلوية.

تعرض هذه الصفائح مستعمرات مع بلازميد T DP 43 المحفز للجالاكتوز المتكامل والذي تم تحويله أيضا مع البلازميدات من مكتبة تعبير ORF للجين المرن. تظهر المستعمرات هنا باللون الأحمر لأن السلالة بها طفرة تؤدي إلى تراكم صبغة حمراء. تحتوي اللوحة الموجودة على اليسار على الجلوكوز ، الذي يقمع التعبير عن T DP 43 أو البلازميدات الجينية المرنة.

اللوحة الموجودة على اليمين على الجالاكتوز ، مما يحفز التعبير عن TDP 43 و O Fs في بلازميدات الجينات المرنة. يشير رأس السهم الأخضر إلى مستعمرة تحولت ببلازميد يثبط سمية TDP 43 كما يتضح من النمو الأسرع والمستعمرات الأكثر كثافة. يشير رأس السهم الأحمر إلى مستعمرة تحولت ببلازميد يعزز سمية TDP 43 كما يتضح من النمو البطيء والمستعمرات الأقل كثافة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحويل مكتبة تجنب الحمض النووي للبلازما de الخلايا.