الماوس Microinjection سيت ، والنضج وتقييم الصيغة الصبغية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم توزيع الكروموسومات في بويضات المرحلة الثانية من الانقسام الميتافازي. بعد المعالجة التجريبية، ابدأ بجمع الخلايا البيضية المكتملة النمو من إناث الفئران البالغة جنسياً والمُحفزة. بعد ذلك، قم بحقن الخلايا البيضية مجهرياً بالمواد المختارة لإحداث اضطراب في البروتين المستهدف، ثم قم بإنضاج الخلايا البيضية في المختبر حتى تصل إلى المرحلة الميتافازية من الانقسام الاختزالي الثاني. تالياً، قم بتحفيز انتشار الكروموسومات في البويضة عن طريق المعالجة بمادة mantro، مما يؤدي إلى تكوين مغزل أحادي القطب.

في نهاية المطاف، يمكن لهذه النتائج أن توضح الحالة الصبغية للبويضة من خلال التألق المناعي والمجهر البؤري. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات البيولوجيا التكاثرية وانفصال الكروموسومات، مثل فهم الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى عدم الاستقرار. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لأن تقنية الحقن المجهري صعبة التعلم لأن العديد من خطواتها يصعب شرحها كتابةً. يتم حقن الإناث البالغة من الفئران في التجويف الصفاقي بخمس IUs من هرمون الموجه من الغدة النخامية للمبيض من خيول حاملة لزيادة عدد الجريبات النخاعية المعزولة من كل فأر إلى أقصى حد.

بعد حوالي 48 ساعة من التحفيز بـ PMSG، قم بتدفئة ثلاثة مليلترات من وسط الجمع لكل فأرة عند 37 درجة مئوية واتركها لتتوازن. مليلتر واحد من وسط المزرعة لمدة ساعة واحدة على الأقل. قم بإعداد قطرات دقيقة من كل منهما في طبق بتري وقم بتغطيتها بالزيت المعدني.

الآن، ضع طبق وسط الزرع في الحاضنة وطبق وسط الجمع على مسخن الشرائح. قم بتضحية الفأر، ثم استأصل المبيضين وضعهما في زجاجة ساعة تحتوي على وسط جمع مُدفأ مسبقاً.

باستخدام حقنة إنسولين سعة 1 مل، قم بتثبيت المبيضين في الطبق وتحرير الجريبات الغارية عن طريق ثقبها عدة مرات باستخدام إبر قياس 27 gauge مثبتة معاً. وتحت مجهر التشريح، اجمع معقدات الخلايا المكمشية باستخدام ماصة زجاجية تُشغل بالفم. اجمع الجريبات الغارية الكبيرة فقط، وتجنب جمع الجريبات قبل الغارية الأصغر أو البويضات المجردة.

انقل المعقدات إلى قطرة مجهرية من وسط تجميع مُحضّر باستخدام ماصة صغيرة تكون أكبر قليلاً من قطر البويضة. قم بفصل خلايا التحبيب عن المعقدات. ثم انقل البويضات المجردة باستخدام ماصة أكبر إلى قطرة مجهرية من وسط استنبات.

اترك البويضات لترتاح لمدة ساعة واحدة على الأقل في الحاضنة قبل البدء في التعامل معها. قم بتصنيع ماصات الحقن عن طريق سحب أنابيب شعيرية من زجاج البوروسيليكات باستخدام سحب ميكانيكي. قم بإزالة حجرة الوسط من شريحة ذات حجرة واحدة.

لإنشاء منصة للحقن المجهري، ضع قطرة بحجم 5 µL من وسط التجميع بالقرب قدر الإمكان من قطرة بحجم 0.5 µL من مادة الحقن SIR N-A-C-R-N-A أو morpholino oligonucleotide، ثم غطهما بالزيت المعدني وضعهما على منصة المجهر. ضع ماصات الحقن والتثبيت في الحوامل الخاصة بها ووجههما داخل قطرة وسط التجميع. قم بتشغيل خزانات النيتروجين المتصلة بالحقان الدقيق (pico injector) وطاولة منع الاهتزاز.

افتح طرف ماصة الحقن عن طريق نقرها برفق مقابل ماصة التثبيت أثناء ملئها بالوسط. انقل من خمس إلى 10 مواقع oh من الحاضنة إلى قطرة وسط التجميع الموجودة على المنصة. الآن، اضبط معاملات الحقن الميكروي (pico injector) على حجم حقن يتراوح من 5 إلى 10 picoliters مع الضغط على زر المسح (clear).

حرك إبرة الحقن إلى قطرة المادة واملأها، ثم أعدها إلى قطرة الوسط. استخدم ماصة التثبيت لالتقاط بويضة، وقم بمحاذاة إبرة الحقن والبويضة وماصة التثبيت على طول المحور x.

تحت تكبير أعلى، قم بدفع ماصة الحقن عبر البويضة، مع الحرص على تجنب النواة. وبمجرد اختراق الغشاء البلازمي، اضغط على زر الحقن، ثم اسحب الإبرة، وحرر البويضة، وكرر العملية. وبمجرد حقن جميع البويضات، أعدها إلى الحاضنة للحفظ في وسط استنبات للمدة المطلوبة، والتي تتراوح عادةً من 12 إلى 24 hours.

بعد ذلك، اغسل الخلايا عبر عدة قطرات من CZB وانقلها إلى قطرة مجهرية من CZB تحت الزيت، ثم حضنها لمدة 16 ساعة لإتمام النضج حتى المرحلة الاستوائية من الانقسام الاختزالي الثاني. ضع 750 µL من CZB المحتوي على 100 µM من Mastri في فجوة طبق زراعة الأعضاء الذي يحتوي على ماء في الحلقة الخارجية. الآن، اغسل البويضات عبر عدة قطرات من CZB مضافاً إليه mastri، ثم انقلها إلى طبق زراعة الأعضاء وحضنها لمدة ساعة.

قم بتثبيت البيض في زجاجة ساعة تحتوي على 2%paraform aldehyde في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، انقل البيض إلى محلول الحجب واحفظه في درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى معالجة البيض لجعله نفاذًا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اشطفه باستخدام عدة أحجام كبيرة من محلول الحجب.

أكمل بقية الإجراء على غطاء لوحة ذات 96 بئراً تكون محمية من الضوء داخل غرفة مرطبة. في درجة حرارة الغرفة، انقل البويضات إلى قطرات بحجم 25 µL من محلول الحجب لمدة 15 دقيقة. ثم لوسم السنتروميرات، انقل البويضات إلى قطرة من محلول الحجب تحتوي على مصل Crest المضاد بتخفيف 1:40، واحضنها لمدة ساعة واحدة على الأقل.

بعد ذلك، اغسل العينة باستخدام ثلاث قطرات من محلول الحجب، مع التحضين لمدة 15 دقيقة في كل قطرة. انقُل البويضات إلى قطرة من محلول الحجب الذي يحتوي على جسم مضاد مقترن بـ fluoro four وحضنها لمدة ساعة واحدة. اغسل العينة مرتين بمحلول الحجب للكشف عن الكروموسومات.

قم بالتحضين في تخفيف بنسبة 1 إلى 5,000 من cytx green ومحلول الحجب، ثم ثبت العينات في 5 µL من vector shield. ضع أربع نقاط صغيرة من الفازلين في الموضع المخصص لزوايا غطاء الشريحة لمنع سحق البويضات. ضع غطاء الشريحة وأغلقه بطلاء الأظافر، ثم احفظه في صندوق شرائح عند درجة حرارة 4 °C حتى تتم المعالجة بواسطة المجهر البؤري (confocal microscopy)؛ وأثناء التصوير باستخدام عدسة شيئية بقوة 100 x، التقط خطوات بمقدار 0.4 µm في المستوى Z وصور المنطقة الكاملة للطور الاستوائي، ثم قم بعد السنتروميرات باستخدام برنامج تصوير مثل Image J من NIH. تحتوي بويضات الفئران ذات الصيغة الصبغية الطبيعية (euploid) على 20 زوجاً من kinetochore، مما يعطي إجمالي 40 نقطة في هذا المسقط Z للطور الاستوائي الثاني لبويضة ذات صيغة صبغية طبيعية؛ حيث يظهر الحمض النووي DNA باللون الأخضر و K kinetochores باللون الأحمر.

تشير الأسهم إلى ذراعي كروماتيدين متميزين يظهران تداخلاً عند الكروموسوم رقم 17 ورقم 18، وذلك عقب إجراء الحقن المجهري. ويمكن تنفيذ طرق أخرى مثل لطخة ويسترن (Western blotting) وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) وتقييمات تكوين المغزل ومحاذاة الكروموسومات والإخصاب في المختبر للإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية تأثير اضطراب البروتين المستهدف على النضج الميوزي والإمكانات التطورية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل مع جميع المواقع وتقييم PLO في الطور الاستوائي الثاني x.