Name: استخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي من ماتس الميكروبية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: تعلم استخراج الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من ماتس الميكروبية المالحة باستخدام تقنية التجانس والتجميد والذوبان. يحسن هذا البروتوكول جودة وتركيز الحمض النووي للدراسات الميتاجينومية الوظيفية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم تمويل هذا العمل من خلال برنامج المؤسسة الوطنية للعلوم البيئية جينوم (رقم المنحة EF - 0723707).

1. خلية الميكروبية الاستخراج : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس الحصير الميكروبية مع مدقة العقيمة طحن عن طريق خلط دقيق. مكان تقريبا كل 30 غراما (وزن رطب) من المادة حصيرة المتجانس في حاوية معقمة من خلاط وارنج ، إضافة حوالي 100 مل من كلوريد الصوديوم M 1 (أو تركيز محدد على العينة في الاستخدام) ، ومزيج ثلاث مرات على سرعة متوسطة لمدة 1 دقيقة مع متقطعة التبريد في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. نقل الطين في زجاجة 250 مل الطرد المركزي وملء ما تبقى فارغة مع حجم كلوريد الصوديوم M 1. يعد حل كلوريد الصوديوم في المياه وتعقيمها DI تصفية تعقيم عليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرد مزيد من الخلايا الميكروبية من المصفوفة التي تهز (150 دورة في الدقيقة) باستخدام vortexer (دوامة R - الجني 2) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي على سرعة منخفضة (500x غ) لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. نقل بلطف طاف في قارورة مع الحد الأدنى من الاضطرابات الرواسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مكعبات الرواسب ، كرر الخطوات ومزج 1.2 و 1.3 أربع مرات إضافية ، مع إضافة جديدة لكلوريد الصوديوم بيليه كل الرواسب في نهاية الخطوة 1.3. يتم نقل كل من طاف استخراج كلوريد الصوديوم في قارورة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين supernatants من إخراج السجناء من الزنازين (5) وأجهزة الطرد المركزي في aliquots من 200 مل بسرعة عالية (25،000 XG) لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف ، resuspend بيليه كل خلية في 10 مل من فوسفات الصوديوم 2 ٪ ، والجمع بين الكريات ويشكلون وحدة التخزين إلى 200 مل مع فوسفات الصوديوم 2 ٪. غسل الخلايا تهتز (150 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. في نهاية هذه الخطوة يجب أن يكون إلا أنبوب واحد من الخلايا للبدء في الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي بسرعة عالية (25،000 XG) لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل ، resuspend طاف بيليه الخلية في 200 مل من TE (50 ملي EDTA) ، وغسل الخلايا تهتز (150 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي بسرعة عالية (25،000 XG) لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية ، وتجاهل طاف ، resuspend في TE 15 مليلتر (10 ملي EDTA) ، وتخزين 200 ميكرولتر aliquots -80 درجة مئوية في حين الحاجة لإخراج الحمض النووي. </li></ol> 2. استخراج الحمض النووي وتنقية : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر 200 M كلوريد الصوديوم ، و 200 ميكرولتر SDS 10 ٪ ، و 100 ميكرولتر M - 14.3 β المركابتويثانول إلى الخلية الميكروبية قسامة 200 ميكرولتر. المزيج بلطف 4-6 مرات عكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخضع هذا المزيج على 3 جولات من ذوبان للتجمد التي تغمر في النيتروجين السائل لمدة 2 دقيقة تليها ذوبان في الماء 65 درجة مئوية حمام لمدة 5 دقائق. تمديد النهائي لذوبان 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 M 5 ميكرولتر البوتاسيوم خلات (الرقم الهيدروجيني 5.5) ومكان على الجليد لمدة 10 دقيقة. الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية ، وطاف لنقل أنبوب جديد باستخدام ماصة الحافة واسعة الجوف. إضافة 3 ميكرولتر من ريبونوكلياز ألف واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من كلوروفورم ، يهز لفترة وجيزة قبل انقلاب ، والطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية الطبقة العليا من طاف في أنبوب جديد باستخدام ماصة الحافة واسعة الجوف. تجنب pipetting طبقة واجهة بيضاء تقع بين الطبقات العليا والسفلى. كرر الإجراء كلوروفورم الاستخراج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من المبرد (في -20 درجة مئوية) الأيزوبروبانول إلى احتضان وطاف على الجليد لمدة 30 دقيقة إلى الحمض النووي يعجل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي بسرعة قصوى (20800 XG) لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية لتكوير الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف بيليه وغسل الحمض النووي مع 1 مل من المبرد (في -20 درجة مئوية) الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي بسرعة قصوى (20800 XG) لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية ، وتجاهل طاف ، وتكرار غسل الايثانول 70 ٪ ، والهواء الجاف بيليه الحمض النووي لمدة 10 دقيقة. تكرار غسل 70 ٪ الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الحمض النووي في 25 ميكرولتر TE (10 ملي EDTA) ، دافئة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، والجمع في أنبوب واحد إذا تم استخدام أنابيب متعددة ، والماكياج الحجم إلى 500 ميكرولتر مع الشركة المصرية للاتصالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر الجليد الباردة (أو على 4 درجات مئوية) 20 ٪ البولي ايثيلين جلايكول (PEG) (أعد في كلوريد الصوديوم 1.2 متر). المزيج بلطف بواسطة انقلاب ، يحضن على الجليد لمدة 10 دقيقة ، وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية إلى الحمض النووي بيليه. إزالة والتخلص من طاف ويغسل DNA مكعبات مع 1 مل من الايثانول 70 ٪ المبردة ، والهواء الجاف لمدة 10 دقيقة ، وresuspend في 30-50 TE ميكرولتر أو الماء الصف الجزيئية. تسهيل إعادة تعليق من الحمض النووي عن الاحترار عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والحمض النووي في مخزن -80 درجة مئوية. </li></ol> 3. الطهارة الحمض النووي ، وتركيز وتحديد الحجم : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نوعية الحمض النووي عن طريق قياس 260 / 280 ألف وألف نسب 260/230 باستخدام Nanodrop 1000 معمل أو أي أجهزة أخرى ملائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز الحمض النووي باستخدام تكنولوجيا المعلومات كوانت dsDNA طقم الفحص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد حجم الحمض النووي باستخدام الجل الكهربائي نبض الميدان. وشملت تبديل مرة الأولي من 0.35 ثانية ، وقت التبديل النهائي من 7.67 ثانية ، وزاوية 120 درجة عن التدرج من 6.0 V / سم عند وإعداد 1 ٪ agarose هلام مع 0.5X TBE واستخدام المعلمات التالية على نظام معين CHEF XA خطية صamping عامل. وصمة عار مع هلام 1 × أنا SYBR الخضراء لمدة 30 دقيقة. تحميل الحمض النووي بين 700-1000 مجموع نانوغرام على هلام. انظر الشكل. 3 للشكل مكثف للبروتوكول كاملة. </li></ol> ممثل النتائج : استخراج الخلايا : وأظهرت مقتطفات متتابعة الخلية الجرثومية (supernatants) أن تعكر مقتطفات تتناقص مع زيادة عدد عمليات الاستخراج. هذا يشير إلى انخفاض في عدد الخلايا التالية استخراج كل خلية المتعاقبة. المهم أن نلاحظ هنا أنه مع كل خطوة إضافية استخراج الخلايا يتيح الفرصة لإدخال المواد الملوثة ، وينبغي التقليل من عدد من الخلايا بحيث قلع النهائي بيليه الخلية هو ممثل المجتمع الميكروبي بشكل عام. وكانت تسيطر غيرها من مصادر التلوث من خلال اعتماد تقنيات مختبرية كافية العقيمة. على سبيل المثال ، تم إعداد الحلول في مجال المياه وتعقيمها تعقيم DI التصفية. وتعقيم الحاويات مع الكحول ، وتعقيمها ، ومعالجتها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية والأشعة فوق البنفسجية crosslinker. تركيز الحمض النووي وتحديد النوعية : أسفرت بروتوكول حوالي 2 ميكروغرام من الحمض النووي HMW (35-50 كيلوبايت) (الشكل رقم 4) لكل غرام من العينة حصيرة مع نسبة 260 / 280 ألف من 1.6 ، وهناك نسبة 0.7 260/230 (الجدول 1). على الرغم من أن يبدو أن هناك نسبة 260/230 أن تكون منخفضة ، لا تثبيط تطبيق الجزيئية المستندة المصب مثل PCR - 16S التضخيم من جينات الرنا الريباسي وحظ في دراسة منفصلة 7. ومن المهم أن نلاحظ أن الحمض النووي من الحصير الملوحة اثنين من المصادر الرئيسية للتلوث ؛ EPS والأملاح. ولذلك فمن الممكن أن آثار هذه الملوثات قد يكون هناك تأثير على نسب 260/230 على الرغم من الجهود الهائلة للحد من آثارها على تطبيقات تيار باستمرار. تقرير حجم الحمض النووي : نبض الحقل الكهربائي للهلام توظف تدفق النابض الحالية مع تبديل الاتجاه متقطعة مما أدى إلى تشويه الحمض النووي كما هو مبين في الشكل 3. أسفرت بروتوكول لدينا الحمض النووي HMW حوالي 35-50 كيلو بايت. في حين أن بعض حجم الحمض النووي قد يكون أصغر من 30 كيلوبايت ، فمن المهم أن يكون جزءا من مسحة فوق 35 كيلو بايت نظرا إلى أن الاستنساخ fosmid يتطلب ~ 40 كيلو بايت إدراج الحمض النووي DNA وشظايا أكبر توفير قدر أكبر من الوصول إلى مسارات السكروز سليمة. في دراستنا ، وقد اقتطعت مسحة الحمض النووي فوق 35 كيلو بايت وتنقيته من أجل استنساخ ناقلات كبيرة تضاف الجزيئية وتطبيقات أخرى. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الرقم الجرثومية الشديدة الملوحة 1. حصيرة موقع أخذ العينات (البركة الكبيرة) الموجود على إلوثيرا ، وجزر البهاما. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. والمقطع العرضي للحصيرة الجرثومية الشديدة الملوحة المستخدمة في هذه الدراسة. تم الحصول على حصيرة الميكروبية من بركة تقع على إلوثيرا الملوحة ، وجزر البهاما. <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. تمثيل تخطيطي لإجراءات المشاركة في استخراج الخلايا الجرثومية ، وتحلل الخلية ، واستخراج وتنقية الحمض النووي metagenomic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2887/2887fig3large.jpg">انقر هنا لعرض صورة أكبر.</a> <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig4.jpg" alt="الشكل 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 4"> الشكل 4. الجزيئية توصيف الحمض النووي المستخرج من الوزن باستخدام النبض الكهربائي للهلام الميدان. حارة M هي علامة HMW ، والممرات 1 و 2 من الحمض النووي يتطابق metagenomic المستخرجة من حصيرة الملوحة إلوثيرا باستخدام بروتوكول أعلاه. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> استخراج أسلوب </td><td></td><td> تركيز نانوغرام / غ </td><td> A 260/280 </td><td> A 260/230 </td></tr><tr><td> PEG </td><td> مندوب 1 </td><td> 1806.1 </td><td> 1.64 </td><td> 0.76 </td></tr><tr><td></td><td> مندوب 2 </td><td> 2010.8 </td><td> 1.61 </td><td> 0.75 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. استخراج قياس تركيز ونوعية الحمض النووي من حصيرة الملوحة الميكروبية.

<ol><li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms+in+intertidal+systems%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cont.+Shelf+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li>
<li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li>
<li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li>
<li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li>
<li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Soil+Ecol%22%5BJournal%5D)">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li>
<li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%3A+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+the+Soil+Metagenomic%3A+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li>
<li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Rhodopsin%3A+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نظرا إلى أن مجموع إزالة الخلية من المعقدة والمتنوعة للغاية العينات الجرثومية حصيرة ليس عمليا ، فإن القلق الأساسي هو مدى الخلايا المستخرجة تمثل حصيرة الميكروبية الشاملة المجتمع. في دراسة سابقة ، أظهرت PCR - DGGE تحليل الجينات الميكروبية 16S الرنا الريباسي أن إزالة الخلايا خمس خطوات المستخدمة في هذا البروتوكول مقتطفات الخلايا التي تمثل المجتمع الميكروبية حصيرة الشاملة 7. الخطوات المطلوبة من العدد الفعلي لاستخراج الخلايا لتوفير بيليه الخلية التي هي ممثلة للمجتمع الكلي المي...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> β - المركابتويثانول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td> البولي ايثيلين جلايكول 8000 </td><td> Promega </td><td> V3011 </td><td> 20 ٪ من كلوريد الصوديوم 1.2 M </td></tr><tr><td> أسيتات البوتاسيوم </td><td> فيشر العلمية </td><td></td><td> فيشر العلمية </td></tr><tr><td> كوانت - IT طقم الفحص dsDNA </td><td> Invitrogen </td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> ريبونوكلياز </td><td> Epicentre </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> BDH كيماويات </td><td> BDH8014 </td><td> اضرب المناسبة. </td></tr><tr><td> سلفات الصوديوم دوديسيل </td><td> فيشر العلمية </td><td> 03-500-509 </td><td> 10 ٪ في الماء </td></tr><tr><td> فوسفات الصوديوم </td><td> EMD كيماويات </td><td> SX0583 - 3 </td><td> 2 ٪ في الماء </td></tr><tr><td> TBE </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP1333 - 1 </td><td></td></tr><tr><td> CHEF مخطط نظام XA </td><td> راد مختبرات بيولوجية </td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td> معمل NanoDrop 1000 </td><td> الحرارية العلمية </td><td> ND - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> العلمي للصناعات المحدودة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الأشعة فوق البنفسجية Crosslinker </td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td> وارنج خلاط </td><td> وارنج المختبر </td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

استخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي من ماتس الميكروبية

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

تحليل ناجحة ودقيقة ، وتفسير البيانات metagenomic يعتمد على استخراج كفاءة عالية الجودة ، وارتفاع الوزن الجزيئي المجتمع الحمض النووي (HMW). ومع ذلك ، والعينات البيئية تشكل حصيرة غالبا ما يواجهون صعوبات في الحصول على تجمعات كبيرة عالية الجودة HMW الحمض النووي. الحصير الجرثومية الشديدة الملوحة تحتوي على كميات عالية من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) (1) والأملاح التي قد تمنع التطبيقات المصب من الحمض النووي المستخرج. وغالبا ما تستخدم أساليب مباشرة وقاسية في استخراج الحمض النووي من عينات الحرارية. وعادة ما تستخدم هذه الأساليب لأن العائد على السهم في الفرش ، ومصفوفة لاصقة ، تربط الحمض النووي 2،3 أثناء تحلل المباشر. نتيجة لأساليب أشد قسوة الاستخراج ، والحمض النووي أصبحت مجزأة إلى أحجام صغيرة 4،5،6. الحمض النووي وهكذا يصبح مناسبة لاستنساخ ناقلات كبيرة إدراج. من أجل الالتفاف على هذه القيود ، ونحن التقرير منهجية محسنة لاستخراج الحمض النووي HMW من نوعية جيدة وكمية من الحصير الجرثومية الشديدة الملوحة. استخدمنا أسلوب غير المباشرة التي تنطوي على فصل الخلايا الميكروبية من الخلفية مصفوفة حصيرة من خلال المزج والطرد المركزي المغاير. وكان استخدام مجموعة من الإجراءات الميكانيكية والكيميائية لاستخلاص وتنقية من الحمض النووي للخلايا الجرثومية المستخرجة. بروتوكول لدينا ما يقرب من 2 ميكروغرام الغلة من الحمض النووي HMW (35-50 كيلوبايت) في كل غرام من العينة حصيرة ، مع نسبة 260 / 280 ألف من 1.6. وعلاوة على ذلك ، والتضخيم من جينات الرنا الريباسي 16S 7 تشير إلى أن البروتوكول هو قادر على تقليل أو القضاء على أي آثار المثبطة من الملوثات. نتائجنا توفر منهجية ملائمة لاستخراج الحمض النووي من الحصير HMW الميكروبية للدراسات الفنية وmetagenomic يمكن أن تنطبق على غيرها من العينات البيئية التي استخراج الحمض النووي هو التحدي.

نحن نقدم بروتوكول محسنة لاستخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي من الحصير الجرثومية الشديدة الملوحة. يتم فصل الخلايا الميكروبية من مصفوفة حصيرة قبل استخراج الحمض النووي وتنقيتها. هذا من شأنه أن يعزز تركيز ، والجودة ، وحجم الحمض النووي. ويمكن استخدام بروتوكول الحرارية للعينات أخرى.

يعتمد التحليل والتفسير الناجح والدقيق لبيانات الميتاجينوميات على الاستخلاص الفعال لحمض نووي عالي الجودة وذي وزن جزيئي مرتفع...

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخلاص DNA عالي الوزن الجزيئي من الحصائر الميكروبية شديدة الملوحة. ويتم تحقيق ذلك من خلال تجنيس واستخلاص الخلايا الميكروبية من الحصيرة الميكروبية أولاً، ثم يتم تحليل الخلايا الميكروبية باستخدام منهجية التجميد والإذابة والتحليل الكيميائي.الخطوة التالية هي إزالة حطام الخلايا والـ RNA باستخدام الاستخلاصات العضوية والـ RNAs، يتبع ذلك استخلاص الـ DNA. والخطوة النهائية من الإجراء هي ترسيب الـ DNA وتنقيتُه. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر DNA بجودة وتركيز عاليين من حيث الوزن الجزيئي.تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل طرق استخلاص DNA المباشرة والقاسية، في أنها تستخدم DNA عالي الوزن الجزيئي من عينة بيئية معقدة لإجراء دراسات الميتاجينوميات الوظيفية. تم الحصول على الحصيرة الميكروبية المستخدمة في هذه الدراسة من بركة شديدة الملوحة تقع في إليوثيرا، جزر البهاما؛ لاستخلاص الخلايا الميكروبية من مصفوفة الحصيرة الخلفية، اخلط أولاً حوالي 30 جرامًا من الحصيرة جيدًا دون طحن، باستخدام مدقة طحن معقمة. وتعتبر الحصيرة متجانسة تمامًا عندما لا يمكن رؤية أي تكتلات في الخليط.ضع بعد ذلك مادة المات المتجانسة في خلاط وأضف حوالي 100 milliliters من كلوريد الصوديوم. اخلط على سرعة متوسطة لمدة دقيقة واحدة، يليه التبريد لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة 20- degrees Celsius. كرر هذه العملية من الخلط والتبريد مرتين إضافيتين، وعند اكتمال الخلط، انقل المعلق إلى زجاجة طرد مركزي سعة 250 milliliter واملأ الحجم الفارغ المتبقي بـ 1 molar من كلوريد الصوديوم.رجّ المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، ثم قم بطرد المزيج مركزياً بسرعة منخفضة لمدة 15 دقيقة عند 4 °C. بعد ذلك، انقل الطافي بعناية إلى دورق مع تقليل اضطراب الراسب قدر الإمكان. أضف كلوريد الصوديوم الطازج إلى الراسب المترسب.امزج المكونات مجددًا ورجّها لمدة 30 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي كما سبق، وانقل الراشح إلى دورق جديد. كرر عملية إضافة كلوريد الصوديوم الطازج، والمزج، والطرد المركزي، وإزالة الراشح ثلاث مرات إضافية.اجمع السوائل الطافية من عمليات استخلاص الخلايا الخمس، ثم قم بطرد مركزي لأجزاء بحجم 200 milliliters بسرعة عالية لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق كل ركازة خلوية في 10 milliliters من sodium hexametaphosphate. اجمع المعلقات الخلوية من جميع الأنابيب الأربعة وأضف sodium hexametaphosphate حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 200 milliliters.اغسل الخلايا عن طريق الرج في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الرج، قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة عالية لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، ثم تخلص من supernatant وأعد تعليق كتل الخلايا في 200 milliliters من te لغسل الخلايا مرة أخرى عن طريق الرج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. وأخيراً، قم بالطرد المركزي مرة أخرى بسرعة عالية لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.بعد التخلص من محلول Resus، قم بتعليق الكتلة الخلوية في 15 ملليلتر من te لتحضير حصص مقدارها 200 ميكرولتر من الخلايا الميكروبية. يمكن تخزين الخلايا الميكروبية عند درجة حرارة minus 80 degrees Celsius حتى وقت الحاجة إليها لاستخلاص DNA. لبدء إجراء استخلاص وتنقية DNA من الخلايا الميكروبية، أضف sodium chloride وSDS وbeamr capto ethanol إلى كل حصة من الخلايا الميكروبية بحجم 200 ميكرولتر.وزع العينات في ثمانية أنابيب في المجمل. اخلط المزيج برفق عن طريق القلْب من أربع إلى ست مرات، ثم اغمر المزيج في النيتروجين السائل لمدة دقيقتين، يلي ذلك إذابة التجميد عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، ثم كرر عملية الغمر في النيتروجين السائل وإذابة التجميد عند 65 درجة مئوية مرتين إضافيتين.تمديد عملية الإذابة النهائية إلى 10 دقائق. بعد الجولة الثالثة من التجميد والإذابة، أضف 200 µL من خلات البوتاسيوم إلى كل أنبوب وضعه على الثلج لمدة 10 دقائق. ثم قم بالطرد المركزي عند 10,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C.بعد ذلك، استخدم رأس ماصة واسع الفتحة لنقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد. أضف 3 µL من RNAs A واحضن المزيج عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. وبعد انتهاء فترة الحضن التي استمرت ساعة واحدة، أضف حجماً مساوياً من الكلوروفورم.رج العبوة لفترة وجيزة عن طريق القلب، ثم قم بالطرد المركزي عند 15, 000 Gs لمدة 10 دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، انقل الطبقة العليا من السائل الطافي إلى أنبوب جديد. كرر إجراء الاستخلاص باستخدام الكلوروفورم.مرة أخرى، انقل الطبقة العليا من السائل الطافي إلى أنبوب جديد. أضف حجماً مساوياً من الإيزوبروبانول المبرد إلى السائل الطافي واحضنه على الثلج لمدة 30 دقيقة. لترسيب الـ DNA، قم بالطرد المركزي بالسرعة القصوى لتكوين كريّة الـ DNA، ثم تخلص من السائل الطافي واغسل كل كريّة DNA بـ 1 mL من الإيثانول المبرد بتركيز 70%.كرر عملية الغسل باستخدام ethanol 70% مع الطرد المركزي بالسرعة القصوى لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. تخلص من السائل الطافي. كرر عملية الغسل باستخدام ethanol 70% ثم اترك كتلة DNA لتجف في الهواء لمدة 10 دقائق.أعد تعليق كل كتلة DNA في حوالي 25 µL من te. سخن المزيج عند 65 °C لمدة خمس دقائق، ثم اجمعهم في أنبوب واحد وأكمل الحجم إلى 500 µL باستخدام te. أضف polyethylene glycol مع الخلط برفق عن طريق القلب، ثم حضن المزيج على الثلج لمدة 10 دقائق.استخدم جهاز الطرد المركزي لترسيب الـ DNA. بعد ذلك، قم بإزالة السائل الطافي والتخلص منه بعد غسل الـ DNA باستخدام 70% ethanol مبرد. اترك العينة لتجف في الهواء لمدة 10 دقائق، ثم أعد تعليقها في 30 إلى 50 µL من TE أو ماء بدرجة نقاء جزيئية (molecular grade water)، وقم بتدفئتها عند 65 °C لمدة خمس دقائق.قم بتخزين DNA عند درجة حرارة -80 °C. يوضح هذا الجدول نتائج قياس تركيز وجودة DNA المستخلص من الحصيرة الميكروبية شديدة الملوحة. وقد نتج عن البروتوكول ما يقرب من 2 µg من DNA لكل جرام من عينة الحصيرة، مع نسبة A₂₆₀/A₂₈₀ بلغت 1.6 ونسبة A₂₆₀/A₂₃₀ بلغت 0.7.على الرغم من أن نسبة A260/A230 بدت منخفضة، إلا أنه لم يُلاحظ أي تثبيط للتطبيقات الجزيئية اللاحقة مثل تضخيم PCR لجينات 16s ribosomal RNA في دراسة منفصلة؛ وعندما تم تحديد حجم DNA باستخدام الرحلان الكهربائي بهلام المجال النبضي، أشارت النتائج إلى وجود DNA عالي الوزن الجزيئي أو HMW-DNA يتراوح حجمه تقريبًا بين 35 إلى 50 kilobases. هنا، يمثل المسار M مؤشر HMW، بينما يمثل المساران 1 و2 مكررات من DNA ميتاجينومي تم استخلاصه من الحصيرة الملحية المفرطة في eleuthra. يمكن استئصال لطخة DNA التي تزيد عن 35 kilobases وتنقيتها لاستخدامها في استنساخ النواقل ذات الإدراجات الكبيرة أو التطبيقات الجزيئية المناسبة الأخرى.بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل استنساخ P-C-R-D-G-G-E أو تسلسل DNA من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل: ما هو التنوع الوظيفي للمجتمع الميكروبي قيد الدراسة.

extraction-of-high-molecular-weight-dna-from-microbial-mats

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن تصف طريقة لاستخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي الجينومية من الكتلة الحيوية العوالق ركزت على 0.22 ميكرون Sterivex المرشحات ، تليها السيزيوم كلوريد كثافة الطرد المركزي لتنقية الانحدار.

استخراج الحمض النووي من 0.22 ميكرومتر Sterivex فلاتر والسيزيوم كلوريد التدرج الكثافة الطرد المركزي

ووصف المنهجية لعزل الوزن الجزيئي عالية وعالية الجودة من الحمض النووي الجينومي المجتمع الميكروبي في التربة.

استخراج عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من التربة والرواسب

هذا الفيديو يوضح البروتوكول لاستخراج الحمض النووي من الفورمالين الثابتة المادية جزءا لا يتجزأ من البرافين. هذا الإجراء عدة أيام في المقاطع التي هي نسيج deparaffinized مع الزيلين ، ممهى مع الإيثانول ومعاملته ك بروتين لتنقية وعزل الحمض النووي لاحقة تحليل الجينات الوراثية المحددة أو واسعة.

استخراج الحمض النووي من مادة البارافين جزءا لا يتجزأ من التحليلات الجينية واللا جيني

باستخدام التليف الكيسي الهوائية كمثال على ذلك، تقدم المخطوطة سير عمل شامل يضم مجموعة من النهج ميتاجينومية وmetatranscriptomic لتوصيف الجرثومية والفيروسية المجتمعات في عينات المرتبط الحيوان.

تنقية انجاس: تسلسل Metagenomes وMetatranscriptomes من مجمع عينات المرتبط الحيوانية

الموصوفة هنا هي طريقة لاستخراج وتنقية ومراقبة جودة الحمض النووي الجيني من العامل الممرض الفطري الغذائي الحيوي الإلزامي ، البياض الدقيقي ، لاستخدامه في تسلسل الجينوم طويل القراءة.

تنقية عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من البياض الدقيقي لونغ-مقروءة التسلسل

نقدم عملية عزل وتكاثر وتوصيف البكتيريا المسببة للهيدروكربون من الموائل المائية. يحدد البروتوكول العزل البكتيري ، والتعرف عليه بطريقة 16S rRNA ، واختبار قدرتها على تحلل الهيدروكربونات. ستساعد هذه المقالة الباحثين في توصيف التنوع البيولوجي الميكروبي في العينات البيئية ، وعلى وجه التحديد فحص الميكروبات ذات إمكانات المعالجة البيولوجية.

عزل وتكاثر وتحديد الأنواع البكتيرية ذات خصائص استقلاب الهيدروكربون من الموائل المائية

توضح هذه المقالة بروتوكولا لاستخراج الحمض النووي للدياتوم باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الشائعة المعدلة.

استخراج الحمض النووي للدياتوم من عينات المياه والأنسجة

نقدم هنا تقنية بسيطة لتقييم المقاومة البيئية لمضادات الميكروبات (AMR) من خلال تعزيز نسبة الحمض النووي خارج الخلية منخفض الوزن الجزيئي. يسمح العلاج المسبق ب 20٪ -30٪ PEG و 1.2 M NaCl باكتشاف كل من جينات AMR المنقولة جينيا وأفقيا. يفسح البروتوكول نفسه لعملية خالية من الأدوات مع تحسين إضافي.

الاستخلاص المعزز للحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي من مياه الصرف الصحي لإجراء تقييم شامل لمقاومة مضادات الميكروبات 

يصف هذا البروتوكول طريقة CTAB لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة من البكتيريا الفطرية، متغلبا على التحديات التي تفرضها جدران خلاياها الصلبة والغنية بحمض الفطر. تتضمن العملية الهضم الإنزيمي، وتحلل الخلايا باستخدام CTAB، وتنقية الحمض النووي من خلال الاستخراج العضوي وترسيب الإيثانول. تنتج هذه الطريقة حمضيا نوويا مناسبا للدراسات الجزيئية وموثوقة في أبحاث الفطريات.

استخراج حمض النيوكسي ريبونوكلييك من الجينوم الكامل من أنواع البكتيريا المتفطرة عبر تقنية بروميد سيتيل تريميثيل أمونيوم

بيولوجيا المجتمعات الميكروبية -- مقابلة

تعلم استخراج الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي من ماتس الميكروبية المالحة باستخدام تقنية التجانس والتجميد والذوبان. يحسن هذا البروتوكول جودة وتركيز الحمض النووي للدراسات الميتاجينومية الوظيفية.

استخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي من ماتس الميكروبية

استكشف المزيد من الفيديوهات