Name: التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: تعلم طرق إحداث نقص الأكسجة في الثقافات الخلوية وتقييمها باستخدام كلوريد الكوبالت والحضانات الخاصة. يتم الكشف عن HIF-1 alpha بالتلوين الغربي والتألق لدراسة الاستجابات الخلوية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. نقص الأكسجين الناجم عن حل كوكلي 2 كلوريد الكوبالت hexahydrate (II) (كوكلي 2 • 6H 2 O ، MW = 237.9) هو محفز الكيميائية للعامل 8 - 1.3 - نقص الأكسجين محرض. هذا المنتج هو قابل للذوبان في الماء (100 ملغ / مل) ، والرضوخ واضحة ، والحل الحمراء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون 25mM في الماء المعقم د (إعداد مباشرة قبل الاستعمال) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام كوكلي 2 في التركيز النهائي لل100μM الخاص في وسائل الإعلام العادية خلية ثقافة للحث على نقص الأكسجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كوكلي 2 الوسائط التي تحتوي على خلايا الجسم واحتضانها للثقافات 24hours في الحاضنة التقليدية (37 درجة مئوية ؛ C0 2 5 ٪). </li></ol> تركيز أعلاه يعمل لخطوط الخلية اختبرناها ولكن يجب اختبار كل سطر الخلية بتركيزات مختلفة (لإنشاء منحنى الجرعة) وكذلك في أوقات مختلفة في حضانة أجل الحد من سمية الدواء ذات الصلة وتحسين مقايسة. 2. نقص الأكسجين يتسبب في غرفة حاضنة وحدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ما لا يقل عن ثقافتين خلية متطابقة (الثقافة التوأم). يمكن أن يكون في مزارع الخلايا لوحات ، وقوارير أو أطباق الثقافة. لفتح غرفة ، وهما أولا فتح المشابك البلاستيكية البيضاء الواقعة على أنابيب موصولة إلى الغرفة (الأنابيب المستخدمة في الحقن / تطهير الغاز ميتة) وفتح بلطف حلقة المشبك الفولاذية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الافراج عن المشبك. ويمكن الآن للغطاء والصواني يمكن إزالتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الثقافة في قاعة خلية ميتة. أيضا وضع طبق بتري تحتوي على الماء المعقم في الغرفة لتوفير الترطيب الكافي من الثقافات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع "التوأم" ثقافة خلية في normoxia والسيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من الأدراج الخاصة بك المضمون وليس تتحرك ، ومن ثم إغلاق الغرفة مع غطاء لها. الموقف بشكل صحيح المشبك خاتم الفولاذ لضمان إغلاق سحري للغرفة وإغلاقه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخلق نقص الأكسجين ، إرفاق أنابيب إلى "نقص الأكسجة دبابات" يحتوي على 1 ٪ خليط الغاز O 2. وإذا كان لديك متر تدفق متصلة دبابتك يكون متصلا مباشرة غرفة لها (الغاز تدفق دبابات متر غرفة). نستخدم متر مسجلة في تدفق منظم لدينا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن المهم لإزالة معظم إن لم يكن جميع الحاضرين الأوكسجين في الغرفة وسائل الاعلام الخاصة بك في أن تفعل ذلك بمسح الغرفة عن طريق فتح خزان الوقود بمعدل تدفق قدره 20 لترا لكل دقيقة لدقائق 70-10 ، ثم سرعان ما تتحول قبالة تدفق الغاز وأغلق تماما للغرفة عن طريق إغلاق كل من المشابك البيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة الى غرفة الحاضنة التقليدية للفترة من الوقت المطلوب. إذا كنت تستخدم الثقافات الكبيرة ، السماح لوسائل الإعلام في الثقافات إلى التقليل من الغاز لمدة 1 -- 2 ساعة ثم كرر دافق. وتستند الخطوات المذكورة أعلاه على التوصيات منشئ "(بيلوبس - روتنبرغ ، المؤتمر الوطني العراقي). تأكد من المضمون بشكل صحيح كنت خزان الغاز في كل وقت. </li></ol> ملاحظات : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل القضاء على O 2 الواردة في وسائل الإعلام ينصح الغاز إعادة الغرفة مرة واحدة بعد 3hours - 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة أطول من فترة حضانة 48hours ينصح أيضا لإعادة غرفة الغاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومجسات الأكسجين (الأقطاب الكهربائية / مقياس ضغط الدم) التي تسمح للقياسات O 2 الواردة في الخلايا / الغرفة توفر مقياسا أدق ليا جواني / 2 تحتوي على غرفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واستنبات الخلايا في الوقت أطوال مختلفة لجعل الوقت منحنى مساعدة في تحديد الوقت الأمثل للتعبير - 1α مؤسسة الحرمين في خلايا معينة. </li></ul> 3. تقييم نقص الأكسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مؤسسة الحرمين الكشف α - 1 التي لطخة غربية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة فتح الغرفة الخاصة بك كما هو موضح في القسم 2.2 والمكان على الفور الثقافات الخاصة بك على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز نقص الأكسجة الخلايا المعالجة وغير المعالجة ، مع حل SDS 5 ٪ في لوحات ثم نقل إلى خلية lyzate مواسير يصوتن ، spindown حطام خلية وجمع طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز البروتين باستخدام BCA عدة ، وإعداد نموذج بإضافة العازلة التحميل والتدفئة على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتينات Electrophorese على هلام بولي أكريلاميد SDS - 8 ٪ ، ونقل إلى الأغشية النتروسليلوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة الغشاء في برنامج تلفزيوني تحتوي على 5 ٪ من غير دسم الحليب الجاف و 0.1 ٪ توين 20 في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل على شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة ضد مؤسسة الحرمين ، وحيدة النسيلة 1α الابتدائية (1 / 600) في المنطقة العازلة نفسها طخة مناعية في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 ٪ توين 20 في درجة حرارة الغرفة ، 5min في كل مرة واحتضان مع HRP الثانوية الأضداد (1 / 2000) في برنامج تلفزيوني + 0.1 ٪ توين 20 لمدة 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 ٪ توين 20 في درجة حرارة الغرفة ، 5min الوقت /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام طقم ECL بيرس وفيلم الأشعة السينية لإظهار الفرقة البروتين </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المستجيبة العنصر نقص الأكسجة (HRE). مؤسسة الحرمين - 1α ينظم العديد من الجينات (أي VEGF ، EPO) ملزمة لتسلسل يسمى نقص الأكسجة العنصر تنظيم (HRE). تعليم حقوق الإنسان المرتبطة به الجين علامة طر هو ممكن للكشف عن نشاط مؤسسة الحرمين 9. لاستخدام هذا الأسلوب ، تحتاج أولا إلى الخلايا transfect الخاص مع البلازميد HRE - luciferase باستخدام أسلوب ترنسفكأيشن تكييفها لخلايا الجسم. على سبيل المثال كنا Lipofectamine 2000. الخلايا تحتاج إلى transfected لا يقل عن 4 ساعات قبل أن تكون المحتضنة في نقص الأكسجين وnormoxia. هذا الوقت يسمح للحمض النووي لدخول الخلايا بحيث لا تتأثر هذه الخطوة الأولى من نقص الأكسجين. يتم الكشف عن إشارة luciferase باستخدام أدوات الفحص Luciferase. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخاص بتعليم حقوق الإنسان ، transfected الخلايا في نقص الأكسجين في الغرفة أو استخدام وحدات تعليم حقوق الإنسان ، transfected الخلايا المحتضنة مع كوكلي 2 ، تشمل السيطرة normoxia. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة حضانة المطلوب ، وإزالة الخلايا من النمو المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا في برنامج تلفزيوني ، إزالة برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 400μl كاشف تحلل 1X في صحن الثقافة وتتخلص من الخلايا المرفقة ، ثم نقل منها إلى الأنبوب الصغير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الحطام بواسطة الطرد المركزي وجيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20μl مزيج من الخلايا lysates طاف مع 100μl من الكاشف Luciferase الفحص وقياس التألق باستخدام luminometer. </li></ol></li></ol> 4. ممثل النتائج : K562 في الخلايا (خلايا الإنسان خط اللوكيميا) مثقف 2 يوما في الأوكسجين منخفضة ، مقارنة normoxia ، نقص الأكسجة يدفع بزيادة قدرها مؤسسة الحرمين - 1α البروتين الذي اكتشفه لطخة غربية (الشكل 1). باستخدام HRE - 293 luciferase تعديل الخلايا (خلايا جنينية خط الكلى) المستزرعة في نقص الأكسجين ، وهي زيادة كبيرة ، مؤسسة الحرمين 1α النشاط تم الكشف عن خلايا ميتة في (الشكل 2). <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1 : زيادة مؤسسة الحرمين ، في خلايا ميتة 1α. وكانت الثقافة في الخلايا K562 normoxia ونقص الأكسجة (الغرفة ميتة) لمدة 48 ساعة وتحليلها بواسطة لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المحددة لمؤسسة الحرمين ، 1α. تم استخدام الأجسام المضادة لأكتين محددة لمراقبة التحميل. <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> Figure2 : مؤسسة الحرمين - 1α النشاط. تعليم حقوق الإنسان ، وتعديل luciferase 293 مثقف ونقص الأكسجين في الخلايا لمدة 48 ساعة normoxia وlysed ثم لاكتشاف إشارة luciferase استخدام عدة ومقايسة luciferase luminometer ملف. يتم التعبير عن النتائج على النحو التلألؤ وحدة نسبية (RLU).

<ol><li>Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+hypoxia+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).</li>
<li>van Laarhoven, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+in+relation+to+vasculature+and+proliferation+in+liver+metastases+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).</li>
<li>Hockel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+pO2+predicts+survival+in+advanced+cancer+of+the+uterine+cervix%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intratumoral pO2 predicts survival in advanced cancer of the uterine cervix.</a> Radiother Oncol. 26, 45-50 (1993).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1+and+human+disease%3A+one+highly+involved+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">HIF-1 and human disease: one highly involved factor.</a> Genes Dev. 14, 1983-1991 (2000).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1%3A+master+regulator+of+O2+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis.</a> Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).</li>
<li>Tatum, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%3A+importance+in+tumor+biology%2C+noninvasive+measurement+by+imaging%2C+and+value+of+its+measurement+in+the+management+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy.</a> Int J Radiat Biol. 82, 699-757 (2006).</li>
<li>Brahimi-Horn, M. C., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">HIF at a glance.</a> J Cell Sci. 122, 1055-1057 (2009).</li>
<li>Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoCl2%2C+a+chemical+inducer+of+hypoxia-inducible+factor-1%2C+and+hypoxia+reduce+apoptotic+cell+death+in+hepatoma+cell+line+HepG2%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2.</a> Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).</li>
<li>Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+regulates+p300-dependent+hypoxia-inducible+factor+1+transcriptional+activity+through+Forkhead+transcription+factor+3a+%28FOXO3a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تكاثر الخلايا وقدرتها على البقاء في ظروف نقص الأوكسجين تختلف كثيرا تبعا للأنواع الخلايا. لذا ، يجب عليك ضبط عدد الخلايا أو عدد من لوحات تبدأ مع الثقافات للتأكد من سيكون لديك ما يكفي من الخلايا / البروتينات لإجراء التجارب الخاصة بك. كلوريد الكوبالت الأسلوب له ميزة أن تكون غير مكلفة وسريعة. يحاكي هذا المنتج عن طريق حفز HIF-1/3α نقص الأكسجين ولكن يمكن أيضا تنظيم جينات أخرى ، تأكد من تكييف هذا المنتج إلى المشروع الخاص بك عن طريق التحقق من غيرها من الآثار ما كان يمكن أن يكون على وظيفة والنمط الظاهري للخلايا معينة ، بصرف النظر عن تقليد &quot; ميتة &quot;تأثير. دواء آخر يستخدم أيضا لنقص الأكسجين هو تقليد mesylate ديفيروكسامين (DFO ، الذي استخدم في تركيز 100 ميكرومتر النهائي). استخدام هذه العقاقير يسمح experimentator لفتح لوحة الثقافة / صحن / قارورة مرات عديدة دون أن يؤثر ذلك على &quot;حالة نقص الأوكسجين&quot;. لا يمكن للمستوى الأكسجين الموجود في خليط الغاز تختلف تبعا لتجاربك وأنواع الخلايا كقيم نقص الأكسجة تختلف تبعا لأنواع الأنسجة والخلايا. في الواقع ، بعض الخلايا هي ميتة في 5 ٪ O 2 الحاجة الأخرى أقل من 1 ٪ O 2 لتكون ميتة. يتم إضافة 5 ٪ CO 2 إلى خليط الغاز لتحقيق الاستقرار في الرقم الهيدروجيني للثقافات ، والنيتروجين عادة ما تبقى من الغاز. غرف ميتة لديها ميزة عدم استخدام العقاقير التي يمكن أن سلوك الخلية بشكل مستقل بديل للتوتر الأوكسجين. ومع ذلك ، يمكن القيام به ليست كل أنواع التجريب وإعادة الأوكسجين يدخل غرفة في كل افتتاح ويقلل بالتالي نقص الأكسجين. يجب عليك أن تنظر في هذا العامل تجاربك ؛ نقص الأكسجة / إعادة الأوكسجين هو شرط محدد يمكن أن تؤثر على بعض أنواع الخلايا. بديل لاستخدام محطات العمل نقص الأكسجة (متصلة خزانات الغاز قبل مختلطة أو لأنظمة الغاز الاختلاط) أو أكبر حاضنة نقص الأكسجة (نقص الأكسجة تجهيز الغرفة مع علبة القفازات) التي تسمح للتجريب وسائل الإعلام لتغيير والتلاعب في خلايا ميتة البيئة المستمر. وقد تم تسويقها غرف ميتة مختلفة على مدى العقد الماضي ، وينبغي أن يختار وفقا لاستخدام المختبر الخاص ، والمشاريع ، والفضاء ، والحجم ، والميزانية. ضمان الاستخدام الجيد دائما وحالة الغرفة الخاصة بك لضمان ظروف التربية الصحيحة. بشكل عام عند استخدام الغرفة ، يمكن أن يكون مستوى نقص الأكسجين عن طريق التضمين اختيار يمزج الغاز المختلفة (أي 1 ٪ ، 5 ٪ 10 ٪ أكسجين). فيما كشف 1α ، مؤسسة الحرمين ، فمن المهم أن نعرف أن بعض الخلايا السرطانية عن خط مؤسسة الحرمين في normoxia - 1α. ومن ثم فهي حاسمة لاستخدام normoxia مراقبة لتحديد المستوى القاعدي لمؤسسة الحرمين في هذه الأسطر الخلية. مؤسسة الحرمين ، ويمكن أيضا أن تكون 1α موجودة في normoxia في غير الخبيثة الخلايا التالية تحفيز الخلية أو الإجهاد. يمكن أن يحدث هذا أيضا إذا تجويع هذه الخلايا ، تأكد من أن يتم بشكل صحيح الثقافات صومعتك الأعلاف والمحافظة عليها.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> المناهضة للمؤسسة الحرمين - 1α </td><td> Invitrogen </td><td> 458400 </td></tr><tr><td> الكوبالت (II) كلوريد </td><td> سيغما </td><td> C8661 - 25G </td></tr><tr><td> غرفة الحاضنة </td><td> بيلوبس - روتنبرج </td><td> MIC - 101 </td></tr><tr><td> HRE - Luciferase البلازميد </td><td> Adgene </td><td> البلازميد 26731 </td></tr></tbody></table>

التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

يتم تعريف نقص الأكسجة بأنه انخفاض أو نقص الأكسجين في الأجهزة والأنسجة أو الخلايا. وهذا يمكن تخفيف حدة التوتر الأكسجين يكون راجعا إلى انخفاض حجم المعروض في الأكسجين (تشمل الأسباب غير كافية شبكة الأوعية الدموية ، خلل الأوعية الدموية ، وفقر الدم) أو إلى زيادة استهلاك الأكسجين النسبي لتوريد (الناجمة عن ارتفاع معدل الانتشار المفاجئ الخلية) . يمكن أن يكون نقص الأكسجين فيزيولوجية أو مرضية مثل سرطانات الصلبة 1-3 ، الخ التهاب المفاصل الروماتويدي تصلب الشرايين... كل الأنسجة والخلايا لديها القدرة على التكيف مع مختلف هذه الحالة الجديدة. أثناء نقص الأكسجين ، واستقرت نقص الأكسجين محرض ألفا عامل (مؤسسة الحرمين) ، وينظم جينات مختلفة مثل المتورطين في الأوعية الدموية أو نقل الأوكسجين 4. استقرار هذا البروتين هو السمة المميزة لنقص الأكسجين ، وكشف ذلك يستخدم بشكل روتيني للكشف عن مؤسسة الحرمين 5-7 نقص الأكسجة. في هذا المقال ، فإننا نقترح طريقتين بسيطة للحث على نقص الأكسجين في خلايا الثدييات الثقافات واختبارات بسيطة لتقييم حالة نقص الأوكسجين في هذه الخلايا.

هنا نقترح أساليب بسيطة للحث على نقص الأكسجين في مزارع الخلايا واختبارات بسيطة لتقييم حالة نقص الأوكسجين من الثقافات.

تُعرَّف نقص الأكسجة (Hypoxia) بأنها انخفاض أو فقدان الأكسجين في الأعضاء أو الأنسجة أو الخلايا. ويمكن أن يعود هذا الانخفاض في ضغط الأكسجين إلى نقص الإمداد في...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز نقص الأكسجة في المزارع الخلوية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استزراع الخلايا في وجود محفز كيميائي للعامل المحفز لنقص الأكسجة 1، أو باستزراع الخلايا في حاضنة أو غرفة نقص أكسجة مملوءة بخليط غازي خاص. بعد ذلك، يتم الكشف عن نقص الأكسجة من خلال التحقق من مستوى تعبير HIF one alpha في مستخلصات البروتين الخلوية، أو عن طريق قياس نشاطه باستخدام ناقل ENC يشفر تسلسلات الارتباط بـ hi one alpha.في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تُظهر زيادة في مستويات تعبير ونشاط HIF one alpha من خلال تحليل لطخة ويسترن والكشف عن التألق الحيوي. اسمي داني يو، وأنا باحث في مختبر باتريزيا إندا. سأقوم اليوم بشرح هذا الإجراء لتحفيز نقص الأكسجة باستخدام كلوريد الكوبالت.ابدأ بتحضير محلول مخزون بتركيز 25 millimolar من كلوريد الكوبالت في ماء مقطر مزدوج معقم. أضف المحلول إلى الخلايا وازرعها بتركيز نهائي قدره 100.Micromolar. قم بتحضين الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 degrees Celsius و 5%carbon dioxide لتحفيز نقص الأكسجة.باستخدام غرفة حضانة نمطية، قم بتحضير مستنبتين خلويين متطابقين على الأقل. ومع ذلك، يُوصى بتجهيز ثلاث مكررات لكل حالة. افتح غرفة الحضانة النمطية عن طريق فتح المشبكين البلاستيكيين الأبيضين الموجودين على الأنابيب المتصلة بالغرفة أولاً، ثم قم بإزالة الغطاء والصواني.ضع المزرعة الخلوية في غرفة نقص الأكسجين مع وضع طبق بتري يحتوي على ماء معقم داخل الغرفة لتوفير ترطيب كافٍ للمزارع. ضع المزرعة الخلوية الثانية في ظروف Normoxia كعينة ضابطة لتحفيز نقص الأكسجين. قم بتوصيل الأنابيب بخزان نقص الأكسجين الذي يحتوي على خليط غازي بنسبة 1%oxygen.إذا كان مقياس التدفق متصلاً بالخزان، فسيتم توصيل الحجرة به مباشرة. نحن نستخدم مقياس تدفق مدمجاً في المنظم لدينا لإزالة كل الأكسجين الموجود في الحجرة وفي الوسط. قم بتطهير الحجرة عن طريق فتح خزان الغاز بمعدل تدفق قدره 20 liters per minute لمدة تتراوح من أربع إلى سبع دقائق.بعد ذلك، قم بإيقاف تدفق الغاز بسرعة وأغلق الحجرة تماماً، وذلك عن طريق إغلاق كلا المشبكين الأبيضين. ثم أعِد الحجرة إلى حاضنة تقليدية للمدة الزمنية المطلوبة.في حال استخدام مستنبتات كبيرة، اترك الوسط والمستنبتات في حالة DGAs لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين، ثم كرر عملية الشطف لتقييم نقص الأكسجة. وباستخدام الكشف عن HIF one alpha بواسطة لطخة ويسترن، أعد فتح الغرفة كما تم توضيحه سابقاً وضع المستنبتات على الثلج فوراً. قم بمعالجة الخلايا المعرضة لنقص الأكسجة والخلايا غير المعالجة بمحلول 5%SDS.بعد ذلك، يتم نقل المستخلصات إلى أنابيب وإجراء عملية السونكة (sonication) لاستخلاص البروتينات، ثم يتم الطرد المركزي لترسيب حطام الخلايا وجمع الطافي. بعد ذلك، يتم قياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة BCA. ثم يتم تحضير عينة الهلام (gel sample) عن طريق إضافة منظم التحميل (loading buffer) والتسخين عند 95 °C لمدة خمس دقائق.افصل البروتينات باستخدام هلام بولي أكريلاميد SDS بتركيز 8% وانقلها إلى غشاء نيتروسليلوز. قم بحجب الغشاء في محلول PBS يحتوي على 5% حليب جاف خالي الدسم و 0.1% tween 20 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة أو في درجة حرارة أربع درجات Celsius طوال الليل على هزاز. قم بحضن اللطخة طوال الليل باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة أولي مضاد لـ HIF one alpha في نفس المحلول المنظم في درجة حرارة أربع درجات Celsius.في اليوم التالي، اغسل اللطخة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام محلول PBS المحتوي على 0.1%tween 20 في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بالتحضين مع جسم مضاد ثانوي HRP في محلول PBS مضاف إليه 0.1%tween 20 لمدة 45 دقيقة. اغسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة باستخدام محلول PBS المحتوي على 0.1%tween 20 في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، يتم تحضين الغشاء في محاليل الكشف بالتلألؤ الكيميائي وتعريضه لفيلم الأشعة السينية لقياس نشاط luciferase. قم بإزالة وسط النمو من الخلايا المستنبتة، ثم اشطف الخلايا باستخدام PBS.بعد ذلك، أضف 400 µL من كاشف التحلل (lysis reagent) بتركيز 1x إلى طبق الزرع. قم بكشط الخلايا الملتصقة وانقلها إلى أنبوب دقيق (micro tube). قم بترسيب الحطام عن طريق عملية طرد مركزي قصيرة.امزج 20 µL من طافي محلل الخلايا مع 100 µL من كاشف مقايسة لوسيفيراز، وقس التألق الحيوي باستخدام مقياس التألق. تم استزراع خلايا K 5 62 في ظروف نقص الأكسجة أو سويّة الأكسجة لمدة 48 ساعة، وحُللت بواسطة لطخة ويسترن باستخدام جسم مضاد متخصص لـ H one alpha. كما استُخدم جسم مضاد متخصص لـ beta actin كضابط تحميل.تظهر النتائج زيادة في HI F1 alpha في الخلايا التي تعاني من نقص الأكسجين. تم استنبات خلايا HRE Luciferase modified 2 93 في ظروف نقص الأكسجين أو ظروف الأكسجة الطبيعية لمدة 48 ساعة، ثم تم تحليلها للكشف عن إشارة اللوسيفيراز باستخدام طقم تحليل اللوسيفيراز ومقياس الضياء هنا. كما تم الكشف عن زيادة في نشاط HIF one alpha في الخلايا التي تعاني من نقص الأكسجين.يتم التعبير عن النتائج كتلألؤ نسبي. ولا تنسَ أن التعامل مع الغازات الدقيقة يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة أثناء تنفيذ هذا الإجراء، مثل تثبيت أسطوانة الأكسجين في الحائط أو على طاولة المختبر بشكل صحيح، وفتح وإغلاق أسطوانة الأكسجين بعناية، بالإضافة إلى التحكم في الضغط.

induction-and-testing-of-hypoxia-in-cell-culture

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يتم تطبيق تلألؤ بيولوجي التصوير من نقص الأكسجة النشاط عامل محرض 1α لرصد نقص الأكسجة الورم داخل القحف التنمية في الدماغ سرطان الثدي نموذج الفأر الانبثاث.

في ضوء بارد التصوير حيوية الجسم الحي من نقص الأكسجة ورم من الدماغ الانبثاث سرطان الثدي في نموذج الفأر

هنا، نحن تصف منهجية لإجراء سيرنا المستهدفة "ubiquitome" الشاشة لتحديد اليوبيكويتين الرواية والمنظمين مثل اليوبيكويتين الاستجابة بوساطة HIF1A الخلوية لنقص الأكسجة. وهذا يمكن أن تتكيف مع أي مسار بيولوجي حيث قراءة قوية من النشاط الصحفي هو متاح.

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

توضح هذه المقالة منهجية لإدارة فترات قصيرة من نقص الأكسجين المتقطع للما بعد الولادة يوم 08/01 الماوس أو الفئران الجراء. هذا النهج يثير بشكل فعال على مستوى الأنسجة قوي "فتيلة تأثير" على الخلايا الاصلية العصبية مثقف التي يتم حصادها خلال 30 دقيقة من التعرض نقص الأكسجين.

تسليم<em&gt; في فيفو</em&gt; الحاد المتقطع نقص الأكسجة في الأطفال حديثي الولادة القوارض لرئيس Subventricular المنطقة المستمدة من الثقافات خلية العصبية السلف

تقدم هذه المخطوطة نموذجا فريدا في المختبر لخلايا الأرومة الغاذية الخلوية الزغابية البشرية المنعقة المناعية المزروعة تحت نقص الأكسجة / إعادة الأكسجين. هذا النموذج مناسب لدراسة الآثار الوقائية للعلاجات الواعدة ، مثل الميلاتونين ، على مضاعفات الحمل المرتبطة بزيادة الإجهاد التأكسدي وتغير وظيفة المشيمة.

الإنسان الأرومة الغاذية الابتدائية خلية ثقافة نموذج لدراسة تأثيرات واقية من الميلاتونين ضد نقص الأكسجة / الناجم عن عودة التأكسج تعطيل

تصف هذه المخطوطة تطوير نموذج حيواني يسمح بالاختبار المباشر لآثار نقص الأكسجة في الورم على ورم خبيث وفك رموز آليات عمله. على الرغم من أن التجارب الموضحة هنا تركز على ساركوما إوينغ ، إلا أنه يمكن تطبيق نهج مماثل على أنواع الأورام الأخرى.

في فيفو نموذج لاختبار تأثير نقص الأكسجة على الانبثاث ورم

نحن نقدم نظام غرفة هايبوكسيك الرواية للاستخدام مع الكائنات المائية مثل الضفدع والأجنة الزرد. نظامنا هو بسيط، قوي، فعالة من حيث التكلفة ويسمح للاستقراء والحفاظ على نقص الأكسجة في الجسم الحي ، وتصل إلى 48 ساعة. نقدم 2 أساليب قابلة لإعادة الإنتاج لمراقبة فعالية نقص الأكسجين.

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

هنا يمكننا وصف بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن co لدراسة البروتين-بروتين التفاعلات بين البروتينات النووية الذاتية تحت ظروف التاكسج. هذا الأسلوب مناسبة للمظاهرة للتفاعلات بين عوامل النسخ والنسخي المنظمين المشارك في نقص.

استخدام البروتينات النووية الذاتية من الخلايا المزروعة تحت ظروف التاكسج بالانزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن

المسافة المكانية هي معلمة رئيسية في تقييم إصابة نقص الأكسجة / إعادة الأكسجين في نموذج الزراعة المشتركة لطبقات الخلايا البطانية وخلايا عضلة القلب المنفصلة ، مما يشير ، لأول مرة ، إلى أن تحسين البيئة المكانية للزراعة المشتركة ضروري لتوفير نموذج موات في المختبر لاختبار دور الخلايا البطانية في حماية الخلايا العضلية القلبية.

تطوير نموذج الزراعة المشتركة للخلايا لمحاكاة نقص تروية القلب / التروية في المختبر

نقدم جهازا جديدا لقياس معدلات استهلاك الأكسجين (OCR) في الثقافات الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE). يمكن للجهاز قياس التعرف الضوئي على الحروف لأسابيع في كل مرة على RPE نمت على لوحات زراعة الخلايا القياسية مع الوسائط القياسية بينما تكون اللوحات في حاضنة زراعة الخلايا القياسية.

مراقبة طويلة الأجل لمعدلات استهلاك الأكسجين في الثقافات الظهارية الصبغية الشبكية شديدة التمايز والاستقطاب

هنا، نصف بروتوكولا في المختبر لنمذجة نقص الأكسجين/تلف إعادة الأكسجين في الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة ذات الأيض العالي. تم تصميم هذا النموذج لتحفيز الضرر الناتج عن الإجهاد الأيضي، والذي يمكن قياسه من خلال التعبير عن علامات تلف الأنابيب القريبة وتقييم وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندري.

نمذجة إصابة نقص الأكسجين/إعادة الأكسجين في الخلايا الظهارية الأنبوبية القريبة

تعلم طرق إحداث نقص الأكسجة في الثقافات الخلوية وتقييمها باستخدام كلوريد الكوبالت والحضانات الخاصة. يتم الكشف عن HIF-1 alpha بالتلوين الغربي والتألق لدراسة الاستجابات الخلوية.

التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية

استكشف المزيد من الفيديوهات