النمذجة اشارة المناعة العصبية من الصداع النصفي العرضية والاكتئاب المزمن عن طريق نشر في المختبر

الهدف من هذا الفيديو هو توضيح كيف يمكن استخدام مزارع شرائح الحصين لفك تشفير الإشارات المناعية العصبية التي تعدل القابلية لانتشار الاكتئاب ، وهو السبب الكامن وراء هالة الصداع النصفي وربما الصداع النصفي. يتم استحضار انتشار الاكتئاب بسهولة في ثقافات شرائح الحصين. نظرا لأن الثقافات يتم الاحتفاظ بها في المختبر لأسابيع ، يمكن قياس سلوك أنواع الخلايا الفردية وتقليدها وتعديلها على مدى فترات طويلة.

هذا مهم بشكل خاص لدراسة الإشارات المناعية العصبية. نظرا لأن شرائح دماغ الحصين الناضجة تصل إلى حالة مناعية هادئة ، يمكن تقييم الاستجابات المناعية لانتشار الاكتئاب دون الآثار المربكة المحتملة للتخدير باستخدام التقنيات البيولوجية الجزيئية الحديثة. يمكن تحديد الكشف الحساس للسيتوكينات التي تشير من أقل من 50 خلية إلى ما يقرب من 90،000 خلية في شريحة وفقا لذلك.

تعتبر ثقافات شرائح الدماغ في الحصين مناسبة بشكل مثالي للاستخدام في تطوير علاجات مناعية عصبية جديدة للتخفيف من الصداع النصفي. اسمي Yian Berg وهذه Aya Puss و Heidi Mitchell من مختبر ريتشارد كريج وقسم طب الأعصاب في المركز الطبي بجامعة شيكاغو. سنوضح اليوم استخدام الحصين والقمل والثقافات ودراسة الإشارات المناعية منخفضة المستوى لانتشار الاكتئاب.

انتشار الاكتئاب هو حدث عصبي انتيابي ناتج عن انفجار من النشاط المشبكي المتزايد الذي يتبعه بسرعة فقدان عابر لجميع الأنشطة. تظهر الأدلة المتزايدة أن الإشارات المناعية منخفضة المستوى يمكن أن تؤثر وفي المقابل تتأثر بالنشاط المشبكي داخل الدماغ. نفترض أن السيتوكينات تعدل القابلية لانتشار الاكتئاب ونتيجة لذلك ، هالة الصداع النصفي وربما الصداع النصفي أيضا.

تصميم الإجراءات التي نصفها هنا لتقليل تنشيط الخلايا المناعية المربك وزيادة قدرتنا على اكتشاف الإشارات المناعية منخفضة المستوى. يتيح لنا ذلك اكتشاف أكبر مجموعة من الإشارات المناعية العصبية وتفاعلاتها مع انتشار الاكتئاب. لبدء هذا الإجراء ، قم بعمل أقطاب كهربائية أرضية عن طريق قطع الأنابيب الزجاجية بأطوال 4.5 ملم.

ثم قم بتلميع الأقسام المقطوعة في كلا الطرفين لفترة وجيزة. بعد ذلك ، أحضر 100 مل من كلوريد البوتاسيوم المولي ليغلي وأضف 3.5 جرام من الأجار و 0.5 جرام من EDTA إليه. قلب الخليط باستمرار لإنتاج محلول أصفر صاف.

ضع قطعة من الأنابيب المرنة القصيرة فوق كل أنبوب زجاجي. ثم ارسم محلول كلوريد البوتاسيوم الدافئ في الأنبوب الزجاجي ومسافة قصيرة في الأنبوب المرن. حرر الشفط واترك أجار كلوريد البوتاسيوم بالتنقيط ببطء من الطرف المفتوح للأنبوب الزجاجي.

عندما يتساقط الأجار ، المس قطعة من الثلج بطرف الأنبوب الزجاجي المفتوح ، مما سيدفع الأجار إلى الهلام عند طرف القطب وليس الهلام بعد الانحسار مرة أخرى في أنبوب الأنبوب الزجاجي. بمجرد أن يتم تقطيع الأجار ، قم بإزالة الأنبوب المرن برفق دون تغيير موضع الأجارة. في الأنابيب الزجاجية ، ضع 0.5 مل من كلوريد البوتاسيوم المولي في كل بئر من رف أنبوب الطرد المركزي سعة 1.5 مل.

ثم ضع طرف كل أنبوب زجاجي من كلوريد البوتاسيوم في آبار فردية للحفاظ على رطوبة الأطراف. بعد ذلك ، أمسك سلكا فضيا بطول 80 سم عيار 15 مع مرقئ. نظف كل جانب من الجوانب الأربعة عن طريق كشط السلك من خلال لوح صنفرة مثبت على سطح العمل.

بعد ذلك ، قم بقطع السلك إلى أطوال أربعة سنتيمترات. ضعيها في قارورة تلألؤ مملوءة بالمبيض لمدة 20 إلى 30 دقيقة. من أجل وضع طبقة صلبة من الفضة إلى كلوريد الفضة على السطح الفضي النظيف ، قم بثني السلك إلى نصفين وإدخاله في الأنبوب الزجاجي المملوء بأجار كلوريد البوتاسيوم مع ترك حوالي أربعة إلى ستة ملليمترات مكشوفة.

ثم قم بتغطية طرف الأنبوب الزجاجي الذي يحتوي على السلك الفضي ومساحة صغيرة من السلك بمادة لاصقة ، وهو غراء مرن ومقاوم للماء لمنع أجار كلوريد البوتاسيوم من الجفاف ، كرر ذلك لجميع الأقطاب الكهربائية واترك الغراء يجف طوال الليل. بعد الرسم ، قم بتخزين الأقطاب الكهربائية في قوارير تلألؤ مع خمسة ملليلتر من كلوريد البوتاسيوم المولي و 25 ملليغرام من EDTA. حوالي خمسة إلى ستة أقطاب كهربائية لكل قارورة عند أربع درجات مئوية.

اصنع أقطاب تسجيل بأنابيب زجاجية من سيليكات بو خيوط. بعد ذلك ، قم بعمل قطب كهربائي محفز عن طريق قطع حوالي 20 سم من ميريديوم البلاتين المطلي بالتفلون. ثم ثني الطول إلى النصف ، واربط الأطراف السائبة في عقدة مربعة فضفاضة ، مع ترك حوالي سنتيمترين من العقدة إلى نهايات السلك.

قم بتأمين العقدة في ظرف العلبة الكهربائية الموضوعة على طاولة مع الإمساك بالطرف الآخر من السلك باستخدام مرقئ. قم بتشغيل المثقاب وإيقاف تشغيله لفترة وجيزة حتى يتم لف السلك بإحكام. لتوصيل الأسلاك الملتوية المصنوعة من الميريديوم البلاتيني بأسلاك الرصاص ، قم أولا بلصق سلك الميريديوم البلاتيني الملتوي على سطح المقعد وإسقاط بركة من حمض الهيدروكلوريك المركز فوق أحد طرفي السلك الملتوي.

ثم ضع الطرف المجرد على سلك رصاص مجاور لنهاية السلك الملتوي وقم بتطبيق الحرارة من مكواة لحام ذات طرف ناعم ثم قم باللحام حتى يتم توصيل السلكين بإحكام. انزلق طولا قصيرا من أنابيب الانكماش الحراري فوق وصلة السلك المكشوف وقم بتقليصها بالنار الحرارية. قم بتلميع طرف الماصة السابقة التي يبلغ طولها 15 سم وقم بتوجيه سلك الزوال البلاتيني الملتوي أسفل الماصة.

استخدم إيبوكسي طارد للماء لإغلاق طرفي القطب. أخيرا ، قم بتوصيل سدادات الموز بنهايات سلك الرصاص للاتصال بعزل المحفز تحت المراقبة المجسمة. ضع طرف القطب الكهربائي في PBS وابحث عن الفقاعات المنتجة إلكتروليتيا القادمة من الطرف المقطوع فقط لأطراف القطب الكهربائي إذا كانت هناك أي فقاعات تأتي من جوانب الأسلاك الملتوية.

قم بقص القطب الكهربائي بشكل عرضي باستخدام شفرة حلاقة أحادية الحافة لإعادة العزل السليم للمحاور الطويلة للأسلاك. عند استكشاف الأخطاء وإصلاحها لحل تأثيرات التحفيز الشاذ ، حاول عمل طرف قطب كهربائي مقطوع حديثا. خطوة أخرى مهمة هي تحضير أطباق التسجيل ، والتي تتكون من ملحق ثقافة شريحة وطبق استزراع 35 ملم يجلس على قضيبين زجاجيين مقاس 1.0 × 12 ملم متباعدة حوالي 1.0 سم.

يتم توصيل قضبان زجاجية بقاعدة الطبق عن طريق تسخين الأنابيب الزجاجية ثم الضغط عليها في القاعدة بالملقط. لظروف التسجيل الثابتة ، أضف 1.5 مل من الوسائط إلى الطبق. بعد ذلك ، انقع قطعة من القطن المعقم بعرض 10 ملليمترات وطولها من ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات.

في 1.0 مل من الوسائط ، قم بطي القطن إلى نصفين على طول المحور الطويل وضعه على طول الجدار الداخلي على الملحق. باستخدام ملقط معقم ، يساعد القطن المبلل في الحفاظ على رطوبة الأطباق. ثلاث قطع قابلة للضغط من الأنابيب بطول أربعة ملليمترات متباعدة بالتساوي حول الإدراج.

قم بتغطية الطبق بإحكام بغشاء البولي فينيل كلوريد للسماح بتبادل الغازات. ثم قم بقص حول جدارها الرأسي الأوسط بشفرة حلاقة ذات حافة واحدة لإزالة كلوريد البولي فينيل الزائد. يستحضر الفيلم حوالي ثلاثة إمكانات مجال مع نبضات 100 ميكروثانية عند 0.2 هرتز ، بدءا من تيار من حوالي واحد إلى خمسة ميكرو أمبير وهو ما يكفي لتحفيز الاستجابة.

حرك قطب التسجيل بزيادات على طول المحور الطويل للخلايا العصبية شبه المعدنية حتى يصبح جهد المجال أقصى. بعد ذلك ، قم بزيادة التيار باستخدام قطب تسجيل في هذا الموضع ولاحظ الحد الأقصى للاستجابة الحالية من حوالي 10 إلى 20 ميكرو أمبير. أخيرا ، استخدم نصف شدة التحفيز القصوى للتجارب لتحديد عتبة الاكتئاب المنتشر الذي يتم استحضاره عبر التشابك.

قم بتبديل نموذج التحفيز لاستحضار رشقات نارية فردية يدويا تبلغ 100 ميكروثانية لكل نبضة عند 10 هرتز. قم بزيادة الشدة الحالية تدريجيا لكل انفجار حافز حتى يتم تشغيل انتشار الاكتئاب. الإبلاغ عن انتشار عتبة الاكتئاب في lums يؤدي إلى انتشار الاكتئاب كل تسع دقائق لمدة ساعة.

سجل ثلاثة مناطق إمكانات سريعة وتغيرات محتملة بطيئة عبر أنظمة معالجة الإشارات الرقمية المنفصلة. بعد آخر اكتئاب منتشر ، أعد إدراج المزرعة إلى ظروف الحضانة الطبيعية وقم بتمييز غطاء طبق الثقافة. لملاحظة الثقافة التي شهدت انتشار الاكتئاب ، قم بتغيير الوسائط كل ثلاثة إلى أربعة أيام حتى حصاد الثقافة.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق تخفيف ISO selectin إلى 20 ميكروغرام لكل مليلتر في وسائط النمو. ثم احتضان مزارع الشرائح في ظروف الحضانة العادية قبل التصوير بأربع إلى 10 ساعات ، وقم بتشغيل كاميرا المجهر والأشعة فوق البنفسجية والضوء والتحكم في درجة الحرارة والغازات قبل ساعة واحدة على الأقل من التصوير. بعد ذلك ، قم بإعداد برنامج التحول للتصوير بعد هذا وضع الإدخال في طبق ثقافة 35 ملم مع قضيبين زجاجيين بطول ملم واحد في الأسفل.

ثم ضع ثلاث قطع من الأنابيب المطاطية بطول ملليمترين بين جدران الملحق وطبق الثقافة. لمزيد من الاستقرار في الملحق ، ضع قطعة قطن بعرض 10 ملم مبللة في مليلتر إضافي واحد من الوسائط داخل الملحق. للحفاظ على بيئة رطبة ، قم بتغطية الجزء العلوي من طبق الثقافة بإحكام بغشاء البولي فينيل كلوريد.

لمنع فقدان السوائل ، تأكد من أن تركيز التصوير ينصب على طبقة الخلايا شبه المعدنية الثلاث CA. لاحظ اتجاه الشرائح عن طريق التقاط صور الطور بمعدل خمسة × 10 × و 20 × في نافذة التركيز البؤري الدقيق ، وقم بتعيين النطاق الحالي ليكون ثمانية والدقة لتكون نقرة واحدة ، وحدد التركيز البؤري لضمان صورة في التركيز البؤري في نافذة الحصول على اللقطات المتتابعة. حدد الفاصل الزمني ليكون دقيقة واحدة والمدة ست ساعات لالتقاط حركات الخلايا الدبقية الدقيقة بدقة.

يجب ألا يقل تكرار التصوير عن مرة واحدة في الدقيقة في نهاية الفيلم. تحقق من إصابة الخلايا عن طريق فحص الكلام CY لتجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). اغمر إدخالات ثقافة الشرائح في ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من الحمض النووي الريبي لاحقا وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام حتى مزيد من المعالجة.

للحصاد ، قم بإزالة الأنسجة الدخيلة باستخدام سكين زجاجي ، ضع الشرائح في الحمض النووي الريبي الفردي. أنابيب الطرد المركزي 1.5 مليلتر خالية من الحمض النووي تحتوي على 0.5 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات. باستخدام عينات تدور فرشاة الرسم ذات الرؤوس الدقيقة ، فإن 10 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة بطريقة نمطية بحيث تلتصق جميع الشرائح بنفس الجانب من أنابيبها.

قم بإزالة المادة الطافية PBS وأعد تعليق العينة في 500 ميكرولتر من التريول. قم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر أو احتفظ بها على الجليد حتى استخراج الحمض النووي الريبي يمكن تقييم تغيرات تعبير البروتين من ضربة قاضية من الحمض النووي الريبي SI بحساسية من خلال تعزيز تلطيخ المناعة التقليدي DAB عن طريق تكثيف الفضة والقياس الكمي المتري اللاحق. يظهر هنا نموذج التسجيل الفيزيولوجي الكهربي لثقافة الشرائح حيث يتم وضع قطب كهربائي صغير مسجل في طبقة الخلايا العصبية الخارقة للفلزات CA الثلاثة ويتم وضع قطب محفز ثنائي القطب في التلفيف المسنن.

فيما يلي مثال على إمكانات المجال الثلاثة CA المستحثة عن طريق تحفيز التلفيف المسنن ، والذي يستخدم لإنشاء نصف الاستجابة القصوى هنا يوضح CA ثلاثة استجابات محتملة للمجال ل 10 رشقات نارية هيرتز متبقية والتي تم زيادتها تدريجيا بكثافة لتؤدي في النهاية إلى انتشار الاكتئاب. في أسفل يسار الصفحة. تظهر هنا خلية مناعية حيوية مثالية.

يوضح هذا التصوير لأول مرة أن جزءا صغيرا من الخلايا الدبقية الصغيرة يتحرك لمسافات طويلة في نمط بحث مثالي كما هو موضح باللون الأحمر المعروف باسم رحلات الضريبة التي تتناسب عكسيا مع النشاط المتشابك. يسمح التضخيم المسبق ل CDNA بالكشف عن IFN gamma في مزارع شرائح الحصين. في البداية ، كان التصوير المقطعي المحوسب للجين المرجعي RPL 13 A 20.5 وكان IFN gamma غير قابل للاكتشاف على اليسار.

ومع ذلك ، بعد تضخيم Preem المشار إليه على اليمين ، تم اكتشاف IFN gamma بسهولة عند 29.0. مع تسجيل RPL 13 A عند 14.1 للإشارة إلى زيادة 12 ضعفا في تضخيم الإشارة ، يظهر هنا تأكيد كيميائي هيستولوجي مناعي للكفاءة. يتم استخدام تكثيف الفضة المتمايز للبيروكسيداز ثنائي أمين البنزين المناعي لتحديد الانخفاض الكبير في إنتاج السيكلوفيلين ب في مزارع شرائح الحصين المعالجة بالحمض النووي الريبي ، والتي تم إتقانها مرة واحدة.

يمكن تنفيذ التقنيات الموضحة في هذا الفيديو على مدار عدة أيام. نود أن نؤكد أن ثقافات شرائح الحصين لدينا تقترب بشكل وثيق من نظيرتها في الجسم الحي وهي مثالية لدراسة الإشارات المناعية ونشر الاكتئاب. ومع ذلك ، من الضروري الحفاظ على بيئة مناعية هادئة تحت السيطرة والظروف الزائفة.

لتقليل التنشيط المناعي المربك ، يجب الحفاظ على الثقافات في حالة معقمة. لا ينبغي أن يتعرضوا لاضطرابات كيميائية أو ميكانيكية أو حرارية مفرطة. نظرا لأن إشارات السيتوكين الفسيولوجية تحدث على مستوى الفيمتو المولار ، يجب تطبيق تقنيات قياس عالية الحساسية وقابلة للتكرار.

نحن نستخدم تقنية PCRA وتقنيات البروتينات الحساسة. أخيرا ، السيتوكينات متعددة الاتجاهات وزائدة عن الحاجة. ذلك. تعد أهداف السيتوكين المتعددة التي تم قياسها بمرور الوقت مفيدة لدراسة كيفية تعديل الإشارات المناعية للتعرض للإصابة بالتواء الاكتئاب وبالتالي الصداع النصفي.