إنتاجية عالية في الموقع أسلوب التهجين لتوصيف أنماط التعبير مرنا في الفأر الجنينية السفلى المسالك البولي التناسلي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور أنماط تعبير mRNA في أنسجة المسالك البولية التناسلية السفلية للجنين في الفئران النامية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تخليق مسبار ريبو (ribo probe) مُسمى بـ di oxygen من قالب تم إنتاجه بواسطة PCR. أما الخطوة الثانية من الإجراء فهي إنتاج مقاطع سميكة باستخدام الميكروتوم الاهتزازي (vibrating microtome).

تتمثل الخطوة الثالثة في إجراء تهجين موضعي (in situ hybridization) في مقاطع من المسالك البولية التناسلية السفلية الموجودة في سلال مخصصة. ويتم تصور جزيئات mRNA من خلال الكشف الكيميائي النسيجي المناعي لمجسات الريبونوكلييك المرتبطة باستخدام ركيزة الفوسفاتاز القلوية المترسبة BM purple. وفي النهاية، يمكن للفحص المجهري أن يوضح التمركز المكاني والزماني لنواتج نسخ mRNA ذات الوفرة المنخفضة والعالية في المسالك البولية التناسلية السفلية للجنين الفأر.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الكيمياء النسيجية المناعية في سهولة إنتاج المجسات الريبوزية (ribo probes) وإمكانية تصميمها للتعرف على معظم جزيئات mRNA في كامل الجينوم الخاص بالفأر. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة توفر رؤية متعمقة لأنماط تعبير mRNA أثناء تطور الجهاز البولي التناسلي للجنين في الفأر، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أعضاء وأنواع ومراحل نمو أخرى. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن عملية تضمين النسيج في الأجار قد تكون صعبة التعلم، ولأن الاختلافات الطفيفة في التوجيه قد تؤدي إلى نتائج غير متناسقة. قبل يوم واحد على الأقل من تحضير النسيج، قم بإزالة الغشاء من طبق زراعة خلايا بقطر 12 millimeter وتخلص منه، حيث ستعمل الحلقة المتبقية كقالب؛ انقع الحلقات طوال الليل في محلول مثبط لـ RNA.

في يوم تنفيذ البروتوكول، قم بتشريح الجهاز البولي التناسلي السفلي لفأر تمت إعادة ترطيبه بميثانول متدرج التركيز. تخلص من نحو ثلثي المثانة أثناء عمليات الغسل بمحلول PBS tween، واحفظ ما تبقى من أنسجة الجهاز البولي التناسلي السفلي في محلول PBS tween. الآن، ضع قالبًا حلقيًا معالجًا على شريحة مجهرية زجاجية، واملأه بمحلول agarose منخفض الانصهار بتركيز 4% عند درجة حرارة 62 °C، واتركه ليبرد لمدة دقيقتين تقريبًا.

الآن، قم بتجفيف أنسجة المسالك البولية التناسلية السفلية باستخدام ورق ترشيح، ثم اغمرها في محلول الأغاروز. استخدم الملقط لتوجيه النسيج بحيث يكون معلقاً في منتصف المسافة بين الجزء العلوي والسفلي من الحلقة. قم بالتحضين في قالب عند درجة حرارة 4 °C حتى يتصلب الأغاروز.

قبل تقطيع النسيج، قم بتجهيز شفرة ويلكينسون (Wilkinson) مخصصة عن طريق شطفها بالمذيبات، ثم بالماء. افصل الشفرة المزدوجة طولياً إلى شفرتين مفردتين. بعد ذلك، قم بتثبيت شفرة ويلكينسون باستخدام شفرة ميكروتوم.

للقيام بذلك، قم أولاً بقص شفرة الميكروتوم لتصبح بطول شفرة ويلكنسون (Wilkinson). ثم باستخدام لاصق Lock Tite، قم بلصق شفرة الميكروتوم بشفرة ويلكنسون مع ترك إزاحة عن حافة القطع بنحو 3 إلى 4 مليمترات. الآن قم بتركيب الشفرة المعززة في الميكروتوم المهتز واضبط زاوية الشفرة على 35 درجة.

قم بتجهيز حمام العينات الفاخر عن طريق ملء الحمام بمحلول PBS ووضع الثلج الرطب حوله. قبل تثبيت النسيج المدمج في السدادة، قم بإزالته من القالب الحلقي وتجفيف السطح السفلي باستخدام كتلة تجفيف. بعد ذلك، قم بلصق السطح المجفف بقرص التثبيت باستخدام لاصق Loctite.

أدخل القرص في جهاز الهزاز واضبط سمك المقطع على 50 microns، والسرعة على درجتين، وسعة الشفرة على أربعة. أثناء قطع مقاطع النسيج، استخدم ملاقط غير مدببة لنقل كل مقطع إلى طبق زراعة مكون من 24 بئراً مملوءاً بنصف milliliter من PBS tween بارد جداً. بعد التقطيع، قم بإزالة معظم الـ aros من حول كل مقطع نسيجي باستخدام مقص زنبركي قبل البدء في تهجين INI؛ ويمكن تخزين المقاطع لمدة تصل إلى 48 ساعة عند درجة حرارة four degrees Celsius في PBS tween يحتوي على two millimolar من sodium azide.

أولاً، قم بصنع سلال عينات مخصصة عن طريق قطع الجزء السفلي من أنبوب طرد مركزي دقيق عند علامة 100 µL. سخّن مكان قطع الأنبوب في لهب حتى يلين البلاستيك، ثم اضغط بقوة على البلاستيك اللين فوق مربع من الشبكة.

اتركه حتى يتصلب وقم بقص الشبكة الزائدة. أكمل تجهيز السلال باستخدام إبرة مُسخنة من مقاس 18 gauge لثقب ثقبين في غطاء كل أنبوب. اصنع صينية لحمل سلال العينات عن طريق حفر 24 ثقباً بقطر 12 millimeter وموزعة بالتساوي في غطاء طبق يحتوي على 24 بئراً (24 well plate).

يجب وضع كل ثقب مباشرة فوق بئر قبل البدء في التسخين المسبق لغرفة تهجين مغطاة مملوءة بنصف بوصة من مياه الصنبور حتى درجة حرارة 60.5 درجة مئوية. ابدأ عملية التهجين الموضعي (in situ hybridization) بإضافة 2 mL من PBS tween إلى كل بئر من أطباق الزرع ذات الـ 24 بئراً. قم بتغطية هذا الطبق بالغطاء المجهز والمحمل بالسلال.

الآن، انقل مقاطع الأنسجة إلى السلال في درجة حرارة الغرفة، مع التحضين الهزاز للمقاطع في 6% hydrogen peroxide مع PBS tween، يليه سلسلة من عمليات الغسيل بـ PBS tween، ثم التحضين مع proteinase K، متبوعاً بتثبيت آخر ومزيد من عمليات الغسيل. ولإتمام تحضير العينات، أضف 2 mL من محلول pre-war pre hybridization buffer إلى كل بئر، وحضّن اللوحة داخل غرفة التهجين المسخنة لمدة ساعة واحدة على الأقل. ابدأ عملية التهجين بإضافة 0.5 µg من RIBA Probe المسمى إلى كل منها.

بعد ذلك، استمر في التحضين طوال الليل داخل غرفة التهجين المسخنة. وفي اليوم التالي، اغسل الأنسجة بالمحلول 1 مع الانتقال تدريجياً إلى المحلول 2، ثم عالجها باستخدام RNAs. بعد ذلك، اغسل الأنسجة في المحلول 3، يليه غسلات في TBS tween ومحلول سد الأنسجة (tissue blocking buffer) بينما يتم تحضين الأنسجة في محلول سد الأنسجة.

ابدأ تحضين الجسم المضاد لـ dig لمدة ساعتين على الأقل في محلول منظم لامتصاص الأجسام المضادة عند درجة حرارة 4 °C بعد فترة التحضين. قم بطرد محلول الجسم المضاد مركزياً بسرعة 10,000 RPM لمدة دقيقة واحدة. ولإزالة المواد غير الذائبة، أضف الـ Senna إلى 2 mL من محلول منظم للجسم المضاد.

الآن، قم بإزالة الأنسجة من محلول الحجب وحضنها في محلول الأجسام المضادة المُحضّر. احفظها في غرفة تهجين طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C في اليوم الثالث من الإجراء. اغسل الأنسجة عدة مرات في محلول TBST مع الـ ole.

بعد ذلك، وباستخدام ماصة باستير زجاجية، انقل الأنسجة بعناية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة نظيفة. اغسل الأنسجة لمدة 10 دقائق باستخدام 1 mL من محلول NTM الفارغ.

بعد ذلك، استبدل المحلول بمحلول TMT الذي يحتوي على lava sole MBM purple. ضع الأنابيب في مكان مظلم، وعلى مدار الأيام القليلة التالية، راقب تطور اللون وقم بتغيير المحلول حسب الحاجة. بعد اكتمال تطور اللون، اغسل الأنسجة لفترة وجيزة باستخدام TMT الذي يحتوي على lava so، ثم قم بتحضينها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C في محلول PBS الذي يحتوي على para formaldehyde.

في اليوم التالي، يتم تبييض الأنسجة وغسلها. وتصبح المقاطع الآن جاهزة للتصوير. تم تثبيت أنسجة المسالك البولية التناسلية السفلية في الآجار بحيث يكون الخط الناصف للإحليل موازيًا للسطح المستوي لسدادة aros.

أدى هذا التوجيه إلى الحصول على مقاطع سهمية. وقد قامت سلالات عينات مصنعة خصيصاً بحماية مقاطع الأنسجة الرقيقة من الغبار والمواد الجسيمية. وذلك خلال إجراء التهجين في C لمدة عدة أيام.

كما منعوا فقدان أي من المقاطع. ومن الصعب الحد من تلطيخ الخلفية أثناء فترات الحضانة الطويلة المطلوبة للكشف عن جزيئات mRNA ذات الوفرة المنخفضة. ومع ذلك، يبدو أن إضافة sodium azide والترشيح اللاحق قد حدّا من تلطيخ الخلفية.

علاوة على ذلك، لم تكن هناك فروق مرئية في صبغ الخلفية عند تحضين العينات في محلول إظهار اللون لفترات زمنية طويلة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ستة أيام إذا نُفذت بشكل صحيح. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية لتحديد ما إذا كان نمط تعبير mRNAs يتوافق مع نمط تعبير البروتينات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور أنماط تعبير mRNA في الجهاز التناسلي السفلي النامي للفأر.