و في المختبر النظام الدراسي لاستئصال ورم من الخمول وتبديل للنمو النقيلي

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة تأثير العوامل المحتملة على سكون الخلايا الورمية و/أو خروجها من حالة السكون في الوقت الحقيقي وبإنتاجية عالية، وذلك باستخدام المقايسة المختبرية التالية لنمذجة سكون الورم أو التحول إلى النمو النقيلي. يتم تحقيق ذلك من خلال زراعة الخلايا الورمية الساكنة و/أو النقيلية أولاً في نظام استخلاص الغشاء القاعدي ثلاثي الأبعاد، أو نظام BME، الذي تم تكييفه ليتناسب مع منصة أطباق ذات 96 بئراً. وعند زراعتها في هذا النظام ثلاثي الأبعاد، تدخل الخلايا النقيلية في مرحلة سكون أو خمول مؤقتة.

وفي المقابل، تدخل الخلايا الورمية الخاملة داخل الجسم الحي في حالة سكون طويلة الأمد. وفي نظام الزراعة ثلاثية الأبعاد، يمكن حينئذٍ معالجة الخلايا النقيلية بعوامل مرشحة لمنع تحولها من السكون إلى التكاثر. بينما يمكن معالجة الخلايا الورمية الخاملة بعوامل مرشحة قد تحفز تحولها من حالة السكون إلى التكاثر.

سيتم تقييم السلوك التكاثري للخلايا الخاملة والخلايا النقيلية نتيجة للعلاج عن طريق إضافة طقم تحليل تكاثر الخلايا cell titer 96 aqueous one solution في النقاط الزمنية المطلوبة للتحليل بواسطة قارئ أطباق ELIZA. وتُظهر النتائج التي تم الحصول عليها تأثير العلاج على تكاثر الخلايا الورمية، سواء كانت خاملة أو نقيلية، بناءً على تحليل تكاثر الخلايا في نظام ثلاثي الأبعاد (3D). ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال النقائل السرطانية، مثل العوامل والآليات الخلوية التي تحافظ على الخلايا الورمية المنتشرة في حالة خمول، والعوامل والآليات الخلوية التي تحفز التحول من خمول الورم إلى النقائل السريرية.

قم بنقع عامل النمو المخفض في BME في ثلاجة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل في اليوم الذي يسبق إجراء مقايسة التكاثر. بعد ذلك، وفي يوم المقايسة، اختر إما مزارع خلايا ورمية خامدة أو مزارع خلايا ورمية نقيلية للتجربة. ثم ضع طبقاً به 96 بئراً على صينية من الثلج داخل غطاء تدفق الهواء الصفائحي أو غطاء سحب الدخان.

بعد ذلك، استخدم موزعًا مزودًا بسرنجة لطلاء كل بئر من آبار الصفيحة بـ 50 µL من BME المذاب والمبرد بالثلج. تأكد من عدم تكون فقاعات في الآبار، ثم ضع صفيحة الـ 96 بئر المطلية بـ BME في حاضنة رطبة تحتوي على 5% carbon dioxide عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة. وفي هذه الأثناء، ضع زجاجة trypsin عند درجة حرارة 37 °C لتدفئتها بينما تخضع الصفيحة المطلية بـ BME للتحضين.

قم بشفط الوسط الزرعي من الخلايا الورمية. اغسل أطباق المزرعة باستخدام 10 milliliters من PBS. بعد ذلك، قم بشفط PBS وأضف 2 milliliters من التريبسين المسخن مسبقاً إلى أطباق المزرعة.

حضّن الأطباق لمدة خمس دقائق. أضف 5 mL من وسط DMEM عالي الجلوكوز، المكمل بنسبة 10% FCS والمضادات الحيوية، إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL. خلال هذا الوقت.

بعد الحضانة، انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 15 ملiliter وقم بعدّ الخلايا. ثم قم بتدوير العدد الإجمالي للخلايا المراد استزراعها في جهاز طرد مركزي مخصص لزراعة الأنسجة لمدة خمس دقائق عند 1500 G في درجة حرارة الغرفة. اسحب السائل بعناية.

اترك كمية قليلة من الوسط الغذائي، حيث أن الراسب لا يكون مرئياً في معظم الحالات. بعد ذلك، قم بالنقر على قاع الأنبوب لضمان الحصول على معلق خلوي أحادي. ثم أعد تعليق الراسب باستخدام 100 µL من وسط المقايسة لكل 2 × 10³ من الخلايا.

قم بعملية الترتيب (triturate) للخلايا عدة مرات باستخدام ماصة سعة 5 mL لضمان الحفاظ على معلق خلوي أحادي. وزع 100 µL من المعلق الخلوي في كل بئر من بئر لوحة 96 بئراً المغطاة بـ BME لتكون لوحة تقييم الخلفية الضابطة، وأضف 100 µL إضافية من وسط المقايسة في كل بئر لعدد قليل من آبار لوحة 96 بئراً المغطاة بـ BME. بعد ذلك، قم بتحضين الألواح، ثم اشفط الوسط القديم وغذِّ الخلايا بوسط مقايسة جديد كل أربعة أيام.

لتقييم تكاثر الخلايا، أضف 20 µL من محلول cell titer 96 aqueous one من طقم مقايسة تكاثر الخلايا في كل بئر من أطباق الـ 96 بئراً التي يتم تحليلها عند النقطة الزمنية التجريبية المطلوبة. حضن الأطباق لمدة ساعتين. ثم باستخدام قارئ أطباق ELISA، سجل الامتصاصية لكل من آبار التجربة وآبار الخلفية عند 490 nm تمهيداً للومضانية المناعية.

صباغة جزيئات إشارات الخلية والخلايا الورمية؛ يتم إذابة BME في ثلاجة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل في اليوم السابق لإجراء الصباغة. في يوم الصباغة، توضع مجموعة شرائح زجاجية ذات ثماني حجرات على صينية من الثلج داخل غطاء تدفق صفائحي (laminar hood). بعد ذلك، تُستخدم ماصة 200 µL لتغطية كل بئر في نظام الشرائح الزجاجية بـ 50 µL من BME المبرد بالثلج.

تأكد من توزيع BME بالتساوي وعدم تكون فقاعات في الآبار. قم بتحضين الشرائح المطلية لمدة 20 دقيقة. اختر إما خطاً خلوياً لورم خامد أو خطاً خلوياً لورم نقائلي.

احصد الخلايا باستخدام التربسين كما تم وصفه سابقاً. ثم اجمع العدد الإجمالي للخلايا المراد زراعتها في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. الآن، قم بطرد الخلايا مركزياً، ثم اسحب السائل الطافي بعناية مرة أخرى، مع ترك جزء بسيط من الوسط.

للحصول على معلق خلوي أحادي، قم بالنقر على قاع الأنبوب المخروطي سعة 15 milliliter. أعد تعليق الراسب باستخدام 400 microliters من وسط المقايسة لكل 5 × 10³ من الخلايا. قم بسحب الخلايا وتوزيعها عدة مرات باستخدام ماصة سعة 5 milliliter لضمان الحفاظ على معلق الخلايا الأحادي، ثم وزع 400 microliters من محلول الخلايا في كل بئر من الغرف الثماني المطلية بـ BME.

بعد ذلك، يتم تحضين نظام الشرائح الزجاجية، وسحب الوسط القديم وتغذية الخلايا بوسط تحليل جديد كل أربعة أيام في النقاط الزمنية التجريبية المحددة. يتم سحب الطبقة العلوية من الوسط وإضافة 200 µL من المثبت المضاف إليه tritton والتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم يتم سحب المثبت المضاف إليه triton وإضافة 200 µL من المثبت فقط والتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة إضافية.

قم بشفط المثبت مرة أخرى وأضف الآن 400 µL من PBS إلى كل بئر. حضن اللوحة لمدة 10 دقائق إضافية في درجة حرارة الغرفة. ثم اشفط PBS وأضف 400 µL من PBS يحتوي على 0.05% بين 20 وقم بالتحضين لمدة 10 دقائق أخرى.

في درجة حرارة الغرفة أيضاً. الآن، يتم حجب الخلايا المثبتة باستخدام 200 µL من محلول الحجب. ثم تُحضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، وبعد فترة التحضين، يُشفط محلول الحجب ويُضاف 200 µL من الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب إلى كل منها.

يتم تحضين الشرائح مع الجسم المضاد الأولي طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C، وفي اليوم التالي، يتم سحب الجسم المضاد، ثم غسل الآبار ثلاث مرات عن طريق إضافة 400 µL من PBS لمدة 15 دقيقة مع سحب المحلول بعد كل مرة. وبعد سحب PBS من الغسلة الأخيرة، يتم إضافة 200 µL من جسم مضاد ثانوي مقترن بـ rod domine red.

بعد ذلك، قم بتغطية نظام شرائح الغرف الثماني برقائق الألومنيوم واتركه في الحاضنة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام PBS كما سبق، وبعد الغسلة الثالثة، قم بتثبيت الشرائح في وسط تثبيت beta shield الذي يحتوي على dpi.

أخيرًا، جفف الشرائح لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. يظهر هنا مثال لتحليل التكاثر لخلايا الورم الخاملة D 2.0 R وخلايا الورم ذات القدرة العالية على الانتقال D two A one في المزارع ثلاثية الأبعاد 3D. تظل خلايا D 2.0 R خاملة طوال فترة الزراعة التجريبية التي استمرت 14 يومًا، بينما تظل خلايا D two A one عالية الانتقال خاملة لمدة تتراوح من أربعة إلى ستة أيام فقط من الزراعة، وبعد ذلك تبدأ في التكاثر خلال مرحلة الخمول الأولية.

تظل العديد من الخلايا منفردة في المزرعة ثلاثية الأبعاد كما يظهر هنا في صورة تمثيلية لمزرعة في اليوم الرابع، بينما تتجمع خلايا أخرى غير تكاثرية في تجمعات خلوية متعددة. ويظهر هنا في هذه الصورة لمزرعة في اليوم 12 تحول خلايا D two A one من حالة السكون إلى حالة التكاثر في المزرعة ثلاثية الأبعاد. ويرتبط هذا التحول بتغيرات جذرية في مورفولوجيا الخلايا في هذا الشكل.

يظهر مثال على عامل يمنع خلايا D two A one من الانتقال من الحالة الخاملة إلى الحالة التكاثرية من خلال معالجة خلايا D two A one بمثبط محدد لإنزيم myosin light chain kinase. يتم الحفاظ على خلايا D two A one في حالة خاملة كما هو موضح في هذا الشكل. تحدث زيادة ملحوظة في فسفرة myosin light chain في خلايا D two A one باللون الأحمر، يتبعها إعادة تنظيم لخيوط F actin لتكوين ألياف إجهاد الأكتين باللون الأخضر أثناء انتقالها من مرحلة الخمول في الأيام من 1 إلى 4 إلى مرحلة التكاثر.

اليوم السابع. ومع ذلك، فإن تثبيط نشاط كيناز السلسلة الخفيفة للميوزين في خلايا D two A one بواسطة SHRA أو بواسطة عقار ML seven، يُبقي خلايا D two A one في حالة خمول ويؤدي إلى تثبيط فسفرة السلسلة الخفيفة للميوزين، و F act، وتنظيم ألياف الإجهاد كما هو موضح هنا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد نظام النموذج المختبري لدراسة خمول الورم والتحول إلى النمو النقلي.