الجلد ثلاثي الأبعاد إعادة بناء الإنسان النموذجي : أداة لدراسة بشرة العادية والتقدم الميلانوما

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد لإعادة بناء الجلد البشري لدراسة بيولوجيا الخلايا الميلانينية والميلانوما والخلايا الجذعية الجلدية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق طلاء غشاء مدرج في صواني زراعة الأنسجة بكولاجين بقري معاد تعادله. وتتمثل الخطوة الثانية في تكوين الحجرة الجلدية الخلوية من الخلايا الليفية والكولاجين.

بعد ذلك، يتم تحضير الحيز البشروي من الخلايا الكيراتينية المخلوطة بالخلايا الميلانية أو خلايا الميلانوما. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في حصاد الجلد المعاد بناؤه في اليوم 18، ثم تطعيمه في فأر. وفي النهاية، تُظهر تحليلات الكيمياء النسيجية المناعية والفلورية المناعية للطعم بنية الجلد الطبيعي الذي يحتوي على الخلايا الميلانية، وهجرة وتمايز الخلايا الجذعية الطبيعية، والأنماط الظاهرية للميلانوما المحددة لكل مرحلة.

لقد قمنا بتطوير نموذج إعادة بناء الجلد منذ 20 عاماً لأننا وجدنا في مراحل مبكرة من دراساتنا أن الخلايا الميلانية الطبيعية أو خلايا الميلانوما التي تُزرع في طبق مخبري تتصرف بشكل مختلف تماماً عن الخلايا الموجودة في سياق نسيجي. لذا، يعد نموذج إعادة بناء الجلد مثالياً لنا لمراقبة كيفية انتقال الخلايا من حجرة واحدة في الجلد إلى أي مكان آخر. قم بتبريد خليط الكولاجين للطبقة غير الخلوية المُحضرة مسبقاً على الثلج، ثم أضف 1 mL من المحلول الأصفر القشي إلى كل إدراج في مجموعة من ستة.

يُحضن صينية زراعة الأنسجة ذات الآبار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للهلام بالتصلب. وخلال هذه الفترة، يجب أن يتغير لون المحلول من الأصفر إلى الوردي أثناء تصلب الهلام. يتم فصل الخلايا الليفية البشرية (human fibroblast) من قارورة الزرع باستخدام 0.25% trypsin EDTA، وبعد خمس دقائق، يُضاف DMEM المحتوي على 10% FBS لمعادلة عملية التحلل الإنزيمي.

اجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 200 G في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد تعليق الخلايا بكثافة 4.5 × 10⁵ خلية لكل 1.5 milliliters من وسط DMEM المكمل بـ 10%FBS. بعد ذلك، املأ أنبوب سعة 50 milliliter بمزيج كولاجين الطبقة الخلوية الذي تم تحضيره مسبقاً وضع الأنبوب على الثلج.

أضف 1.5 milliliters من معلق الخلايا الليفية إلى الأنبوب واخلطه جيداً. أضف ثلاثة milliliters من محلول الطبقة الخلوية ذو اللون الأصفر القشي إلى كل قطعة إدراج مغطاة بالطبقة غير الخلوية. ثم قم بحضن صينية زراعة الأنسجة لمدة 45 minutes عند 37 °C في حاضنة زراعة أنسجة تحتوي على 5% carbon dioxide خلال فترة الحضانة.

يجب أن يتغير لون محلول الطبقة الخلوية أيضاً من الأصفر إلى الوردي. بعد تصلب هلام الطبقة العلوية، أضف 2 mL من DMEM المحتوي على 10% FBS إلى داخل الغرزة في وعاء زراعة الأنسجة، و 10 mL إلى خارج الغرزة. يتم تحضين أوعية زراعة الأنسجة لمدة أربعة أيام.

للتحقق من انكماش الهلام في اليوم الرابع من الحضانة، يتم سحب الوسط من داخل وخارج كل قطعة إدراج. أضف 2 mL من وسط الغسيل إلى داخل القطع و 10 mL إلى خارجها لغسل المصل العادي. بعد ذلك، تُحضن الصواني لمدة ساعة واحدة عند 37 °C لتكوين البشرة.

أولاً، يتم عمل تريبسين للخلايا الكيراتينية البشرية. ثم بعد خمس دقائق، استخدم مثبط تريبسين فول الصويا لمعادلة التريبسين بعد تدوير الخلايا المنفصلة عند 200 G لمدة خمس دقائق. أعد تعليق كتلة الخلايا بتركيز 4.17 × 10⁶ خلية لكل milliliter في الوسط الخاص بالجلد.

أعد تكوين الوسط الأول بعد حصاد الخلايا الكيراتينية. قم بمعالجة الخلايا الميلانينية البشرية بالتريبسين على الثلج لمدة تتراوح من دقيقة إلى دقيقتين. بعد ذلك، قم بتعادل التريبسين باستخدام مثبط تريبسين فول الصويا.

بعد ذلك، وبعد تدوير الخلايا تحت نفس الظروف السابقة، أعد تعليق راسب الخلايا الميلانينية (melanocyte pellet) بتركيز 8.3 × 10⁵ خلية لكل مل في وسط skin. قم أيضاً بإعادة تكوين الوسط medium one. بعد ذلك، قم بإزالة وسط الغسيل من داخل وخارج كل قطعة إدراج (insert) في صينية زراعة أنسجة مُعدة لطبقة أدمية (dermal layer).

استبدل وسط الغسيل بإضافة 1.5 ملليلتر من وسط إعادة بناء الجلد إلى داخل كل قطعة إدراج، و10 ملليلتر إلى خارجها. بعد ذلك، اخلط 600 ميكرولتر من معلق خلايا keratinocyte مع 600 ميكرولتر من معلق melanocyte. ثم وزع 200 ميكرولتر من معلق الخلايا المختلط.

أضف السائل قطرة بقطرة إلى الجزء الداخلي من كل قطعة إدخال. قم بحضن صينية زراعة الأنسجة لمدة يومين عند 37 درجة مئوية. بعد حضن الخلايا، قم بشفط وسط إعادة بناء الجلد 1 من كلا الجانبين الداخلي والخارجي لكل قطعة إدخال، ثم أضف 2 mL من وسط إعادة بناء الجلد 2 إلى الجزء الداخلي و10 mL إلى الجزء الخارجي من قطعة الإدخال.

بعد ذلك، يتم تحضين النماذج المعاد بناؤها لمدة يومين إضافيين عند 37 degrees celsius. وبعد انتهاء فترة التحضين الثانية التي استمرت يومين، يتم سحب وسط إعادة بناء الجلد 2 من داخل وخارج كل قطعة غرس. الآن، يتم إضافة 7.5 milliliters من وسط إعادة بناء الجلد 3 إلى الجزء الخارجي فقط من قطع الغرس.

أعد النماذج المعاد بناؤها إلى الحاضنة وقم بتغيير الوسط الغذائي للجلد. استبدل الوسط الغذائي للنماذج المعاد بناؤها (Medium 3) كل يومين حتى اليوم 18. وفي اليوم 18 من الحضن، قم بسحب الأوساط الغذائية من داخل وخارج الأدراج (inserts) في صينية زراعة الأنسجة المحملة بأنسجة الجلد المعاد بناؤها.

أخرج الرقائق من الصينية باستخدام الملقط. قم بقص البنية بما في ذلك مرشح البولي كربونات عن طريق رسم دائرة قريبة من الحافة باستخدام شفرة المشرط. بعد ذلك، ضع البنية الموجودة في المرشح على سطح صلب واقطعها إلى نصفين باستخدام الشفرة.

ضع نصف قطعة إعادة البناء على ورقة خزعة TBS سوداء، ثم ضع الورقة داخل كاسيت أنسجة. انقع الكاسيت بالكامل في formalin بنسبة 10% لأكثر من أربع ساعات. بعد ذلك، ضع الكاسيت في ethanol بنسبة 70% واحفظه في درجة حرارة أربع درجات Celsius حتى يحين وقت معالجة قطعة إعادة البناء من أجل الطمر في البارافين.

ضع النصف الآخر من العينة المعاد بناؤها في محلول sucrose بتركيز 50% عند درجة حرارة 4 °C لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين. بعد ذلك، استبدل محلول sucrose بآخر بتركيز 2 molar، ثم احفظ العينة عند درجة حرارة 4 °C لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين إضافيتين. املأ نصف قالب القاعدة بوسط التجميد المخصص لدرجة حرارة القطع المثالية، أو OCT.

تجنب تكون أي فقاعات. أمسك حافة العينة المعاد بناؤها باستخدام الملقط وأخرجها من محلول السكروز. ضعها على مناديل Kim wipes حتى يتم امتصاص السكروز.

باستخدام الملقط والملعقة المسطحة، انقل العينة المعاد بناؤها إلى القارب فوق الـ OCT. غطِّ الجزء العلوي من العينة المعاد بناؤها بمزيد من الـ OCT حتى يمتلئ القارب تماماً، مع تجنب تكون الفقاعات مرة أخرى.

ضع القالب بالتساوي على الثلج الجاف المسحوق للسماح بتجميد OCT تماماً. بعد ذلك، قم بلف قالب القاعدة والرقاقة foil وتخزينهما في درجة حرارة -70 °C حتى يحين وقت قطعهما باستخدام الميكروتوم المجمد (cryostat). وللتحضير لزراعة إعادة بناء الجلد على فأر، املأ وعاءً بالنيتروجين السائل وأضف 5 mL من DMEM إلى أنبوب سعة 50 mL.

املأ كأساً زجاجياً بـ 600 milliliters من ماء الصنبور وضعه فوق لوح تسخين لتدفئته. بعد ذلك، اختر فأراً من نوع skid hairless outbred أنثى يبلغ من العمر حوالي ستة أسابيع. وبعد تخدير الفأر باستخدام isof fluorine.

استخدم قناعاً أنفياً للحفاظ على التخدير طوال فترة الإجراء. ضع مزلقاً عينيًا معقمًا ووفر دعماً حرارياً لمنع انخفاض درجة حرارة الجسم. بعد ذلك، نظف جلد الفأر باستخدام صبغة البنزوين المركبة ومسحات كحولية تحضيرية.

ضع علامة بخط على ظهر الفأر للحفاظ على نفس الموضع من أجل الخياطة لاحقاً. قم بعمل جرح دائري في ظهر الفأر باستخدام مقص القزحية والملاقط، ثم غطِ منطقة الجرح بإسفنجات شاش معقمة. ضع قطعة الجلد الدائرية المأخوذة من الفأر في أنبوب سعة 50 milliliter يحتوي على DMEM.

اغمر الأنبوب في حاوية نيتروجين سائل حتى تتجمد جميع الأوساط والأنسجة تماماً. بعد ذلك، قم بإذابة تجمد الأنبوب في دورق يحتوي على ماء ساخن حتى يذوب تماماً. كرر إجراء التجميد والإذابة هذا ثلاث مرات.

استخدم شفرة جراحية لفصل إعادة بناء الجلد عن القطعة المضافة. قم بإزالة الغشاء بعناية شديدة، ثم انقل إعادة بناء الجلد إلى الجزء العلوي من سرير جرح الفأر. الآن، ضع جلد الفأر فوق إعادة بناء الجلد.

تأكد من أن الغرزة الأولى تقع فوق العلامة المحددة مسبقاً، وأن الثانية تقع في الأسفل. ثم استخدم غرزتين إضافيتين على جانبي الجلد المعاد ترميمه لتثبيت جلد الفأر. نظف جلد الفأر بعد عملية التطعيم، ثم ضع الفأر في قفص جديد.

في اليوم 18، يتكون البشرة في الجلد المعاد بناؤه من طبقات كيراتينية مصفحة، حيث تترتب الطبقة القاعدية غير المتمايزة والطبقات المتمايزة تتابعياً بشكل عمودي. يتم صبغ مقطع من الأنسجة المعاد بناؤها باستخدام الواسم الميلانيني.

يوضح البروتين S 100، كما تشير الأسهم السوداء، أن الخلايا الميلانينية تصطف في الطبقة القاعدية للبشرة وتتواصل مع العديد من الخلايا الكيراتينية من خلال امتدادات شجيرية. يحتوي الحيز الأدمي على أرومات ليفية منغرسة في مصفوفة من الكولاجين من النوع الأول، بينما يشير الكولاجين 4 المترسب إلى الغشاء القاعدي الذي يفصل البشرة عن الأدمة. وتوضح الأشكال التالية كيفية تطور طبقات متعددة من الخلايا الكيراتينية في البشرة.

عندما يتم دمج الخلايا الجذعية الجلدية الموصومة بنواقل lentiviral GFP مع الخلايا الليفية في مصفوفة من الكولاجين من النوع الأول، فإنها تهاجر إلى البشرة وتتمايز إلى خلايا ميلانية في اليوم الخامس. وبعد استزراع الخلايا الكيراتينية، تبدأ الخلايا المفردة في الهجرة خارج الكرات.

لاحظ أن البشرة لا تزال تتكون من طبقة واحدة. وفي اليوم الثامن، تصل بضع خلايا إلى الواجهة بين البشرة والأدمة.

بحلول اليوم العاشر، تكون الخلايا الموجبة لـ GFP مصطفة بإحكام عند موقع الغشاء القاعدي كما هو موضح هنا. وتعبر الخلايا الموجبة لـ GFP المهاجرة في البشرة عن مؤشر الخلايا الميلانية HMB 45. وعند دمج سلالات خلايا الميلانوما في مراحل مختلفة ضمن عمليات إعادة بناء الجلد، فإن سلوك الخلايا يعكس خصائصها الحيوية (in vivo).

تظهر في هذا الشكل الخلايا الميلانينية الطبيعية وخلايا الميلانوما التي نمت في مزارع ثنائية الأبعاد (2D). يتم التحكم بدقة في موقع ومعدل نمو الخلايا الميلانينية الطبيعية في إعادة بناء الجلد كما هو موضح هنا؛ ففي طور النمو الشعاعي، تتكاثر الأورام الميلانينية الأولية بشكل أساسي في البشرة، بينما تنمو أورام طور النمو العمودي بشكل غازٍ إلى الأدمة كما يظهر في هذا الشكل. وأخيراً، يمكن رؤية الطريقة التي تغزو بها الأورام الميلانينية النقيلية عمق الأدمة بشراسة هنا.

توفر دراساتنا على الجلد الطبيعي الأساس لمعرفة أفضل بتطور الورم الميلانيني وتطوره.